一种鉴别道地药材十堰连翘基源的方法

本发明涉及中药鉴定技术领域，具体涉及一种鉴别道地药材十堰连翘基源的方法。

背景技术：

十堰市位于秦岭大巴山东延余脉褶皱缓坡地带，天然药材资源丰富，是我国野生连翘的主产区，野生及种植面积达到10万亩，有多家中药饮片生产企业及农业合作社涉足种植，当地将野生连翘称之为“十堰连翘”，经中国科学院武汉植物园标本馆馆长胡光万鉴定为：木犀科oleaceae连翘属forsythia植物连翘forsythiasuspensa(thunb.)vahl(鉴定书编号：编号：hib-2018-008)。湖北中医药大学陈科力对送检野生连翘药材样品的基原鉴定为木犀科oleaceae连翘属forsythia植物连翘forsythiasuspensa(thunb.)vahl。

发明人在调查中发现，有企业和农户误将木犀科连翘属金钟花当成连翘，进行了大面积种植，导致本地有些连翘基原不符合《中国药典》对连翘来源的要求，严重影响道地药材十堰连翘的品质，对十堰连翘市场造成了不良影响。虽然连翘的鉴别方法较多，如生物指纹法、化学指纹法等，但主要是针对连翘共性的研究，而不是专门针对十堰连翘的研究，且这些鉴别方法操作较复杂，难以为当地企业及农户掌握，使得误种连翘事件时有发生。因此，有必要开发一种简单、易推广的鉴别道地药材十堰连翘基源的方法。该方法能普及到广大种植户，从源头上保证当地道地十堰连翘来源符合《中国药典》连翘来源的要求。

技术实现要素：

本发明针对现有技术中存在的技术问题，提供了一种鉴别道地药材十堰连翘基源的方法，该方法结合了植物形态特征鉴定和超高效液相色谱特征鉴定，首先通过优化连翘属植物分类检索表，用朴素简洁的语言及直观的图片强化连翘的形态特征，让普通种植户都能够快速确掌握连翘的鉴别要点，初步判断连翘原植物的真伪，仅对符合植物形态特征的待鉴定植物再通过超高效液相色谱特征鉴定进行进一步鉴定，提高鉴定的准确率。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

一种鉴别道地药材十堰连翘基源的方法，包括以下步骤：

植物形态鉴定，将待鉴定植物与木犀科oleaceae连翘属forsythia植物连翘forsythiasuspensa(thunb.)vahl不同生长阶段的照片进行比对，确认待鉴定植物是否具有以下植物形态特征：

(1)嫩枝有单叶三裂至三出复叶；

(2)沿小枝节间纵向劈开，节间茎髓中空；

(3)花萼与花冠管近等长；

(4)果实长卵形有多数凸起的小斑点；

如待鉴定植物不符合上述植物形态特征任一项，则可判断为不是道地十堰连翘；

如待鉴定植物符合上述植物形态特征，再进行超高效液相色谱谱图特征鉴定，包括以下步骤：

制取待鉴定植物叶子的供试品溶液和十堰连翘叶子对照品溶液；

对所述供试品溶液和十堰连翘对照品溶液进行超高效液相色谱检测；

以连翘对照品溶液的超高效液相色谱图作为指纹图谱，将供试品超高效液相色谱图与指纹图谱进行对比，若供试品图谱中出现了连翘酯苷b、连翘酯苷a、连翘苷和槲皮素的特征峰，则认为供试品符合超高效液相色谱特征；

同时符合植物形态特征和超高效液相色谱特征的即可鉴定为道地药材十堰连翘基源。

在其中一个实施例中，所述待鉴定植物叶子的供试品溶液的制备方法包括以下步骤：所述待鉴定植物叶子的供试品溶液的制备方法包括以下步骤：

将连翘叶子粉碎成细粉，精密称定1g细粉加入到50ml具塞锥形瓶中，精密加入50％-70％甲醇15ml，称定重量，浸渍过夜，超声处理25min，放冷后再称定重量，用甲醇补足所失重量，摇匀，过滤；

精密量取续滤液5ml，置于坩埚中蒸至近干，加入0.5g中性al2o3拌匀烘干，加在中性al2o3柱上(100目～120，1g，内径为1cm～1.5cm)，用80ml的70％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩至干，残渣用50％的甲醇溶解置于5ml容量瓶中，定容，摇匀，离心，取上层清液既得供试品溶液；用同样方法配制出连翘对照品溶液。

在其中一个实施例中，供试品溶液和连翘对照品溶液的超高效液相色谱条件为：采用vanguard预柱和acquityuplcbehc18柱；柱温：35℃；检测波长235nm，流速：0.3ml/min-1ml/min；进样量1μl-2μl，采用流动相a及流动相b进行梯度洗脱，所述流动相a为0.2％的甲酸溶液，流动相b为乙腈，梯度洗脱条件为：0min～15min，90％～70％a；15min～25min，70％～30％a。

有益效果：

首先通过待鉴定植物的叶、茎、花、果植物形态初步鉴定出种植的连翘是否为道地十堰连翘基源，如不符合植物形态鉴定，则可确定种植的不是道地十堰连翘，鉴定方法快速，简便。

对符合植物形态鉴定的植株，再结合超高效液相色谱进行进一步的鉴定，准确率高。

附图说明

图1为道地十堰连翘不同生长阶段图片：1a为幼苗期嫩叶图片；1b为成熟期连翘茎图片；1c为花期连翘花图片；1d为结果期果实图片；

图2为实施例2、3中待鉴定植物叶子的超高效液相色谱图谱。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

若未特别指明，本发明实施例中所用的实验试剂和材料等均可市售获得。

若未具体指明，本发明实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。

十堰连翘在植物形态上和其它产地的连翘并没有差别，但在某些活性成分上，有其独特的特征，为准确鉴别十堰连翘提供了依据。

通过优化连翘叶的提纯方法和超高效液相色谱的色谱条件，确定了如下的提纯方法和超高效液相色谱的色谱条件：

将连翘叶粉碎成细粉，精密称定1g细粉加入到50ml具塞锥形瓶中，精密加入50％-70％甲醇15ml，称定重量，浸渍过夜，超声处理25min，放冷后再称定重量，用甲醇补足所失重量，摇匀，过滤；

精密量取续滤液5ml，置于坩埚中蒸至近干，加入0.5g中性al2o3拌匀烘干，加在中性al2o3柱上(100目～120，1g，内径为1cm～1.5cm)，用80ml的70％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩至干，残渣用50％的甲醇溶解置于5ml容量瓶中，定容，摇匀，离心，取上层清液既得供试品溶液；用同样方法配制出连翘对照品溶液。

采用vanguard预柱和acquityuplcbehc18柱；柱温：35℃；检测波长235nm，流速：0.3ml/min-1ml/min；进样量1μl-2μl，采用流动相a及流动相b进行梯度洗脱，所述流动相a为0.2％的甲酸溶液，流动相b为乙腈，梯度洗脱条件为：0min～15min，90％～70％a；15min～25min，70％～30％a。

研究了在同等条件下，山西临汾、陕西省商洛、河南省洛阳几种产地的超高效液相色谱指纹图谱，其特征峰分别对应图2中s2、s3、s4，从图中可以看出，在同等条件下，十堰连翘出现了连翘酯苷b、连翘酯苷a、连翘苷和槲皮素的四个特征峰，而其它几个产地的连翘的高效液相色谱图中，基本没有出现连翘酯苷b的特征峰。因此，以在该提纯条件和色谱条件下，超高效液相色谱图中是否同时出现连翘酯苷b、连翘酯苷a、连翘苷和槲皮素的四个特征峰也作为判断道地十堰连翘的一个判断指标。

判断种植的植物是否为道地十堰连翘基源的方法结合了植物形态特征判断和超高效液相色谱特征判断。如果不符合植物形态特征，即可判断出不是道地十堰连翘基源。在符合植物形态特征的基础上，也符合其超高效液相色谱特征，就可鉴定为道地十堰连翘基源。在符合植物形态特征的基础上，如果不符合其超高效液相色谱特征，也可鉴定为不是道地十堰连翘基源。

实施例1

本实施例提供了一种鉴别道地药材十堰连翘基源的方法，包括以下步骤：

对照图1图片进行待鉴定植物的植物形态特征比对，待鉴定植物植物形态特征包括(1)嫩枝有单叶，无复叶；(2)沿小枝节间纵向劈开，节间茎髓中空；(3)花萼与花冠管近等长。不符合道地十堰连翘植物形态特征中(1)嫩枝有单叶三裂至三出复叶，可快速鉴定出该植物不是道地药材十堰连翘基源。

实施例2

本实施例提供了一种鉴别道地药材十堰连翘基源的方法，包括以下步骤：

s1，对照图1图片进行待鉴定植物的植物形态特征比对，未出现不符合道地十堰连翘植物形态特征。

s2，进行超高效液相色谱特征鉴定，包括以下步骤：

s21，将待鉴定植物嫩叶样品粉碎成40目的细粉，称取1.015g细粉加入到50ml具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇15ml，称定重量，浸渍过夜，超声处理25min，放冷后再称定重量，用甲醇补足所失重量，摇匀，过滤；精密量取续滤液5ml，置于坩埚中蒸至近干，加入0.5g中性al2o3拌匀烘干，加在中性al2o3柱上(100～120目，1g，内径为1cm)，用80ml的70％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩至干，残渣用50％的甲醇溶解置于5ml容量瓶中，定容，摇匀，离心，取上层清液既得供试品溶液。

用相同方法可制得连翘对照品溶液。

s22，进行超高效液相色谱检测，供试品溶液和连翘对照品溶液的超高效液相色谱条件为：采用vanguard预柱和acquityuplcbehc18柱；柱温：35℃；检测波长235nm，流速：0.3ml/min；进样量2μl，采用流动相a及流动相b进行梯度洗脱，所述流动相a为0.2％的甲酸溶液，流动相b为乙腈，梯度洗脱条件为：0～15min，90％a；15～25min，70％a。

对供试品溶液测得的超高效液相色谱图谱，见图2。其中图谱s1为本实施例的图谱(由于对照品谱图和本实施例中的谱图高度吻合，故未将其谱图示出)，从s1中可以看出，图中出现了谱峰1连翘酯苷b、谱峰2连翘酯苷a、谱峰3连翘苷和谱峰4槲皮素的特征峰，则可鉴定出该植物为道地十堰连翘基源。

实施例3

本实施例提供了一种鉴别道地药材十堰连翘基源的方法，包括以下步骤：

s1，对照图1中图片进行待鉴定植物的植物形态特征比对，均符合道地十堰连翘植物形态特征。

s2，进行超高效液相色谱特征鉴定，包括以下步骤：

s21，将待鉴定植物果实期的叶子样品粉碎成40目的细粉，称取1.015g细粉加入到50ml具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇15ml，称定重量，浸渍过夜，超声处理25min，超声频率为，放冷后再称定重量，用甲醇补足所失重量，摇匀，过滤；精密量取续滤液5ml，置于坩埚中蒸至近干，加入0.5g中性al2o3拌匀烘干，加在中性al2o3柱上(100～120目，1g，内径为1.5cm)，用80ml的70％乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩至干，残渣用50％的甲醇溶解置于5ml容量瓶中，定容，摇匀，离心，取上层清液既得供试品溶液。

用相同方法可制得连翘对照品溶液。

s22，进行超高效液相色谱检测，供试品溶液和连翘对照品溶液的超高效液相色谱条件为：采用vanguard预柱和acquityuplcbehc18柱；柱温：35℃；检测波长235nm，流速：1.0ml/min；进样量1μl，采用流动相a及流动相b进行梯度洗脱，所述流动相a为0.2％的甲酸溶液，流动相b为乙腈，梯度洗脱条件为：0～15min，70％a；15～25min，30％a。

对供试品溶液测得的超高效液相色谱图谱见图2，其中s5为本实施例测得的图谱，图中未出现连翘酯苷b和槲皮素的特征峰，则可鉴定出该植物不是道地十堰连翘基源。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。