一种二合一猪伪狂犬抗体双孔快速检测卡及检测方法与流程

1.本发明涉及一种检测卡，特别是涉及一种二合一猪伪狂犬抗体双孔快速检测卡及检测方法。


背景技术：

2.伪狂犬病(pseudorabies，pr)是由伪狂犬病病毒(pseudorabies virus，prv)引起的一种高度接触性传染病。伪狂犬病病毒基因组可编码70种蛋白，目前已发现和命名的有gb、gc、gd、ge、gg、gh、gi、gk、gl、gm、gn 11种糖蛋白。编码gc、ge、gg、gi、gm和gn的基因为病毒复制非必需的，gb、gc、gd、ge和gi与病毒的毒力有关。此外，胸苷激酶(tk)、核苷酸还原酶(rr)、蛋白激酶(pk)、碱性核酸外切酶(an)和脱氧尿苷三磷酸激酶(dutpase)等几种酶也与病毒的毒力密切相关，其中tk是prv最主要的毒力基因。糖蛋白gb、gc、gd在免疫诱导方面最为重要。目前已经发现prv有11种糖蛋白，其中，gb、gc、gd均为刺激机体产生中和抗体的蛋白，所产生的抗体无论是在体内、体外，还是在有无补体存在的情况下都有中和prv的能力，因此，gb、gc、gd是研制prv亚单位疫苗的首选糖蛋白。本病毒可在猪肾细胞、兔肾细胞、牛睾丸细胞、鸡胚成纤维等原代细胞以及pk
‑
15、bhk
‑
21等传代细胞中都能很好的增殖，并产生明显的细胞病变和核内嗜酸性包涵体。
3.疫苗接种是预防、控制甚至消灭猪伪狂犬病主要的措施之一。国内外已研制出猪伪狂犬病的灭活疫苗、弱毒疫苗、基因缺失弱毒疫苗已经相对成熟。常规的弱毒疫苗是通过在鸡和牛的细胞上多次传代而获得的，如bartha、buk、norden和nia 24疫苗株，通过分子生物学方法已经证明这些疫苗株的ge基因都有部分或完全缺失。通过ge基因缺失苗可以将免疫猪与感染猪区分开来,我国目前广泛使用的pr弱毒冻干疫苗(bartha
‑
k61)是一种gi/ge双基因缺失弱毒疫苗，由于该基因缺失而进一步阻断弱毒株回复毒力的可能性，所以大大提高了这种弱毒苗的安全性。世界上很多国家都用这个毒株做的活疫苗净化了伪狂犬病。
4.伪狂犬病毒的防控主要是疫苗免疫，而疫苗免疫动物与感染动物体内都会产生gb蛋白抗体，因此检测gb蛋白抗体的诊断方法能确定动物对病毒株的抵抗力。同时日常监测疫苗产生抗体是对群体的日常监测选择疫苗、评估免疫程序合理性、掌握猪群健康状态的重要手段，也是适时注射疫苗的主要依据。检测伪狂犬病毒gi蛋白抗体又可以评估野毒对动物感染情况，因此二合一产品即能估评疫苗免疫情况，又可以知道野毒感染情况。
5.目前，市场上使用检测伪狂犬病毒抗体酶标试剂盒，需要酶标仪检测、温育反应条件、洗板机洗板，和专业技术人员操作以及实验室工作环境等条件，另外检测样本还需要复杂的前处理，如采集血液，分离血清等；而快速胶体金虽然检测方便，不需专业技术人员和工作环境要求，但其检测的灵敏度低，且只能定性检测。因此，研制灵敏性高、快速、便捷、可在现场和野外进行精确检测猪伪狂犬抗体的定量检测技术显得尤为重要。


技术实现要素：

6.本发明的目的就是提供一种二合一猪伪狂犬抗体双孔快速检测卡及检测方法，能
完全解决上述现有技术的不足之处。
7.本发明通过下述技术方案来实现：
8.一种二合一猪伪狂犬抗体双孔快速检测卡，包括安装在外壳内的猪伪狂犬抗体检测条，该猪伪狂犬抗体检测条包括pvc底板、吸水垫、硝酸纤维素膜、标记物垫、样品垫和稀释垫，所述硝酸纤维素膜固定在pvc底板上，在硝酸纤维素膜左端搭接吸水垫，右端搭接稀释垫，在硝酸纤维素膜中部靠右的位置设置标记物垫，标记物垫上设置样品垫，在硝酸纤维素膜上吸水垫与标记物垫之间包被两条检测线和1条质控线；
9.标记物垫上浸染标记镧系荧光微球的伪狂犬病毒gb和gi重组抗原和标记镧系荧光微球鸡的igy抗体；在两条检测线上分别包被伪狂犬病毒gb和gi重组抗原，质控线上包被羊抗鸡igy抗体的igg。
10.作为优选，所述样品垫上设有滤血垫，可用于全血检测。
11.作为优选，所述外壳包括上盖和下盖，上盖与下盖扣合，在上盖上对应检测线和质控线开设视窗孔，对应样品垫开设加样孔，对应稀释垫开设清洗孔。
12.作为优选，所述视窗孔一侧设置有定量标识线(m)。
13.作为优选，所述定量标识线(m)为一根细实线。
14.作为优选，所述吸水垫与硝酸纤维素膜的搭接宽度为1
‑
2mm，稀释垫与硝酸纤维素膜的搭接宽度为1
‑
2mm，标记物垫与稀释垫之间有5
‑
10mm的间距。
15.作为优选，所述标记物垫为加入有色素的标记物垫。这种设计使样本与抗原抗复合液侧流过程的液迹更明显。在视窗孔看到或自动检测仪器监测到含有色素的样本液迹到达定量标识线(m)时，提示加稀释液(或清洗液)；当视窗孔再次看到色素时，应停止对检测结果判读。通过精确控制“有色液迹”量、加稀释液时间和控制检测时间，提高试剂检测的敏感性和精密性。
16.一种二合一猪伪狂犬抗体的检测方法，包括上述的快速检测卡，其特征在于：从加样孔加入样品液，当液迹到达定量标识线时，向清洗孔中加入稀释液，等待检测线和质控线免疫反应层析，最后通过视窗孔观测或通过仪器进行检测、判读结果。
17.现有层析技术采用的方式是硝酸纤维素膜一端设置吸水垫，另一端设置标记物垫，在标记物垫上由下至上依次设置样品垫和加样孔。无论是样本还是样本稀释液在加入加样孔后，样本、标记物和稀释液在吸水垫的引力作用下，迅速向吸水垫方向侧流，由于样本基质之间的差异很大，导致在渗透释放到检测线(t线)的样本总量产生偏差，从而直接影响检测结果的精密性和稳定性。
18.与现有技术不同，本发明提供了一种猪伪狂犬抗体双孔快速检测卡，在硝酸纤维素膜一端设置吸水垫，另一端设置稀释垫，标记物垫设置在稀释垫前方(吸水垫方向为前方)，并在标记物垫和稀释垫之间保留了5
‑
10mm硝酸纤维素膜裸露空间。标记物垫上依次设置样品垫、滤血垫、加样孔，稀释垫上方设置清洗孔。当样本加入加样孔后，样本经过滤血垫、样本垫和标记物垫后，样本与标记的抗原或抗体免疫反应复合液，在吸水垫和稀释垫作用下，沿着硝酸纤维素膜向吸水垫和稀释垫两个方向侧流层析。
19.采用两个方向扩散层析复合液的特征与现有技术具有本质差异，加入样本的量较少(一般为5
‑
50ul)，渗透入硝酸纤维素膜的样本的免疫复合液的流速会减慢直至停滞，这个停滞过程相比现有技术而言，就增加了样本和标记抗原或抗体物免疫复合反应时间，可
达到提高灵敏度的作用。
20.另一方面，与现有技术中免疫反应复合液快速释放到硝酸纤维素膜(t)线上不同，本发明在加入样本后，免疫反应复合液流入硝酸纤维素膜之后，此时，标记物垫处于半干半湿状态，标记物垫、样品垫和滤血垫的吸水性远远低于硝酸纤维素膜，因此，当稀释垫加入稀释液后，在吸水垫的作用下，稀释液带着复合液顺着硝酸纤维素膜向前侧流，来不及流入样品垫和标记物垫，稀释液只能将仅存于硝酸纤维素膜上的那部分样本和复合物稀释侧流至吸水垫，而未进入硝酸纤维素膜的剩余复合物和样本液只有极少量向硝酸纤维素膜中渗透，不会对检测结果造成影响，从而保证了检测的稳定性，提高检测的精密性。
21.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
22.1.通过中间的加样孔加待测样品，后边的清洗孔加稀释液的方式，不但可提高被检测物的灵敏性、精密性，而且还保留了快诊检测方法的快速和方便特性。
23.2.通过设置定量标识线(m)精确控制样本量。
24.3.本发明能同时检测伪狂犬病毒gb和gi的抗体，能区分野毒感染和疫苗免疫产生的抗体，当样本gb和gi抗体是阳性时，是野毒感染猪，当gb抗体是阳性，gi抗体是阴性时，是疫苗免疫产生抗体。
附图说明
25.图1是本发明的结构示意图；
26.图2是外壳的俯视图；
27.图3是伪狂犬病毒gb抗体标准曲线；
28.图4是伪狂犬病毒gi抗体标准曲线。
具体实施方式
29.下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。
30.如图1至图4所示，一种二合一猪伪狂犬抗体双孔快速检测卡，包括安装在外壳9内的猪伪狂犬抗体检测条。
31.所述猪伪狂犬抗体检测条包括pvc底板1、吸水垫2、硝酸纤维素膜3、稀释垫4、标记物垫5、质控线6、检测线7和样品垫8。
32.所述硝酸纤维素膜3固定在pvc底板1上，在硝酸纤维素膜3左端搭接吸水垫2，右端搭接稀释垫4，在硝酸纤维素膜3中部靠右的位置设置标记物垫5，标记物垫5上设置样品垫8和滤物垫14，在硝酸纤维素膜3上吸水垫2与标记物垫5之间设置两条检测线7和一条质控线6。外壳9上对应检测线7和质控线6开设视窗孔10，并在视窗孔10右侧设有定量标识线(m)13，该定量标识线(m)13为一根细实线，对应样品垫8开设加样孔11，对应稀释垫4开设清洗孔12。
33.所述吸水垫2与硝酸纤维素膜3的搭接宽度为1
‑
2mm，稀释垫4与硝酸纤维素膜3的搭接宽度为1
‑
2mm，标记物垫5与稀释垫4之间有5
‑
10mm的间距。
34.所述标记物垫5上浸染标记伪狂犬病毒gb和gi重组抗原的镧系荧光微球和标记鸡igy抗体的镧系荧光微球；在两条检测线7上分别包被伪狂犬病毒gb和gi重组抗原，质控线6上包被羊抗鸡igy抗体的igg。
35.作为一种优选的方案，所述标记物垫5为加入有色素的标记物垫，具体的讲，即在该标记物垫中5中加入了带色素的标示物。
36.所述外壳9包括上盖和下盖，上盖与下盖扣合，且视窗孔10、加样孔11和清洗孔12以及定量标识线(m)13位于上盖上。
37.所述样品垫8上根据需要可设有滤血垫(图中未画出),滤血垫用于分离全血中的红细胞。
38.在使用时，从加样孔11加入样品液，一般样品液加入量为5
‑
50μl，样品液经过样品垫8和标记物垫5后进入硝酸纤维素膜3，由于稀释垫4和吸水垫2均处于干燥状态，并且样品垫8和标记物垫5的液体承载量之和远小于两侧的吸水垫2和稀释垫4，因此样品液会带着标记物向硝酸纤维素膜3两侧渗透，由于样品液加入量只有5
‑
50μl，因此，样品液在向两侧层析流动时，会逐渐耗尽，进而停留在硝酸纤维素膜3的定量标识线(m)13附近，且不会到达检测线7；这样样品液和标记物耦联的伪狂犬病毒gb和gi重组抗原在硝酸纤维素膜3上就获得了更多的反应时间(一般为0.5
‑
5分钟)。当样本流动的样本液迹出现在定量标识线(m)13时，将稀释液加入清洗孔12，稀释液首先经过稀释垫4，稀释垫4中一般包含有用于消除非特异性反应的试剂组份(如阻断剂)，稀释液与其混合后进入硝酸纤维素膜3，与已经释放到硝酸纤维素膜3内的样本与抗原或抗体标记物免疫反应的结合物作用，消除一些非特异的物质的影响，并在吸水垫2的作用下，随着稀释液向吸水垫2方向流动，与检测线7和质控线6上包被的抗原(或抗体)进行免疫结合，并被捕获停留在检测线7和质控线6上，直至完成免疫层析。通过荧光仪检测检测线7和质控线6的荧光示踪物的信号经与抗体含量(效价)
‑
—荧光相关的《标准曲线》换算，获得被样本中伪狂犬病毒gb和gi抗体的含量(效价)。
39.在初始状态硝酸纤维素膜3干燥，样品液和标记物会快速释放到硝酸纤维素膜3上，基本不受样品差异影响，之后残留在标记物垫5中的标记物和样品液会缓慢进入到硝酸纤维素膜3，此时的释放过程的快慢受样品基质差异影响较大，直接影响免疫层析的稳定性。基于此，本发明将加样孔11设置在硝酸纤维素膜3中间偏清洗孔12的位置，样品液和标记物渗透到硝酸纤维素膜3上后会向两测层析，甚至样本耗尽并停留在硝酸纤维素膜3上，并通过延迟或满足预设条件后加入稀释液的方式，大大增加免疫反应时间(即样本与标记物之间的反应时间)，从而提高了检测灵敏度和精密度。
40.本发明通过稀释液注入后终止标记物继续释放的双孔结构设计，以及增加控制结合液量的定量标识线(m),控制进入硝酸纤维素膜3的样品与标记物免疫反应的复合液的量，可以提高猪伪狂犬抗体检测的敏感性和精密性。本发明通过样品液和稀释液分开加样的清洗方式，可改善样品液自清洗的清洗效率，以及硝酸纤维素膜3的背景洁净度，提高检测试剂的敏感性。
41.一种二合一猪伪狂犬抗体的检测方法，包括上述的快速检测卡，从加样孔加入样品液，当液迹到达定量标识线时，向清洗孔中加入稀释液，等待检测线和质控线免疫反应层析，最后通过视窗孔观测或通过仪器进行检测、判读结果。
42.实施例：
43.通过二合一伪狂犬抗体荧光快速检测卡的制作过程进行具体说明，
44.检测原理：采用双抗原夹心免疫反应法，镧系荧光微球做为标记示踪物。
45.(一)二合一伪狂犬病毒抗体检测卡的制备
46.步骤一，把硝酸纤维素膜粘贴在pvc底板上，采用点膜喷金专用机器在硝酸纤维素膜上喷涂已稀释至0.5mg/ml的羊抗鸡igy的igg形成质控线和已稀释至0.4mg/ml的伪狂犬病毒蛋白gb和0.5mg/ml的伪狂犬病毒结构蛋白gi的重组蛋白形成两条检测线，喷量为1μl/cm，然后在37℃的温度下烘制8小时；
47.步骤二，采用镧系荧光微球标记
48.采用镧系荧光微球标记标记鸡igy；将1ml的镧系荧光微球加入到50mg的mes(2
‑
(n
‑
吗啡啉)乙磺酸)缓冲液(0.1m，ph7.0)中，再加入10mg碳二亚胺(edc)和10mg n
‑
羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐搅拌溶解，室温反应30分钟后进行离心操作，将离心沉淀物用50mm硼酸缓冲液(ph8.2)复溶，加入2mg透析过的鸡igy，在室温条件下搅拌反应24小时，然后离心、封闭后，再在稀释液中保存(保存环境温度为2～8℃)，即得标记有鸡igy的镧系荧光微球；
49.采用上述同样的方法标记伪狂犬病毒蛋白gb和gi的重组抗原。
50.步骤三，把标记镧系荧光微球的鸡igy、标记镧系荧光微球的伪狂犬病毒gb和gi蛋白重组抗原，分别稀释至浓度0.1μg/ml、3μg/ml和3μg/ml并混合在一起，采用点膜喷金机器将其喷涂在载体基层上构成标记垫，喷量为2.5μl/cm，然后在37℃的温度下烘制8小时；
51.步骤四，把样品垫、标记垫、吸水纸依次粘在pvc底板上，组装成大卡，再用剪切机切割成5mm宽的试纸条，装配在检测卡外壳内，即得到本伪狂犬病毒抗体荧光检测卡。
52.(二)伪狂犬病毒抗体标准曲线的制备
53.配置一组梯度浓度的伪狂犬病毒gb和gi抗体的质控品，每份取50μl加人检测卡的加样孔、液迹流至定量标识线附近，取80μl稀释液加入检测卡的加样孔中，层析15分钟后，将检测卡放入高敏荧光分析仪进行检测。检测时，荧光仪发出激发光，逐点采集检测卡上的荧光信号强度值，经软件计算出检测卡上t线与c线的荧光强度比值，将不同浓度所对应检测t/c荧光比值分别进行线性回归做出伪狂犬病毒gb和gi抗体浓度——荧光值相关的《标准曲线》，并把计算得出的标准曲线形成一个文件，传到云平台并对应生成条形码，客户端通过扫描条形码可以从云平台提取该标准曲线。
54.制备伪狂犬病毒gb抗体的标准曲线：
55.用20份阴性血清，检测的t/c的平均值加2倍标准差值定为32效价值；另外含有猪伪狂犬抗体的质控品梯度稀释6份(4倍稀释)稀释样本液50微升分别加入装配好的双孔检测卡的中间加样孔内，待液迹流至定量标识线附近，取80μl稀释液加入检测卡的加样孔中，层析15分钟后，将检测卡放入高敏荧光分析仪进行检测。根据倍比稀释的浓度和相对应的t/c荧光比值，软件计算进行线性回归做出伪狂犬病毒gb抗体浓度和荧光值相关的《标准曲线》(图3)，并把计算得出的标准曲线形成一个文件，传到云平台并对应生成条形码，客户端通过扫描条形码可以从云平台提取该标准曲线。
56.同样的方法制备伪狂犬病毒gi抗体的标准曲线如图4。
57.(四)伪狂犬病毒抗体检测卡的使用
58.取新鲜待检样品(以某一阳性血清为例)，按实试例2加样方式加入40ul样品和80ul稀释液，免疫层析15min，然后用成都微瑞生物科技有限公司生产的wr
‑
1608型荧光分析仪对检测卡进行检测，获取检测线和质控线的荧光信号，荧光分析仪通过蓝牙把检测数据传到客户端，客户端根据检测数据计算出检测线的荧光信号强度值和质控线的荧光信号强度值，客户端通过扫描此批检测卡的条形码从云平台获得被检测伪狂犬病毒蛋白gb和gi
抗体标准曲线，再根据标准曲线与质控线和检测线的荧光信号强度值的对照关系计算得出待测样本中伪狂犬病毒蛋白gb和gi抗体的含量。
59.上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不限以限制于本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。