1.本发明属于养殖鱼类寄生虫检测技术领域，尤其涉及一种用于鲑鳟鱼养殖的寄生虫快速酶免疫检测方法及试剂盒。
背景技术：
2.鲑鳟鱼类是典型的冷水性鱼类，经济价值高，是世界重要经济养殖鱼类之一。然而，随着鲑鳟鱼养殖产量的攀升，养殖密度增大、养殖环境恶化造成的鲑鳟鱼类寄生虫病的发生和危害也日趋频繁和严重，制约了鲑鳟鱼养殖产业的健康发展。鲑鳟鱼常见的危害较为严重的寄生虫主要包括三代虫、小瓜虫、车轮虫。这些寄生虫生活史简单、繁殖速度快，大多寄生在鱼体表面及体内的各种组织器官上，导致鱼体生长缓慢、抵抗力下降，引起鱼体损伤并造成死亡。
3.传统的水产养殖寄生虫病的寄生虫学诊断需要对患病鱼体的皮肤、粘膜组织或病变组织活检打孔刮出，涂片培养后在显微镜下观察虫体图像进行鉴别。由于寄生虫虫体较小，容易漏检，对检测熟练程度要求较高，普通养殖人员不易操作，极易误诊。基于pcr技术建立的分子检测方法只能在实验室中进行，所需仪器昂贵，对检测人员要求较高，且检测效率低，不能及时有效的指导鲑鳟鱼养殖场寄生虫病的防治。
4.鲑鳟鱼养殖领域目前亟需一种能够在养殖现场进行检测并快速提供检测结果的、廉价高效的寄生虫检测方法。
技术实现要素：
5.为解决现有鲑鳟鱼领域寄生虫检测方法特异性差、效率低、成本高的问题，本发明提供了一种用于鲑鳟鱼养殖的寄生虫快速酶免疫检测方法及试剂盒。
6.本发明的技术方案：
7.一种用于鲑鳟鱼养殖的寄生虫快速酶免疫检测试剂盒，包括寄生虫特异性抗原包被板、含有0.5％吐温的0.1m磷酸盐缓冲液、酶标抗原溶液、30％过氧化氢溶液、四甲基联苯胺显色剂、2n硫酸溶液、阳性对照血清和阴性对照血清。
8.进一步的，所述寄生虫特异性抗原包被板是将寄生虫虫体可溶性抗原包被于96孔板。
9.进一步的，所述寄生虫特异性抗原包被板的具体制备方法为：用ph为9.5的0.05m碳酸盐缓冲液将寄生虫虫体可溶性抗原溶液稀释至蛋白浓度为0.5mg/ml，向96孔板每个孔中加入100μl稀释后的寄生虫虫体可溶性抗原溶液，密封孔板并置于4℃下保存18h；在每个孔中加入含有5wt％普通山羊血清的磷酸盐缓冲溶液300μl，4℃放置8h去除未吸附的抗原；去除孔中剩余液体，真空冻干、真空封装后置于4℃保存备用。
10.进一步的，所述寄生虫虫体可溶性抗原的制备方法为显微镜下将寄生于鱼体的寄生虫取下，放入生理盐水中，虫体密度达到106～107/ml时，4℃下离心收集虫体，用ph7.0的pbs缓冲液清洗虫体3次，清洗后的虫体按虫体压积量加5倍体积的ph7.0的pbs缓冲液，在液
氮和45℃水浴中反复冻融10次后在冰浴中超声粉碎，4℃离心，上清即为寄生虫虫体可溶性抗原。
11.进一步的，所述寄生虫为三代虫、小瓜虫、指环虫、复口吸虫和/或车轮虫。
12.进一步的，所述酶标抗原溶液的制备方法为取寄生虫虫体可溶性抗原10mg，加n,n
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二甲基甲酰胺200μl溶解抗原得到ⅰ液；取辣根过氧化物酶100mg，加蒸馏水溶解，加入edc10mg并搅拌30min，得到ⅱ液；将ⅰ液滴加到ⅱ液中，4℃避光反应18h，将反应液在4℃、ph 7.0的磷酸盐缓冲溶液中透析3天，得到酶标抗原溶液。
13.进一步的，所述四甲基联苯胺显色剂为2mg/ml四甲基联苯胺无水乙醇溶液。
14.进一步的，阳性对照血清为被所检测寄生虫感染的鲑鳟鱼血清的灭活样本，含有0.01wt％的硫柳汞；阴性对照血清为健康鲑鳟鱼血清样本，含有0.01wt％的硫柳汞。
15.一种本发明检测试剂盒用于鲑鳟鱼养殖的寄生虫快速酶免疫检测方法，包括如下步骤：
16.步骤1、取待测鲑鳟鱼血液样本制成待测血清，待测血清、阳性对照血清和阴性对照血清分别用含有0.5％吐温的0.1m磷酸盐缓冲液按体积比1：50稀释；
17.步骤2、稀释后的待测血清、阳性对照血清和阴性对照血清分别在包被有特异性抗原的96孔板上加样，每孔加100μl，加样后静置10min，去除孔中溶液，滴加含有0.5％吐温的0.1m磷酸盐缓冲液一滴，用蒸馏水洗涤3次，去除孔中溶液；
18.步骤3、向孔中滴加入酶标抗原溶液2滴，37℃反应10min，去除孔中溶液，滴加含有0.5％吐温的0.1m磷酸盐缓冲液一滴，用蒸馏水洗涤3次，去除孔中溶液；
19.步骤4、向孔中滴加30％过氧化氢溶液和四甲基联苯胺显色剂各1滴，混匀后室温下暗处显色3～5min，待阴性对照孔出现蓝色时，向各孔中滴加2n硫酸溶液1滴终止显色反应；
20.步骤5、待测血清检测孔颜色接近阴性对照孔颜色时，检测结果为阴性，即鲑鳟鱼待测血清中没有与检测孔包被的虫体抗原相对应的寄生虫的特异性抗体，即没有感染该种寄生虫；待测血清检测孔颜色明显深于阴性对照孔颜色时，检测结果为阳性，即鲑鳟鱼待测血清中含有与检测孔包被的虫体抗原相对应的寄生虫的特异性抗体，即感染了该种寄生虫。
21.进一步的，步骤2加样时还设空白对照孔，孔中不加血清样本，只加100μl含有0.5％吐温的0.1m磷酸盐缓冲液，后续步骤2
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步骤5的操作与待测血清孔、阳性对照血清孔和阴性对照血清孔操作相同。
22.本发明的有益效果：
23.本发明提供的用于鲑鳟鱼养殖的寄生虫快速酶免疫检测方法及试剂盒，针对多种鲑鳟鱼养殖中常见的寄生虫具有良好的特异性和灵敏度，能够快速、高效、准确鉴定出鱼体感染的寄生虫种类，准确指导用药。
24.本发明提供的酶免疫检测试剂盒所用寄生虫虫体可溶性抗原、酶标抗原制备方法简单，，所用其他试剂也易于获得，检测试剂盒成本低廉，操作简单，对场地和操作人员要求不高，适合规模化鲑鳟鱼养殖场在现场进行寄生虫病的快速检测、准确查明寄生虫物种、分析寄生虫种类、感染情况和不同养殖环境和养殖模式下的感染风险，为鲑鳟鱼产业的健康发展提供重要技术支持。
具体实施方式
25.下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置，若未特别指明，本发明实施例中所用的原料等均可市售获得；若未具体指明，本发明实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
26.实施例1
27.本实施例提供了一种鲑鳟鱼养殖的三代虫快速酶免疫检测试剂盒。
28.本实施例检测试剂盒包括：三代虫特异性抗原包被板、含有0.5％吐温的0.1m磷酸盐缓冲液、酶标抗原溶液、30％过氧化氢溶液、2mg/ml四甲基联苯胺无水乙醇溶液、2n硫酸溶液、阳性对照血清和阴性对照血清。
29.本实施例中三代虫特异性抗原包被板的制备步骤如下：
30.步骤一、制备三代虫虫体可溶性抗原：显微镜下将寄生于鱼体的三代虫取下，放入生理盐水中，当虫体密度达到106～107/ml时，4℃下离心收集虫体，用ph7.0的pbs缓冲液清洗虫体3次，清洗后的虫体按虫体压积量加5倍体积的ph7.0的pbs缓冲液，在液氮和45℃水浴中反复冻融10次后在冰浴中超声粉碎，4℃离心，上清即为三代虫虫体可溶性抗原；
31.步骤二、制备三代虫特异性抗原包被板：用ph为9.5的0.05m碳酸盐缓冲液将三代虫虫体可溶性抗原溶液稀释至蛋白浓度为0.5mg/ml，向96孔板每个孔中加入100μl稀释后的寄生虫虫体可溶性抗原溶液，密封孔板并置于4℃下保存18h；在每个孔中加入含有5wt％普通山羊血清的磷酸盐缓冲溶液300μl，4℃放置8h去除未吸附的抗原；去除孔中剩余液体，真空冻干、真空封装后置于4℃保存备用。
32.本实施例中酶标抗原溶液的制备方法为将三代虫虫体可溶性抗原溶液冻干得到三代虫虫体可溶性抗原，取三代虫虫体可溶性抗原10mg，加n,n
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二甲基甲酰胺200μl溶解抗原得到ⅰ液；取辣根过氧化物酶100mg，加蒸馏水溶解，加入edc10mg并搅拌30min，得到ⅱ液；将ⅰ液滴加到ⅱ液中，4℃避光反应18h，将反应液在4℃、ph 7.0的磷酸盐缓冲溶液中透析3天，得到酶标抗原溶液。
33.本实施例中阳性对照血清为被三代虫感染的鲑鳟鱼的血清的灭活样本，含有0.01wt％的硫柳汞；阴性对照血清为健康鲑鳟鱼血清样本，含有0.01wt％的硫柳汞。
34.实施例2
35.本实施例提供了一种鲑鳟鱼养殖的小瓜虫快速酶免疫检测试剂盒。
36.本实施例检测试剂盒包括：小瓜虫特异性抗原包被板、含有0.5％吐温的0.1m磷酸盐缓冲液、酶标抗原溶液、30％过氧化氢溶液、2mg/ml四甲基联苯胺无水乙醇溶液、2n硫酸溶液、阳性对照血清和阴性对照血清。
37.本实施例中小瓜虫特异性抗原包被板的制备步骤如下：
38.步骤一、制备小瓜虫虫体可溶性抗原：显微镜下将寄生于鱼体的小瓜虫取下，放入生理盐水中，虫体密度达到106～107/ml时，4℃下离心收集虫体，用ph7.0的pbs缓冲液清洗虫体3次，清洗后的虫体按虫体压积量加5倍体积的ph7.0的pbs缓冲液，在液氮和45℃水浴中反复冻融10次后在冰浴中超声粉碎，4℃离心，上清即为小瓜虫虫体可溶性抗原；
39.步骤二、制备小瓜虫特异性抗原包被板：用ph为9.5的0.05m碳酸盐缓冲液将小瓜
虫虫体可溶性抗原溶液稀释至蛋白浓度为0.5mg/ml，向96孔板每个孔中加入100μl稀释后的寄生虫虫体可溶性抗原溶液，密封孔板并置于4℃下保存18h；在每个孔中加入含有5wt％普通山羊血清的磷酸盐缓冲溶液300μl，4℃放置8h去除未吸附的抗原；去除孔中剩余液体，真空冻干、真空封装后置于4℃保存备用。
40.本实施例中酶标抗原溶液的制备方法为将小瓜虫虫体可溶性抗原溶液冻干得到小瓜虫虫体可溶性抗原，取小瓜虫虫体可溶性抗原10mg，加n,n
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二甲基甲酰胺200μl溶解抗原得到ⅰ液；取辣根过氧化物酶100mg，加蒸馏水溶解，加入edc10mg并搅拌30min，得到ⅱ液；将ⅰ液滴加到ⅱ液中，4℃避光反应18h，将反应液在4℃、ph 7.0的磷酸盐缓冲溶液中透析3天，得到酶标抗原溶液。
41.本实施例中阳性对照血清为被小瓜虫感染的鲑鳟鱼的血清的灭活样本，含有0.01wt％的硫柳汞；阴性对照血清为健康鲑鳟鱼血清样本，含有0.01wt％的硫柳汞。
42.实施例3
43.本实施例提供了一种鲑鳟鱼养殖的车轮虫快速酶免疫检测试剂盒。
44.本实施例检测试剂盒包括：车轮虫特异性抗原包被板、含有0.5％吐温的0.1m磷酸盐缓冲液、酶标抗原溶液、30％过氧化氢溶液、2mg/ml四甲基联苯胺无水乙醇溶液、2n硫酸溶液、阳性对照血清和阴性对照血清。
45.本实施例中车轮虫特异性抗原包被板的制备步骤如下：
46.步骤一、制备车轮虫虫体可溶性抗原：显微镜下将寄生于鱼体的车轮虫取下，放入生理盐水中，虫体密度达到106～107/ml时，4℃下离心收集虫体，用ph7.0的pbs缓冲液清洗虫体3次，清洗后的虫体按虫体压积量加5倍体积的ph7.0的pbs缓冲液，在液氮和45℃水浴中反复冻融10次后在冰浴中超声粉碎，4℃离心，上清即为车轮虫虫体可溶性抗原；
47.步骤二、制备车轮虫特异性抗原包被板：用ph为9.5的0.05m碳酸盐缓冲液将车轮虫虫体可溶性抗原溶液稀释至蛋白浓度为0.5mg/ml，向96孔板每个孔中加入100μl稀释后的寄生虫虫体可溶性抗原溶液，密封孔板并置于4℃下保存18h；在每个孔中加入含有5wt％普通山羊血清的磷酸盐缓冲溶液300μl，4℃放置8h去除未吸附的抗原；去除孔中剩余液体，真空冻干、真空封装后置于4℃保存备用。
48.本实施例中酶标抗原溶液的制备方法为将车轮虫虫体可溶性抗原溶液冻干得到车轮虫虫体可溶性抗原，取车轮虫虫体可溶性抗原10mg，加n,n
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二甲基甲酰胺200μl溶解抗原得到ⅰ液；取辣根过氧化物酶100mg，加蒸馏水溶解，加入edc10mg并搅拌30min，得到ⅱ液；将ⅰ液滴加到ⅱ液中，4℃避光反应18h，将反应液在4℃、ph 7.0的磷酸盐缓冲溶液中透析3天，得到酶标抗原溶液。
49.本实施例中阳性对照血清为被车轮虫感染的鲑鳟鱼的血清的灭活样本，含有0.01wt％的硫柳汞；阴性对照血清为健康鲑鳟鱼血清样本，含有0.01wt％的硫柳汞。
50.实施例4
51.本实施例提供了一种鲑鳟鱼养殖的指环虫快速酶免疫检测试剂盒。
52.本实施例检测试剂盒包括：指环虫特异性抗原包被板、含有0.5％吐温的0.1m磷酸盐缓冲液、酶标抗原溶液、30％过氧化氢溶液、2mg/ml四甲基联苯胺无水乙醇溶液、2n硫酸溶液、阳性对照血清和阴性对照血清。
53.本实施例中指环虫特异性抗原包被板的制备步骤如下：
54.步骤一、制备指环虫虫体可溶性抗原：显微镜下将寄生于鱼体的指环虫取下，放入生理盐水中，虫体密度达到106～107/ml时，4℃下离心收集虫体，用ph7.0的pbs缓冲液清洗虫体3次，清洗后的虫体按虫体压积量加5倍体积的ph7.0的pbs缓冲液，在液氮和45℃水浴中反复冻融10次后在冰浴中超声粉碎，4℃离心，上清即为指环虫虫体可溶性抗原；
55.步骤二、制备指环虫特异性抗原包被板：用ph为9.5的0.05m碳酸盐缓冲液将指环虫虫体可溶性抗原溶液稀释至蛋白浓度为0.5mg/ml，向96孔板每个孔中加入100μl稀释后的寄生虫虫体可溶性抗原溶液，密封孔板并置于4℃下保存18h；在每个孔中加入含有5wt％普通山羊血清的磷酸盐缓冲溶液300μl，4℃放置8h去除未吸附的抗原；去除孔中剩余液体，真空冻干、真空封装后置于4℃保存备用。
56.本实施例中酶标抗原溶液的制备方法为将指环虫虫体可溶性抗原溶液冻干得到指环虫虫体可溶性抗原，取指环虫虫体可溶性抗原10mg，加n,n
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二甲基甲酰胺200μl溶解抗原得到ⅰ液；取辣根过氧化物酶100mg，加蒸馏水溶解，加入edc10mg并搅拌30min，得到ⅱ液；将ⅰ液滴加到ⅱ液中，4℃避光反应18h，将反应液在4℃、ph 7.0的磷酸盐缓冲溶液中透析3天，得到酶标抗原溶液。
57.本实施例中阳性对照血清为被指环虫感染的鲑鳟鱼的血清的灭活样本，含有0.01wt％的硫柳汞；阴性对照血清为健康鲑鳟鱼血清样本，含有0.01wt％的硫柳汞。
58.实施例5
59.本实施例提供了一种鲑鳟鱼养殖的复口吸虫快速酶免疫检测试剂盒。
60.本实施例检测试剂盒包括：复口吸虫特异性抗原包被板、含有0.5％吐温的0.1m磷酸盐缓冲液、酶标抗原溶液、30％过氧化氢溶液、2mg/ml四甲基联苯胺无水乙醇溶液、2n硫酸溶液、阳性对照血清和阴性对照血清。
61.本实施例中复口吸虫特异性抗原包被板的制备步骤如下：
62.步骤一、制备复口吸虫虫体可溶性抗原：显微镜下将寄生于鱼体的复口吸虫取下，放入生理盐水中，虫体密度达到106～107/ml时，4℃下离心收集虫体，用ph7.0的pbs缓冲液清洗虫体3次，清洗后的虫体按虫体压积量加5倍体积的ph7.0的pbs缓冲液，在液氮和45℃水浴中反复冻融10次后在冰浴中超声粉碎，4℃离心，上清即为复口吸虫虫体可溶性抗原；
63.步骤二、制备复口吸虫特异性抗原包被板：用ph为9.5的0.05m碳酸盐缓冲液将复口吸虫虫体可溶性抗原溶液稀释至蛋白浓度为0.5mg/ml，向96孔板每个孔中加入100μl稀释后的寄生虫虫体可溶性抗原溶液，密封孔板并置于4℃下保存18h；在每个孔中加入含有5wt％普通山羊血清的磷酸盐缓冲溶液300μl，4℃放置8h去除未吸附的抗原；去除孔中剩余液体，真空冻干、真空封装后置于4℃保存备用。
64.本实施例中酶标抗原溶液的制备方法为将复口吸虫虫体可溶性抗原溶液冻干得到复口吸虫虫体可溶性抗原，取复口吸虫虫体可溶性抗原10mg，加n,n
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二甲基甲酰胺200μl溶解抗原得到ⅰ液；取辣根过氧化物酶100mg，加蒸馏水溶解，加入edc10mg并搅拌30min，得到ⅱ液；将ⅰ液滴加到ⅱ液中，4℃避光反应18h，将反应液在4℃、ph 7.0的磷酸盐缓冲溶液中透析3天，得到酶标抗原溶液。
65.本实施例中阳性对照血清为被复口吸虫感染的鲑鳟鱼的血清的灭活样本，含有0.01wt％的硫柳汞；阴性对照血清为健康鲑鳟鱼血清样本，含有0.01wt％的硫柳汞。
66.实施例6
67.本实施例提供了一种同时检测鲑鳟鱼养殖的三代虫、小瓜虫和车轮虫快速酶免疫检测试剂盒。
68.本实施例检测试剂盒包括：三代虫特异性抗原、小瓜虫特异性抗原和车轮虫特异性抗原包被板、含有0.5％吐温的0.1m磷酸盐缓冲液、三代虫酶标抗原溶液、小瓜虫酶标抗原溶液、车轮虫酶标抗原溶液、30％过氧化氢溶液、2mg/ml四甲基联苯胺无水乙醇溶液、2n硫酸溶液、三代虫阳性对照血清、小瓜虫阳性对照血清、车轮虫阳性对照血清和阴性对照血清。
69.本实施例中车轮虫特异性抗原包被板的制备步骤如下：
70.步骤一、制备三代虫虫体可溶性抗原：显微镜下将寄生于鱼体的三代虫取下，放入生理盐水中，虫体密度达到106～107/ml时，4℃下离心收集虫体，用ph7.0的pbs缓冲液清洗虫体3次，清洗后的虫体按虫体压积量加5倍体积的ph7.0的pbs缓冲液，在液氮和45℃水浴中反复冻融10次后在冰浴中超声粉碎，4℃离心，上清即为三代虫虫体可溶性抗原；
71.制备小瓜虫虫体可溶性抗原：显微镜下将寄生于鱼体的小瓜虫取下，放入生理盐水中，虫体密度达到106～107/ml时，4℃下离心收集虫体，用ph7.0的pbs缓冲液清洗虫体3次，清洗后的虫体按虫体压积量加5倍体积的ph7.0的pbs缓冲液，在液氮和45℃水浴中反复冻融10次后在冰浴中超声粉碎，4℃离心，上清即为小瓜虫虫体可溶性抗原；
72.制备车轮虫虫体可溶性抗原：显微镜下将寄生于鱼体的车轮虫取下，放入生理盐水中，虫体密度达到106～107/ml时，4℃下离心收集虫体，用ph7.0的pbs缓冲液清洗虫体3次，清洗后的虫体按虫体压积量加5倍体积的ph7.0的pbs缓冲液，在液氮和45℃水浴中反复冻融10次后在冰浴中超声粉碎，4℃离心，上清即为车轮虫虫体可溶性抗原；
73.步骤二、制备三代虫特异性抗原、小瓜虫特异性抗原和车轮虫特异性抗原包被板：
74.用ph为9.5的0.05m碳酸盐缓冲液分别将三代虫虫体可溶性抗原、小瓜虫特异性抗原和车轮虫虫体可溶性抗原溶液均稀释至蛋白浓度为0.5mg/ml，将96孔板分为三代虫检测孔区域、小瓜虫检测孔区域和车轮虫检测孔区域，分别在三个检测孔区域的孔中加入其相对应的寄生虫虫体可溶性抗原溶液，每孔加入100μl，密封孔板并置于4℃下保存18h；在每个孔中加入含有5wt％普通山羊血清的磷酸盐缓冲溶液300μl，4℃放置8h去除未吸附的抗原；去除孔中剩余液体，真空冻干、真空封装后置于4℃保存备用。
75.本实施例中酶标抗原溶液的制备方法：
76.三代虫酶标抗原溶液：将三代虫虫体可溶性抗原溶液冻干得到三代虫虫体可溶性抗原，取三代虫虫体可溶性抗原10mg，加n,n
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二甲基甲酰胺200μl溶解抗原得到ⅰ液；取辣根过氧化物酶100mg，加蒸馏水溶解，加入edc10mg并搅拌30min，得到ⅱ液；将ⅰ液滴加到ⅱ液中，4℃避光反应18h，将反应液在4℃、ph 7.0的磷酸盐缓冲溶液中透析3天，得到三代虫酶标抗原溶液。
77.小瓜虫酶标抗原溶液：将小瓜虫虫体可溶性抗原溶液冻干得到小瓜虫虫体可溶性抗原，取小瓜虫虫体可溶性抗原10mg，加n,n
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二甲基甲酰胺200μl溶解抗原得到ⅰ液；取辣根过氧化物酶100mg，加蒸馏水溶解，加入edc10mg并搅拌30min，得到ⅱ液；将ⅰ液滴加到ⅱ液中，4℃避光反应18h，将反应液在4℃、ph 7.0的磷酸盐缓冲溶液中透析3天，得到小瓜虫酶标抗原溶液。
78.车轮虫酶标抗原溶液：将车轮虫虫体可溶性抗原溶液冻干得到车轮虫虫体可溶性
抗原，取车轮虫虫体可溶性抗原10mg，加n,n
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二甲基甲酰胺200μl溶解抗原得到ⅰ液；取辣根过氧化物酶100mg，加蒸馏水溶解，加入edc10mg并搅拌30min，得到ⅱ液；将ⅰ液滴加到ⅱ液中，4℃避光反应18h，将反应液在4℃、ph 7.0的磷酸盐缓冲溶液中透析3天，得到车轮虫酶标抗原溶液。
79.本实施例中三代虫阳性对照血清为被三代虫感染的鲑鳟鱼的血清的灭活样本、小瓜虫阳性对照血清为被小瓜虫感染的鲑鳟鱼的血清的灭活样本、车轮虫阳性对照血清为被车轮虫感染的鲑鳟鱼的血清的灭活样本，均含有0.01wt％的硫柳汞；阴性对照血清为健康鲑鳟鱼血清样本，含有0.01wt％的硫柳汞。
80.实施例7
81.本实施例提供了一种同时检测鲑鳟鱼养殖的三代虫、小瓜虫、指环虫、复口吸虫和车轮虫快速酶免疫检测试剂盒。
82.本实施例检测试剂盒包括：三代虫特异性抗原、小瓜虫特异性抗原、指环虫特异性抗原、复口吸虫特异性抗原和车轮虫特异性抗原包被板、含有0.5％吐温的0.1m磷酸盐缓冲液、三代虫酶标抗原溶液、小瓜虫酶标抗原溶液、指环虫酶标抗原溶液、复口吸虫酶标抗原溶液、车轮虫酶标抗原溶液、30％过氧化氢溶液、2mg/ml四甲基联苯胺无水乙醇溶液、2n硫酸溶液、三代虫阳性对照血清、小瓜虫阳性对照血清、指环虫阳性对照血清、复口吸虫阳性对照血清、车轮虫阳性对照血清和阴性对照血清。
83.本实施例中车轮虫特异性抗原包被板的制备步骤如下：
84.步骤一、制备三代虫虫体可溶性抗原：显微镜下将寄生于鱼体的三代虫取下，放入生理盐水中，虫体密度达到106～107/ml时，4℃下离心收集虫体，用ph7.0的pbs缓冲液清洗虫体3次，清洗后的虫体按虫体压积量加5倍体积的ph7.0的pbs缓冲液，在液氮和45℃水浴中反复冻融10次后在冰浴中超声粉碎，4℃离心，上清即为三代虫虫体可溶性抗原；
85.制备小瓜虫虫体可溶性抗原：显微镜下将寄生于鱼体的小瓜虫取下，放入生理盐水中，虫体密度达到106～107/ml时，4℃下离心收集虫体，用ph7.0的pbs缓冲液清洗虫体3次，清洗后的虫体按虫体压积量加5倍体积的ph7.0的pbs缓冲液，在液氮和45℃水浴中反复冻融10次后在冰浴中超声粉碎，4℃离心，上清即为小瓜虫虫体可溶性抗原；
86.制备指环虫虫体可溶性抗原：显微镜下将寄生于鱼体的指环虫取下，放入生理盐水中，虫体密度达到106～107/ml时，4℃下离心收集虫体，用ph7.0的pbs缓冲液清洗虫体3次，清洗后的虫体按虫体压积量加5倍体积的ph7.0的pbs缓冲液，在液氮和45℃水浴中反复冻融10次后在冰浴中超声粉碎，4℃离心，上清即为指环虫虫体可溶性抗原；
87.制备复口吸虫虫体可溶性抗原：显微镜下将寄生于鱼体的复口吸虫取下，放入生理盐水中，虫体密度达到106～107/ml时，4℃下离心收集虫体，用ph7.0的pbs缓冲液清洗虫体3次，清洗后的虫体按虫体压积量加5倍体积的ph7.0的pbs缓冲液，在液氮和45℃水浴中反复冻融10次后在冰浴中超声粉碎，4℃离心，上清即为复口吸虫虫体可溶性抗原；
88.制备车轮虫虫体可溶性抗原：显微镜下将寄生于鱼体的车轮虫取下，放入生理盐水中，虫体密度达到106～107/ml时，4℃下离心收集虫体，用ph7.0的pbs缓冲液清洗虫体3次，清洗后的虫体按虫体压积量加5倍体积的ph7.0的pbs缓冲液，在液氮和45℃水浴中反复冻融10次后在冰浴中超声粉碎，4℃离心，上清即为车轮虫虫体可溶性抗原；
89.步骤二、制备三代虫特异性抗原、小瓜虫特异性抗原、指环虫特异性抗原、复口吸
虫特异性抗原和车轮虫特异性抗原包被板：
90.用ph为9.5的0.05m碳酸盐缓冲液分别将三代虫虫体可溶性抗原、小瓜虫特异性抗原、指环虫特异性抗原、复口吸虫特异性抗原和车轮虫虫体可溶性抗原溶液均稀释至蛋白浓度为0.5mg/ml，将96孔板分为三代虫检测孔区域、小瓜虫检测孔区域、指环虫检测孔区域、复口吸虫检测孔区域和车轮虫检测孔区域，分别在五个检测孔区域的孔中加入其相对应的寄生虫虫体可溶性抗原溶液，每孔加入100μl，密封孔板并置于4℃下保存18h；在每个孔中加入含有5wt％普通山羊血清的磷酸盐缓冲溶液300μl，4℃放置8h去除未吸附的抗原；去除孔中剩余液体，真空冻干、真空封装后置于4℃保存备用。
91.本实施例中酶标抗原溶液的制备方法：
92.三代虫酶标抗原溶液：将三代虫虫体可溶性抗原溶液冻干得到三代虫虫体可溶性抗原，取三代虫虫体可溶性抗原10mg，加n,n
‑
二甲基甲酰胺200μl溶解抗原得到ⅰ液；取辣根过氧化物酶100mg，加蒸馏水溶解，加入edc10mg并搅拌30min，得到ⅱ液；将ⅰ液滴加到ⅱ液中，4℃避光反应18h，将反应液在4℃、ph 7.0的磷酸盐缓冲溶液中透析3天，得到三代虫酶标抗原溶液。
93.小瓜虫酶标抗原溶液：将小瓜虫虫体可溶性抗原溶液冻干得到小瓜虫虫体可溶性抗原，取小瓜虫虫体可溶性抗原10mg，加n,n
‑
二甲基甲酰胺200μl溶解抗原得到ⅰ液；取辣根过氧化物酶100mg，加蒸馏水溶解，加入edc10mg并搅拌30min，得到ⅱ液；将ⅰ液滴加到ⅱ液中，4℃避光反应18h，将反应液在4℃、ph 7.0的磷酸盐缓冲溶液中透析3天，得到小瓜虫酶标抗原溶液。
94.指环虫酶标抗原溶液：将指环虫虫体可溶性抗原溶液冻干得到指环虫虫体可溶性抗原，取指环虫虫体可溶性抗原10mg，加n,n
‑
二甲基甲酰胺200μl溶解抗原得到ⅰ液；取辣根过氧化物酶100mg，加蒸馏水溶解，加入edc10mg并搅拌30min，得到ⅱ液；将ⅰ液滴加到ⅱ液中，4℃避光反应18h，将反应液在4℃、ph 7.0的磷酸盐缓冲溶液中透析3天，得到指环虫酶标抗原溶液。
95.复口吸虫酶标抗原溶液：将复口吸虫虫体可溶性抗原溶液冻干得到复口吸虫虫体可溶性抗原，取复口吸虫虫体可溶性抗原10mg，加n,n
‑
二甲基甲酰胺200μl溶解抗原得到ⅰ液；取辣根过氧化物酶100mg，加蒸馏水溶解，加入edc10mg并搅拌30min，得到ⅱ液；将ⅰ液滴加到ⅱ液中，4℃避光反应18h，将反应液在4℃、ph 7.0的磷酸盐缓冲溶液中透析3天，得到复口吸虫酶标抗原溶液。
96.车轮虫酶标抗原溶液：将车轮虫虫体可溶性抗原溶液冻干得到车轮虫虫体可溶性抗原，取车轮虫虫体可溶性抗原10mg，加n,n
‑
二甲基甲酰胺200μl溶解抗原得到ⅰ液；取辣根过氧化物酶100mg，加蒸馏水溶解，加入edc10mg并搅拌30min，得到ⅱ液；将ⅰ液滴加到ⅱ液中，4℃避光反应18h，将反应液在4℃、ph 7.0的磷酸盐缓冲溶液中透析3天，得到车轮虫酶标抗原溶液。
97.本实施例中三代虫阳性对照血清为被三代虫感染的鲑鳟鱼的血清的灭活样本、小瓜虫阳性对照血清为被小瓜虫感染的鲑鳟鱼的血清的灭活样本、指环虫阳性对照血清为被指环虫感染的鲑鳟鱼的血清的灭活样本、复口吸虫阳性对照血清为被复口吸虫感染的鲑鳟鱼的血清的灭活样本、车轮虫阳性对照血清为被车轮虫感染的鲑鳟鱼的血清的灭活样本，均含有0.01wt％的硫柳汞；阴性对照血清为健康鲑鳟鱼血清样本，含有0.01wt％的硫柳汞。
98.实施例8
99.本实施例利用实施例1提供的三代虫快速酶免疫检测试剂盒、实施例2提供的小瓜虫快速酶免疫检测试剂盒和实施例3提供的车轮虫快速酶免疫检测试剂盒对养殖鲑鳟鱼进行检测，具体检测方法步骤如下：
100.步骤1、取待测鲑鳟鱼血液样本制成待测血清，待测血清、阳性对照血清和阴性对照血清分别用含有0.5％吐温的0.1m磷酸盐缓冲液按体积比1：50稀释；
101.步骤2、稀释后的待测血清、阳性对照血清和阴性对照血清分别在包被有三代虫特异性抗原的96孔板、包被有小瓜虫特异性抗原的96孔板和包被有车轮虫特异性抗原的96孔板上加样，每孔加100μl，加样后静置10min；各96孔板上均设空白对照孔，孔中不加血清样本，只加100μl含有0.5％吐温的0.1m磷酸盐缓冲液，空白对照孔用于验证显色反应的准确性，去除孔中溶液，滴加含有0.5％吐温的0.1m磷酸盐缓冲液一滴，用蒸馏水洗涤3次，去除孔中溶液；
102.步骤3、向包被有三代虫特异性抗原的96孔板的孔中滴加入三代虫酶标抗原溶液2滴，向包被有小瓜虫特异性抗原的96孔板的孔中滴加入小瓜虫酶标抗原溶液2滴，向包被有车轮虫特异性抗原的96孔板的孔中滴加入车轮虫酶标抗原溶液2滴，37℃反应10min，去除孔中溶液，滴加含有0.5％吐温的0.1m磷酸盐缓冲液一滴，用蒸馏水洗涤3次，去除孔中溶液；
103.步骤4、向各孔中滴加30％过氧化氢溶液和四甲基联苯胺显色剂各1滴，混匀后室温下暗处显色3～5min，待阴性对照孔出现蓝色时，向各孔中滴加2n硫酸溶液1滴终止显色反应；
104.步骤5、观察待测血清检测孔颜色，颜色接近阴性对照孔颜色时，检测结果为阴性，即鲑鳟鱼待测血清中没有与检测孔包被的虫体抗原相对应的寄生虫的特异性抗体，即没有感染该种寄生虫；待测血清检测孔颜色明显深于阴性对照孔颜色时，检测结果为阳性，即鲑鳟鱼待测血清中含有与检测孔包被的虫体抗原相对应的寄生虫的特异性抗体，即感染了该种寄生虫。
105.实施例9
106.本实施例利用实施例7提供的同时检测鲑鳟鱼养殖的三代虫、小瓜虫、指环虫、复口吸虫和车轮虫快速酶免疫检测试剂盒对养殖鲑鳟鱼进行检测，具体检测方法步骤如下：
107.步骤1、选取养殖过程中出现典型病症的鲑鳟鱼，从鱼鳃部取待测鲑鳟鱼血液样本制成待测血清，待测血清、三代虫阳性对照血清、小瓜虫阳性对照血清、车轮虫阳性对照血清和阴性对照血清分别用含有0.5％吐温的0.1m磷酸盐缓冲液按体积比1：50稀释；
108.步骤2、稀释后的待测血清、三代虫阳性对照血清、小瓜虫阳性对照血清、指环虫阳性对照血清、复口吸虫阳性对照血清、车轮虫阳性对照血清和阴性对照血清分别在三代虫检测孔区域、小瓜虫检测孔区域、指环虫检测孔区域、复口吸虫检测孔区域和车轮虫检测孔区域加样，每孔加100μl，加样后静置10min；各检测孔区域均设空白对照孔，孔中不加血清样本，只加100μl含有0.5％吐温的0.1m磷酸盐缓冲液，去除孔中溶液，滴加含有0.5％吐温的0.1m磷酸盐缓冲液一滴，用蒸馏水洗涤3次，去除孔中溶液；
109.步骤3、向三代虫检测孔区域、小瓜虫检测孔区域、指环虫检测孔区域、复口吸虫检测孔区域和车轮虫检测孔区域孔中各滴入相对应的三代虫酶标抗原溶液2滴、小瓜虫酶标
抗原溶液2滴、指环虫酶标抗原溶液2滴、复口吸虫酶标抗原溶液2滴、车轮虫酶标抗原溶液2滴，37℃反应10min，去除孔中溶液，滴加含有0.5％吐温的0.1m磷酸盐缓冲液一滴，用蒸馏水洗涤3次，去除孔中溶液；
110.步骤4、向检测孔区域孔中滴加30％过氧化氢溶液和四甲基联苯胺显色剂各1滴，混匀后室温下暗处显色3～5min，待阴性对照孔出现蓝色时，向各孔中滴加2n硫酸溶液1滴终止显色反应；
111.步骤5、观察待测血清检测孔颜色：
112.三代虫检测孔区域待测血清检测孔颜色与此板阴性对照孔颜色相同，检测结果为阴性，即鲑鳟鱼待测血清中没有与三代虫抗原相对应的特异性抗体，即没有感染三代虫；
113.小瓜虫检测孔区域待测血清检测孔颜色与此板阴性对照孔颜色相同，检测结果为阴性，即鲑鳟鱼待测血清中没有与小瓜虫抗原相对应的特异性抗体，即没有感染小瓜虫；
114.指环虫检测孔区域待测血清检测孔颜色与此板阴性对照孔颜色相同，检测结果为阴性，即鲑鳟鱼待测血清中没有与指环虫抗原相对应的特异性抗体，即没有感染指环虫；
115.复口吸虫检测孔区域待测血清检测孔颜色与此板阴性对照孔颜色相同，检测结果为阴性，即鲑鳟鱼待测血清中没有与复口吸虫抗原相对应的特异性抗体，即没有感染复口吸虫；
116.车轮虫检测孔区域待测血清检测孔颜色明显深于阴性对照孔颜色，检测结果为阳性，即鲑鳟鱼待测血清中含有与车轮虫抗原相对应的特异性抗体，即待测鱼体感染了车轮虫。
117.本发明提供的用于鲑鳟鱼养殖的寄生虫快速酶免疫检测方法及试剂盒，针对多种鲑鳟鱼养殖中常见的寄生虫具有良好的特异性和灵敏度，能够同时对多种寄生虫进行检测，快速、高效、准确鉴定出鱼体感染的寄生虫种类，准确指导用药。
118.本发明提供的酶免疫检测试剂盒所用寄生虫虫体可溶性抗原、酶标抗原制备方法简单，，所用其他试剂也易于获得，检测试剂盒成本低廉，操作简单，对场地和操作人员要求不高，适合规模化鲑鳟鱼养殖场在现场进行寄生虫病的快速检测、准确查明寄生虫物种、分析寄生虫种类、感染情况和不同养殖环境和养殖模式下的感染风险，为鲑鳟鱼产业的健康发展提供重要技术支持。