本发明涉及一种基于抗体/适体双识别元件检测玉米赤霉烯酮的比率型电化学传感器制备方法，尤其涉及一种基于硼族金属超薄纳米片/金属八面体@双金属纳米复合材料的制备方法。
背景技术：
我国是粮食生产和消费大国，其粮食安全问题关系国计民生。然而近年来，国内的粮食安全形势变得越加严峻，关于陈化粮、霉变谷物中的真菌毒素污染事件不容乐观。其中，玉米赤霉烯酮（zen）因其具备高稳定和强毒的特性被列为危害最严重的真菌毒素之一。zen是一种由镰刀菌（即禾谷镰刀菌、秆镰刀菌和谷类镰刀菌等）产生的非甾体雌激素型真菌毒素，广泛存在于各种谷物中，包括玉米、小麦和水稻等。作为一种具有免疫毒性、神经毒性和致癌性的真菌毒素，zen不仅会污染作物造成畜牧业巨大的经济损失，还可以通过食物链进入人体和动物体内，造成重大的健康威胁。当前zen的检测方法主要是色谱技术，这些色谱技术的检测结果准确、可靠，然而它们通常需要大型设备、价格昂贵且操作繁琐。为了食品安全和畜牧业的持续发展，寻求一种更加灵敏、快速和便捷的分析方法来监测食品中对人体健康造成威胁的zen具有非常关键的意义。
技术实现要素：
发明本发明涉及一种基于抗体/适体双识别元件检测玉米赤霉烯酮的比率型电化学传感器制备方法。
一种基于抗体/适体双识别元件检测玉米赤霉烯酮的比率型电化学传感器制备方法，其步骤如下：
所述的金属八面体@双金属纳米复合材料的制备：利用水热合成法制备金属八面体，称取1.0~3.0g金属氯化物a和0.1~0.5g氨基官能化试剂溶解在10~20ml的分散剂中，并通过超声处理10-30分钟。将所得混合物转移至水热反应容器中，在100~500℃的烘箱内温育24~48小时。将获得的产物以8000~10000rpm（5-10min）离心并用分散剂洗涤2~5次，在50~100℃下干燥以获得金属八面体。然后取1.0~5.0mg金属八面体和1.0~5.0mg交联剂溶解在1~5ml1~5％有机酸溶液中。然后，将溶液在超声仪中超声处理5~20分钟。之后将100~200μl金属硝酸盐溶液（3.0~6.0mm）和200~600μl贵金属溶液（3.0~8.0mm）添加到上述混合物中，并使用涡旋混合器混合。在50~100℃温育5~10h后，在8000~12000rpm转速下离心10~15min2~3次，即可收集金属八面体@双金属纳米复合材料；
所述硼族金属超薄纳米片/金属八面体@双金属纳米复合材料的制备：称取3.0~5.0mg的硼族硝酸化合物，0.5~1.0mg杂环化合物a和20~30mg交联剂溶于10~20ml体积比为1:1~3:1的分散剂a和分散剂b的混合物中。然后在搅拌下滴加3~5ml杂环化合物b（0.003~0.005mmol）。之后，将溶液超声处理10~15min，加热至50~100℃，然后保持反应15~20小时，用分散剂b洗涤两次，在8000~12000rpm转速下离心10~15min收集，在50~100℃下干燥至恒重得到硼族金属超薄纳米片。将0.5~1.0g上述（1）制备的金属八面体@双金属纳米复合材料和0.05~0.10g的硼族金属超薄纳米片添加到分散剂a中，并将混合溶液在150~200℃回流5~10小时，将制得的固体过滤并用分散剂a和水洗涤几次，最后干燥得到硼族金属超薄纳米片/金属八面体@双金属纳米复合材料；
所述信号标签的制备：在剧烈搅拌下将0.05~0.10ml聚电解质，0.01~0.05ml贵金属溶液（0.2~0.6m），0.5~1.0ml金属硝酸盐溶液引入到10~20ml分散剂中。反应5~10分钟后，将混合物在100~200°c的油浴中加热10~30分钟，冷却至室温。引入20~50ml水，在2000~5000rpm转速下离心10~20min。再次以15000~20000rpm转速下离心10~20min，洗涤2~5次以收集种子溶液。将100~200μl5~10mm的贵金属溶液和100~200μl5~10mm金属硝酸盐溶液依次引入到5~10ml100~150mm表面活性剂中，并在温和的磁力搅拌下加入20~30μl100~150mm的还原性溶液，再次加入100~200μl1~5m的盐酸溶液和20~30μl100~150mm的还原性溶液。再注入10~20μl种子溶液并在50~100°c下生长10~20分钟，得到贵金属双锥体溶液。将0.5~1.0ml0.1~0.5m金属氯化物溶液b和0.1~0.5g0.01~0.05m表面活性剂混合到10~15ml水中，将所得混合溶液置于20~50℃水浴中。随后，添加0.1~0.5ml1.0~5.0m的氢氧化钠溶液。然后，快速注入1.0~5.0ml0.1~5.0m盐酸羟胺并搅拌10~30s，再加入0.1~0.2ml1.0~5.0m的盐酸溶液并搅拌10~30s，将得到的最终溶液在水浴中老化1~2小时，引入3~10ml的分散剂中，并在室温下静置1~2小时。将该溶液重复离心，用比例为1:1~1:3的水和分散剂洗涤，将所得沉淀物与10~20ml分散剂和0.02~0.05ml偶联剂混合，并在50~100℃下回流2~5小时，以获得氨基化金属过氧化物，将所得溶液分散在1~5ml水中。贵金属纳米双锥@氨基化金属过氧化物的制备，首先将0.03~0.05ml氨基化金属过氧化物离心，除去上清液。然后，加入0.1~0.5ml的贵金属纳米双锥溶液和0.5~1.0ml的蒸馏水。将混合物振荡2~5分钟，最后在室温下置于振荡器中10~15小时，以获得贵金属纳米双锥@氨基化金属过氧化物复合材料。将100~200μl贵金属纳米双锥@氨基化金属过氧化物复合材料与10~30μl100~200μmdna-3溶液混合，并在振荡器中放置12~24h。随后，将100~200μl1~5mnacl添加到混合物中，并在振荡器中再放置12~24小时，然后以4000~8000rpm的速度离心10~20分钟。然后，再弃去上清液以去除多余的dna-3后，使用1~5ml的10~20mm缓冲液溶解沉淀物，最终获得dna-3/贵金属纳米双锥@氨基化金属过氧化物信号标签；
所述抗体/核酸适配体互补链/硼族金属超薄纳米片/金属八面体@双金属纳米复合材料/金电极的制备：首先用氧化铝粉抛光金电极(直径为1~4mm)，将抛光后的金电极依次置于分散剂和超纯水中分别超声处理5~10min，然后将金电极浸入强氧化溶液中30~60min，用蒸馏水冲洗干燥，取2~5μl上述硼族金属超薄纳米片/金属八面体@双金属纳米复合材料溶液滴加在金电极表面，于红外灯下干燥3~6min。先将1~10μl4~6μmzen单克隆抗体、1~10μl4~6μm3'端修饰信号分子的适体链互补链dna-1和5~10μl0.1~0.5mm封闭剂分别滴在电极上，放置4~8℃下12~24h，然后滴加5~10μl4~6μmzen适体链与dna酶的底物链连接的dna-2，在30~50℃孵育1~2h，最后得到抗体/核酸适配体互补链/硼族金属超薄纳米片/金属八面体@双金属纳米复合材料/金电极；
电化学传感器是以抗体/核酸适配体互补链/硼族金属超薄纳米片/金属八面体@双金属纳米复合材料/金电极为工作电极，以铂丝电极为参比电极，饱和氯化银为对电极，分别通过滴加不同浓度的目标物zen和mg2+溶液后dna-13'端所带信号分子响应信号的降低和与酶剪切后链互补的连接dna-3的信号标签对h2o2还原响应信号的增加对h2o2还原响应信号的增加来指示样品中zen的含量，得到了用于检测zen的比率型电化学传感器。
所述的金属八面体为铁金属材料、钌金属材料、钴金属材料、铜金属材料中的一种或多种；
所述的双金属为银铂纳米颗粒、银钯纳米颗粒、铂钯纳米颗粒中的一种或多种；
所述的金属氯化物a有氯化铁、氯化钌、氯化钴、氯化铜中的一种或多种；
所述的氨基官能化试剂为阳离子聚丙烯酰胺、聚乙烯亚胺、二氨基对苯二酸一种或多种；
所述的分散剂为n，n-二甲基甲酰胺、异丙醇、乙醇、二甘醇、丙酮中的一种或多种；
所述的交联剂聚乙烯吡咯烷酮、壳聚糖、过氧化苯甲酰、过氧化二枯基中的一种或多种；
所述的有机酸是甲酸、乙酸、苯甲酸、乙二酸中的一种或多种；
所述的贵金属溶液为氯化钯、氯铂酸、氯金酸、醋酸钯中的一种或多种；
所述的金属硝酸盐溶液为硝酸银、硝酸铑、硝酸铅中的一种或多种；
所述的硼族金属超薄纳米片为al-tcpp、ga-tcpp、in-tcpp中的一种或多种;
所述的硼族硝酸化合物为硝酸镓、硝酸铝、硝酸铟中的一种或多种；
所述的杂环化合物a为卟啉、吡啶、吡嗪、嘧啶中的一种或多种；
所述的杂环化合物b为卟啉、吡啶、吡嗪、嘧啶中的一种或多种；
所述的分散剂a为n，n-二甲基甲酰胺、异丙醇、乙醇、二甘醇、丙酮中的一种或多种；
所述的分散剂b为n，n-二甲基甲酰胺、异丙醇、乙醇、二甘醇、丙酮中的一种或多种；
所述的聚电解质为聚二烯丙基二甲基氯化铵、聚乙烯亚胺、聚乙烯吡啶中的一种或多种；
所述的表面活性剂为十六烷基三甲基溴化铵、十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠、脂肪醇醚硫酸盐中一种或多种；
所述的还原性溶液为抗坏血酸、水合肼、硼氢化钠、四氢锂铝中的一种或多种；
所述的金属氯化物b有氯化铜、氯化钴、氯化铁中的一种或多种；
所述的偶联剂为3-氨丙基三乙氧基硅烷、3-（2，3-环氧丙氧）丙基三甲氧基硅烷、γ-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷中的一种;
所述的氨基化金属过氧化物为过氧化铜、过氧化钴、过氧化铁中的一种或多种；
所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液、tris-hcl缓冲液、醋酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液中的一种或多种；
所述的强氧化溶液为过氧化氢、浓硫酸和浓盐酸溶液中的两种混合物，体积比为1:1~3:1；
所述的信号分子为二茂铁、亚甲基蓝、中性红中的一种或多种；
所述的封闭剂为6-巯基己醇、牛血清白蛋白、己硫醇中的一种或多种；
本发明涉及的传感器中，以抗体/核酸适配体互补链/硼族金属超薄纳米片/金属八面体@双金属纳米复合材料/金电极为工作电极，同其它用于玉米赤霉烯酮含量检测的电化学传感器相比，所制备的基于抗体/适体双识别元件的比率型传感器具有灵敏度高、重复性好、准确度高的优点。
发明内容
下面结合具体实施例对本发明进行描述：
实施例1
具体步骤如下：
（1）fe-mof@agpd纳米复合材料的制备，将1.44gfecl3·6h2o和0.44gh2bdc溶解在16mldmf中，并通过超声处理30分钟获得澄清溶液。将混合物转移至水热反应容器（体积为20ml）中，并在110℃烘箱中温育48小时。将获得的产物离心并用乙醇以8000rpm（8-10min）洗涤3次，并在60℃下干燥以获得fe-mof。然后取1mgfe-mof和1mg壳聚糖溶解在1ml1％乙酸溶液中。然后，将溶液在超声仪中超声处理10分钟。此步骤后，然后将200μlagno3溶液（5.0mm）和600μlpdcl2溶液（5.0mm）添加到混合物中，并使用涡旋混合器混合。在60℃温育6小时后，通过两次离心（8800rpm，10分钟）收集fe-mof@agpd纳米复合材料。
（2）ga-tcpp/fe-mof@agpd纳米复合材料的制备,将ga（no3）3·6h2o（4.5mg，0.015mmol），吡嗪（0.8mg，0.01mmol）和pvp（20.0mg）溶于12mldmf和乙醇（v:v=3:1）的混合物中在20毫升加盖的小瓶中。然后在搅拌下滴加溶于4mldmf和乙醇（v:v=3:1）的tcpp（4.0mg，0.005mmol）。之后，将溶液超声处理10分钟。将小瓶加热至80℃，然后将反应保持16小时。将所得的纳米片用乙醇洗涤两次，并通过在8000rpm下离心来收集10min，在80℃下干燥至恒重得到ga-tcpp。最后，再将0.5g上述（1）制备的/fe-mof@agpd纳米复合材料和0.05g的ga-tcpp添加到dmf中，并将混合溶液在155℃回流5小时，将制得的固体过滤并用dmf和水洗涤几次，最后干燥得到ga-tcpp/fe-mof@agpd纳米复合材料。
（3）信号标签的制备：在剧烈搅拌下将0.05mlpdda，0.0125mlhaucl4水溶液（0.485m），0.6mlagno3（10mg在1mldeg中）引入到10mldeg中。5分钟后，将混合物在200°c的油浴中加热10分钟，然后将溶液冷却至室温。引入20ml水，然后进行离心处理（20min，2000rpm）以除去不溶性agcl固体。需要再次离心（20分钟，20000rpm）以收集aund。为了除去过量的pdda和deg，重复洗涤两次，并将收集的纳米晶体溶于13ml水中得到金种子溶液。将haucl4（150μl，10mm）和agno3（180μl，10mm）依次引入ctab水溶液（5ml，100mm）中。然后在温和的磁力搅拌下加入aa（25μl，100mm）。然后在温和磁力搅拌下加入hcl水溶液（100μl，1m）和aa（25μl，100mm）。最后，注入20μl的金种子溶液以诱导aunb在80°c下生长20分钟得到金纳米双锥。将0.75mlcucl2（0.1m）和0.1298gsds（0.03m）混合到12.48ml水中。将所得混合溶液置于34℃水浴中以完全溶解sds。随后，添加0.27ml的naoh（1.0m），溶液立即从无色变为浅蓝色。然后，将1.38mlnh2oh·hcl（0.1m）快速注入装有上述溶液的玻璃瓶中，并将溶液搅拌20s。加入nh2oh·hcl，溶液的颜色变为绿色。之后，加入0.12ml的hcl（1.0m）并搅拌20s，并且在加入hcl的情况下溶液颜色从绿色变为亮黄色。最后，将得到的最终溶液在水浴中老化1.5小时，以促进纳米晶体的生长。引入4.5ml的95％乙醇，并在室温下静置1小时。澄清的淡黄色溶液变得混浊，可能归因于sds分子的悬浮。将该溶液重复离心以获得沉淀，将其用1:1的水和乙醇比例洗涤。将沉淀物与20ml乙醇和0.05mlaptes混合，并在70℃下回流3小时，以获得氨基化nh2-cu2o-nds，将所得溶液分散在1~5ml水中。对于aunbs@cu2o-nds的制备，首先将0.05mlcu2o-nds离心，除去上清液。然后，加入0.1ml的aunbs溶液，然后加入0.60ml的蒸馏水。将混合物振荡2分钟，最后在室温下置于振荡器中12小时，以获得aunbs@cu2o-nds。将100~200μlaunbs@cu2o-nds20μldna-3溶液（100μm）混合，并在振荡器中放置12h。随后，将200μlnacl（2m）添加到混合物中，并在振荡器中再放置24（实际25）小时，然后以5000rpm的速度离心10分钟。然后，再弃去上清液以去除多余的dna-3后，使用1ml的10mmtris-hcl缓冲液（0.1mnacl，1mmedta，ph7.4）溶解沉淀物，最终获得dna-3/aunbs@cu2o-nds信号标签。
（4）抗体/核酸适配体互补链/ga-tcpp/fe-mof@agpd纳米复合材料/金电极的制备：首先用氧化铝粉抛光金电极，将抛光后的金电极依次置于分散剂和超纯水中分别超声处理5min，然后将金电极浸入体积比7:3的浓硫酸与过氧化氢溶液中30min，用蒸馏水冲洗干燥，取5μl上述ga-tcpp/fe-mof@agpd纳米复合材料溶液滴加在金电极表面，于红外灯下干燥5min。先将3μl5μmzen单克隆抗体、3μl5μm3'端修饰信号分子的适体链互补链dna-1和5μl0.1mm封闭剂分别滴在电极上，放置5℃下24h，然后滴加5μl5μmzen适体链与dna酶的底物链连接的dna-2，在37℃孵育1h，最后得到抗体/核酸适配体互补链/ga-tcpp/fe-mof@agpd纳米复合材料/金电极。
（5）电化学传感器是以抗体/核酸适配体互补链/硼族金属超薄纳米片/金属八面体@双金属纳米复合材料/金电极为工作电极，以铂丝电极为参比电极，饱和氯化银为对电极，分别通过滴加不同浓度的目标物zen和mg2+溶液后dna-13'端所带信号分子响应信号的降低和与酶剪切后链互补的dna-3/aunbs@cu2o-nds对h2o2还原响应信号的增加来指示样品中zen的含量，得到了用于检测zen的比率型电化学传感器。
所制备的电化学传感器对玉米赤霉烯酮的检测具有准确度高，线性范围宽（0.5pg/ml~50ng/ml），检测下限低（0.10pg/ml）的特点。同时，对实际样品(如玉米、小麦)的检测结果表明所制备的传感器具有非常好的实际应用价值。
以上实施例只是为了说明本发明，而不是对本发明的限制。在上述说明的基础上，可以对本发明作许多改进和改变。在所附权利要求书的范围内，本发明可以有不同于上述的其它实现方式，选用其它试剂材料、调整孵育时间等方法均在本发明专利要求范围之内。