一种防风通圣颗粒指纹图谱的建立方法及其指纹图谱与流程

：
1.本发明涉及中药制剂分析领域，具体涉及防风通圣颗粒指纹图谱的建立方法及其指纹图谱。


背景技术：

2.防风通圣颗粒源自《宣明论方》，为金元四大家刘完素的经典代表方之一，由防风、连翘、荆芥穗、薄荷、麻黄等十七味中药组成，具有清热解毒、解表通里之功效，临床上可广泛用于治疗上呼吸道感染、湿疹、荨麻疹等，临床疗效显著。防风通圣颗粒组方大，药味复杂，收载于《中国药典》2020年版一部，包括9项理化鉴别及2项含量测定，虽能从一定程度上控制药品质量，但对于成分复杂、多靶点的中成药而言，缺乏整体性控制。以“整体性”和“模糊性”为特点的中药指纹图谱用于评价中药材、半成品、中药制剂的质量，可全面反映中药产品的内在质量。


技术实现要素：

3.本发明的主要目的是为了解决现有的防风通圣颗粒质量控制缺乏整体性的问题，提供一种防风通圣颗粒指纹图谱的建立方法。通过此方法保证防风通圣颗粒质量的稳定性、一致性和可控性。
4.为实现上述目的，本发明通过以下步骤实现：
5.一种防风通圣颗粒指纹图谱的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
6.1.供试品溶液的制备：取防风通圣颗粒，研细，过五号筛，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入一定量溶剂，称定重量，超声提取，放冷，再称定重量，用溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，过微孔滤膜，即得。
7.2.混合对照品溶液的制备：取栀子苷、升麻素苷、甘草苷、5-o-甲基维斯阿米醇苷、黄芩苷、甘草酸铵、芦荟大黄素对照品，精密称定，加适量溶剂溶解，过微孔滤膜，即得混合对照品溶液。
8.3.测定：分别精密吸取供试品溶液和混合对照品溶液，注入高效液相色谱仪，进行测定，记录色谱图，色谱条件为：
9.色谱柱：安捷伦zorbax eclipse plus c18柱(5μm，4.6
×
250mm)；检测波长为254nm；流速为1.0ml/min；柱温为25℃；进样量为10μl；流动相a为0.1％磷酸水溶液，流动相b为乙腈，采用梯度洗脱的方式。
10.4.防风通圣颗粒指纹图谱的构建：将不同批次的供试品色谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价软件，选择各批次供试品中共有的色谱峰，生成防风通圣颗粒对照指纹图谱，计算各共有峰的相对峰面积和相对保留时间。
11.作为优选方案，以上所述的一种防风通圣颗粒指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤1中，所述供试品溶液的制备方法如下：分别取15批防风通圣颗粒，每批约2g，研细，过五号筛，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，称定重量，超声提取30分钟，
放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，过0.45μm微孔滤膜，即得。
12.作为优选方案，以上所述的一种防风通圣颗粒指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤2中，所述混合对照品溶液的制备方法如下：取栀子苷、升麻素苷、甘草苷、5-o-甲基维斯阿米醇苷、黄芩苷、甘草酸铵、芦荟大黄素对照品，精密称定，加70％甲醇溶解，制成栀子苷(50μg
·
ml-1
)、升麻素苷(20μg
·
ml-1
)、甘草苷(20μg
·
ml-1
)、5-o-甲基维斯阿米醇苷(10μg
·
ml-1
)、黄芩苷(0.4mg
·
ml-1
)、甘草酸铵(0.20mg
·
ml-1
)、芦荟大黄素(5μg
·
ml-1
)的混合对照品溶液，过0.45μm微孔滤膜。
13.作为优选方案，以上所述的一种防风通圣颗粒指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤3中，所述梯度洗脱法如下：
[0014][0015]
作为优选方案，以上所述的一种防风通圣颗粒指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤4中，所述建立方法得到的指纹图谱中含有22个特征峰，其中2号峰、3号峰、5号峰、9号峰、12号峰、19号峰、20号峰分别为栀子苷、升麻素苷、甘草苷、5-o-甲基维斯阿米醇苷、黄芩苷、甘草酸铵、芦荟大黄素。以12号峰黄芩苷为参照峰，计算其它21个特征峰的相对保留时间和相对峰面积：1号峰0.1902
±
0.0003，2号峰0.3131
±
0.0014，3号峰0.4669
±
0.0019，4号峰0.5874
±
0.0020，5号峰0.6102
±
0.0020，6号峰0.6426
±
0.0019，7号峰0.6565
±
0.0017，8号峰0.6747
±
0.0016，9号峰0.7332
±
0.0016，10号峰0.9459
±
0.0003，11号峰0.9741
±
0.0003，13号峰1.1159
±
0.0004，14号峰1.1376
±
0.0003，15号峰1.1720
±
0.0006，16号峰1.2308
±
0.0008，17号峰1.4082
±
0.0010，18号峰1.4441
±
0.0011，19号峰1.4960
±
0.0012，20号峰1.5393
±
0.0014，21号峰1.6149
±
0.0016，22号峰1.6221
±
0.0016；相对峰面积：1号峰，0.0200
±
0.0002，2号峰0.0581
±
0.0010，3号峰0.0292
±
0.0001，4号峰0.0414
±
0.0007，5号峰0.1306
±
0.0003，6号峰0.0373
±
0.0005，7号峰0.0232
±
0.0004，8号峰0.0347
±
0.0002，9号峰0.0523
±
0.0006，10号峰0.0427
±
0.0001，11号峰0.0527
±
0.0005，13号峰0.0571
±
0.0001，14号峰0.0318+0.0004，15号峰0.2252
±
0.0041，16号峰0.3343
±
0.0006，17号峰0.0865
±
0.0002，18号峰0.0192
±
0.0005，19号峰0.1545
±
0.0002，20号峰0.0280
±
0.0001，21号峰0.0199
±
0.0002，22号峰0.0248
±
0.0004。
[0016]
使用前述方法测定15批防风通圣颗粒样品，得到15个批次的防风通圣颗粒指纹图谱，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012版评价各批次防风通圣颗粒hplc图谱的相似度，15批防风通圣颗粒的相似度均大于0.99，表明防风通圣颗粒产品质量稳定。
[0017]
相比现有技术，本发明的有益效果是：
[0018]
(1)本发明建立的防风通圣颗粒指纹图谱建立的方法简便可靠、稳定性和精密度高、重复性好。
[0019]
(2)本发明建立了防风通圣颗粒指纹图谱共有模式，标定了22个共有峰，指认了7个共有特征峰。本法选择12号峰黄芩苷作为指纹图谱中的参照峰，确定了各共有峰的相对保留时间。
[0020]
(3)将本发明中建立的指纹图谱方法用于防风通圣颗粒的质量监控，能从整体上、全面有效地对防风通圣颗粒的质量进行控制，从而保证产品的稳定性、可靠性与安全性。
附图说明
[0021]
图1为15批防风通圣颗粒hplc指纹图谱和对照指纹图谱(r)。
[0022]
图2检测波长对比。
[0023]
图3混合对照品溶液及防风通圣颗粒的hplc指纹图谱。
具体实施方式：
[0024]
下面结合实施例对本发明的实施方案进行详细阐述，但本发明的保护范围并不局限于以下各实施例。
[0025]
以下各实施例中所使用的仪器与试剂如下：
[0026]
1.仪器
[0027]
agilent 1260高效液相色谱仪；色谱柱为zorbax eclipse plus c18色谱柱(5μm，4.6
×
250mm)。el204型电子天平(梅特勒-托列多仪器上海有限公司)；shb-iii型循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；dfy8000型万能粉碎机(上海比朗仪器制造有限公司)；kq-500vdb型超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)。
[0028]
2.药品与试剂
[0029]
以下各实施例中所使用的的药品和试剂：防风通圣颗粒由山东润中药业有限公司提供，批号为：1803001、1803002、1803003、1803004、1803005、1803006、1803007、1803008、1803009、1803010、1803011、1803012、1803013、1803014、1803015。栀子苷(110749-201617)、甘草苷(111610-201607)、甘草酸铵(：110737-201619)、黄芩苷(111595-201607)、芦荟大黄素(110795-201710)、升麻素苷(111522-201712)、5-o-甲基维斯阿米醇苷(111523-201610)，以上对照品均购自中国食品药品检定研究院。乙腈为色谱纯；甲醇、磷酸为分析纯。
[0030]
实施例1采用高效液相色谱法建立防风通圣颗粒的指纹图谱
[0031]
1.供试品溶液的制备：取防风通圣颗粒约，研细，过五号筛，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，称定重量，超声提取30分钟，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，过0.45μm微孔滤膜，即得。
[0032]
2.混合对照品溶液的制备：取栀子苷、升麻素苷、甘草苷、5-o-甲基维斯阿米醇苷、
黄芩苷、甘草酸铵、芦荟大黄素对照品，精密称定，加70％甲醇溶解，分别制栀子苷(50μg
·
ml-1
)、升麻素苷(20μg
·
ml-1
)、甘草苷(20μg
·
ml-1
)、5-o-甲基维斯阿米醇苷(10μg
·
ml-1
)、黄芩苷(0.4mg
·
ml-1
)、甘草酸铵(0.20mg
·
ml-1
)、芦荟大黄素(5μg
·
ml-1
)的混合对照品溶液，过0.45μm微孔滤膜，即得。
[0033]
3.测定：分别精密吸取供试品溶液和混合对照品溶液，注入高效液相色谱仪，进行测定，记录色谱图，色谱条件为：
[0034]
色谱柱：安捷伦zorbax eclipse plus c18柱(5μm，4.6
×
250mm)；检测波长为254nm；流速为1.0ml/min；柱温为25℃；进样量为10μl；流动相a为0.1％磷酸水溶液，流动相b为乙腈，采用梯度洗脱的方式，梯度洗脱方法如下：
[0035][0036][0037]
4.防风通圣颗粒指纹图谱的构建：将15个批次的防风通圣颗粒供试品色谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价软件，选择各批次防风通圣颗粒中共有的色谱峰，生成防风通圣颗粒对照指纹图谱，以12号峰为参照峰，计算各共有峰的相对峰面积和相对保留时间。结果：相对保留时间：1号峰0.1902
±
0.0003，2号峰0.3131
±
0.0014，3号峰0.4669
±
0.0019，4号峰0.5874
±
0.0020，5号峰0.6102
±
0.0020，6号峰0.6426
±
0.0019，7号峰0.6565
±
0.0017，8号峰0.6747
±
0.0016，9号峰0.7332
±
0.0016，10号峰0.9459
±
0.0003，11号峰0.9741
±
0.0003，13号峰1.1159
±
0.0004，14号峰1.1376
±
0.0003，15号峰1.1720
±
0.0006，16号峰1.2308
±
0.0008，17号峰1.4082
±
0.0010，18号峰1.4441
±
0.0011，19号峰1.4960
±
0.0012，20号峰1.5393
±
0.0014，21号峰1.6149
±
0.0016，22号峰1.6221
±
0.0016；相对峰面积：1号峰，0.0200
±
0.0002，2号峰0.0581
±
0.0010，3号峰0.0292
±
0.0001，4号峰0.0414
±
0.0007，5号峰0.1306
±
0.0003，6号峰0.0373
±
0.0005，7号峰0.0232
±
0.0004，8号峰0.0347
±
0.0002，9号峰0.0523
±
0.0006，10号峰0.0427
±
0.0001，11号峰0.0527
±
0.0005，13号峰0.0571
±
0.0001，14号峰0.0318+0.0004，15号峰0.2252
±
0.0041，16号峰0.3343
±
0.0006，17号峰0.0865
±
0.0002，18号峰0.0192
±
0.0005，19号峰0.1545
±
0.0002，20号峰0.0280
±
0.0001，21号峰0.0199
±
0.0002，22号峰0.0248
±
0.0004。
[0038]
5.使用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统研究版(2012a)”对15批防风通圣颗粒指纹图谱进行相似度评价，相似度均大于0.99，结果见表1。
[0039][0040]
实施例2防风通圣颗粒指纹图谱的方法学考察
[0041]
1.梯度洗脱方式的选择
[0042]
防风通圣颗粒颗粒是由十七味中药组成的复方制剂，所含化学成分较为复杂，因此采用梯度洗脱的方式。以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以0.1％磷酸水溶液为流动相a，乙腈为流动相b，洗脱流速为1.0ml/min，柱温25℃，进样量10μl，梯度洗脱方法如下：
[0043][0044]
2.检测波长的选择
[0045]
分别考察检测波长为210nm、230nm、254nm、280nm，300nm，320nm，350nm时供试品溶液色谱图中色谱峰的数量，结果见图2。
[0046]
3.精密度试验
[0047]
取供试品溶液，按上述色谱条件连续进样6次，分别测定保留时间和峰面积，以12号峰黄芩苷峰为参照峰，计算各共有峰与参照峰的相对保留时间及相对峰面积，并计算rsd值，结果见表2、表3。
[0048]
表2精密度试验中各共有峰的相对保留时间
[0049][0050][0051]
表3精密度试验中各共有峰的相对峰面积
[0052][0053]
4.稳定性试验
[0054]
取同一防风通圣颗粒供试品溶液，按上述色谱条件，分别于0、2、4、6、8、10、12、24h测定，以12号峰黄芩苷峰为参照峰，计算各共有峰与参照峰的相对保留时间及相对峰面积，并计算rsd值，结果见表4、表5。
[0055]
表4稳定性试验中各共有峰的相对保留时间
[0056]
[0057][0058]
表5稳定性试验中各共有峰的相对保峰面积
[0059][0060]
5.重复性试验
[0061]
取同一批次的防风通圣颗粒样品，按上述供试品溶液制备方法制备6份供试品溶液。按上述色谱条件测定。以12号峰黄芩苷峰为参照峰，计算各共有峰与参照峰的相对保留时间及相对峰面积，并计算rsd值，结果见表6、表7。
[0062]
表6重复性试验中各共有峰的相对保留时间
[0063]
[0064][0065]
表7稳重复性试验中各共有峰的相对保峰面积
[0066][0067]
上述

技术实现要素：
及具体实施方式意在证明本发明所提供技术方案的实际应用，不应解释为对本发明保护范围的限定。本领域技术人员在本发明的精神和原理内，当可作各种修改、等同替换或改进。本发明的保护范围以所附权利要求书为准。