心梗诊断生物标志物及其应用

1.本发明涉及心梗诊断生物标志物及其应用。


背景技术：

2.全球每年有超过四分之一的人死于心血管疾病(cardiovascular disease,cvd)。简单来说，cvd是由于心脏和血管的病变造成的。其中，由心脏及血液循环中的病变所导致的供血不足被称为缺血性心脏病(ischaemic heart disease)，如冠心病(coronary heart disease,chd)，心肌梗塞(myocardialinfarction,mi)。而由心脏、大脑及血管系统共同引发的缺血性疾病被称为心脑血管疾病(cerebrovascular diseases,cbd)，如中风(ischaemic stroke)。临床上，心血管疾病的主要死亡原因由缺血性心脏病(42.5％)及心脑血管疾病(35.5％)组成，它们几乎占了80％的比例。心血管疾病的发病原因有很多，如生活习惯、饮食习惯、吸烟、高血压、高血脂、糖尿病等。其中，动脉粥样硬化(atherosclerosis)是心血管疾病的病变基础及主要病因。综合来说，它的形成有两个重要原因:1)血管中内皮细胞、巨噬细胞、平滑肌细胞等的功能缺陷所引起的炎性反应。2)胆固醇代谢紊乱所引起的低密度脂蛋白(low density lipoprotein,ldl)在血管内皮的沉积。伴随着二者的共同影响及机体中存在的氧化应激反应，最终导致血管内部斑块的积累、狭窄、破裂，从而引发心血管疾病乃至心梗。
3.心血管疾病的发生发展是一个慢长的过程，因此，早期的发现并且进行治疗是很关键的。cvd疾病的临床治疗主要包括生活习惯的改变，药物治疗及手术治疗。在疾病早期，除了配合使用各类药物外，还需要多运动、降低胆固醇的摄入量、戒烟戒酒。而疾病中后期，除了以上方法，手术的介入是必不可少的，经皮冠状动脉介入治疗(pci)及冠脉搭桥术(cabg)是主要形式。前者适用于稳定及不稳定心绞痛患者和心梗患者，越早介入越好。后者危险性较大，适用于病变严重的患者。心血管疾病的临床治疗药物有很多种。其中，他汀类是主要的降血脂药物，它是胆固醇合成酶的抑制剂。
4.心血管异常(例如冠心病)是心梗发病的主要因素。在冠心病期间，目前仍然无法预测和判断患者是否会发展为心梗。由此可见，找到可以通过血检直接判断和预测心血管疾病患者是否已发生或者具有较高风险发生心梗的生物标志物具有很重要的临床意义。


技术实现要素：

5.本发明提供新的心梗诊断生物标志物。本发明的心梗诊断生物标志物包括精氨酸，乙酰肉碱，次黄嘌呤。
6.具体而言，本发明提供一种心梗诊断方法，所述方法包括检测对象血清中精氨酸，乙酰肉碱，次黄嘌呤的步骤。
7.在一个或多个实施方案中，采用质谱检测对象血清中精氨酸，乙酰肉碱，次黄嘌呤的浓度。
8.在一个或多个实施方案中，血清体积为50微升。
9.在一个或多个实施方案中，检测得到精氨酸，乙酰肉碱，次黄嘌呤的血清浓度后，将所述浓度代入下式：
10.判定阈值＝-2.43-0.0000005961
×
m1+0.0000029616
×
m2+0.0000000103
×
m3
11.其中，m1表示精氨酸的离子响应丰度与内标的比值；m2表示乙酰肉碱的离子响应丰度与内标的比值；m3表示次黄嘌呤的离子响应丰度与内标的比值。
12.其中，若判定阈值小于等于0.53，则诊断患有心梗或患上心梗的风险相对较低；若判定阈值大于0.53，则诊断患有心梗或患上心梗的风险相对较高。
13.本发明还提供精氨酸，乙酰肉碱，次黄嘌呤作为生物标志物在心梗诊断中的应用。
14.在一个或多个实施方案中，所述诊断包括：检测得到精氨酸，乙酰肉碱，次黄嘌呤的血清浓度后，将所述浓度代入下式：
15.判定阈值＝-2.43-0.0000005961
×
m1+0.0000029616
×
m2+0.0000000103
×
m3
16.其中，m1表示精氨酸的离子响应丰度与内标的比值；m2表示乙酰肉碱的离子响应丰度与内标的比值；m3表示次黄嘌呤的离子响应丰度与内标的比值。
17.在一个或多个实施方案中，若判定阈值小于等于0.53，则诊断患有心梗或患上心梗的风险相对较低；若判定阈值大于0.53，则诊断患有心梗或患上心梗的风险相对较高。
18.本发明还提供用于精氨酸，乙酰肉碱，次黄嘌呤的检测的试剂在制备心梗诊断试剂盒中的应用。
19.在一个或多个实施方案中，所述试剂是采用质谱检测所述精氨酸，乙酰肉碱，次黄嘌呤所需的试剂。
20.在一个或多个实施方案中，所述试剂为质谱检测所用的流动相，包括流动相a和流动相b。
21.在一个或多个实施方案中，所述试剂包括流动相a中的nh4oh、nh4oac和流动相b中的乙腈。
22.在一个或多个实施方案中，所述试剂还包括从血清中分离出血清所含蛋白质的试剂。
23.在一个或多个实施方案中，所述从血清中分离出血清所含蛋白质的试剂为甲醇。
24.本发明还提供一种诊断试剂盒，其含有nh4oh、nh4oac和乙腈(acn)。
25.在一个或多个实施方案中，所述nh4oh、nh4oac和乙腈(acn)各自独立包装。
26.在一个或多个实施方案中，所述诊断试剂盒含有nh4oh和nh4oac的水溶液，以及含有乙腈的溶液。
27.在一个或多个实施方案中，所述试剂还包括从血清中分离出血清所含蛋白质的试剂。
28.在一个或多个实施方案中，所述从血清中分离出血清所含蛋白质的试剂为甲醇。
29.在一个或多个实施方案中，所述含有nh4oh和nh4oac的水溶液中，nh4oh和nh4oac的浓度各自为15-50mm，优选为20-30mm，所述含有乙腈的溶液为纯乙腈。
30.本发明还提供一种计算机可读存储介质，其上存储有计算机程序，该程序被处理器执行时计算得到下述判定阈值：
31.判定阈值＝-2.43-0.0000005961
×
m1+0.0000029616
×
m2+0.0000000103
×
m3
32.其中，m1表示精氨酸的离子响应丰度与内标的比值；m2表示乙酰肉碱的离子响应
丰度与内标的比值；m3表示次黄嘌呤的离子响应丰度与内标的比值。
33.在一个或多个实施方案中，该程序被处理器执行时还实现以下步骤：判定该判定阈值是否小于等于0.53，如果小于等于0.53，则得出对象患有心梗或患上心梗的风险相对较低的诊断结果；如果大于0.53，则得出对象患有心梗或患上心梗的风险相对较高的诊断结果。
34.本发明还提供一种装置，所述装置包括输入装置和计算装置，其中，所述输入装置用于输入精氨酸，乙酰肉碱，次黄嘌呤的离子响应丰度；所述计算装置用于根据所输入的离子响应丰度用下述式子计算判定阈值，并根据计算得到的判定阈值给出对象是否患有心梗的结论：
35.判定阈值＝-2.43-0.0000005961
×
m1+0.0000029616
×
m2+0.0000000103
×
m3
36.其中，m1表示精氨酸的离子响应丰度与内标的比值；m2表示乙酰肉碱的离子响应丰度与内标的比值；m3表示次黄嘌呤的离子响应丰度与内标的比值。
37.其中，若判定该判定阈值小于等于0.53，则得出对象患有心梗或患上心梗的风险相对较低的诊断结果；若大于0.53，则得出对象患有心梗或患上心梗的风险相对较高的诊断结果。
38.本发明还提供一种计算机设备，包括存储器、处理器及存储于该存储器上并可在处理器上运行的程序，其中，所述处理器执行所述程序时执行以下步骤：
39.(1)根据下式计算得到判定阈值：
40.判定阈值＝-2.43-0.0000005961
×
m1+0.0000029616
×
m2+0.0000000103
×
m3
41.其中，m1表示精氨酸的离子响应丰度与内标的比值；m2表示乙酰肉碱的离子响应丰度与内标的比值；m3表示次黄嘌呤的离子响应丰度与内标的比值。
42.(2)根据计算得到的判定阈值获得诊断结果，其中，若判定该判定阈值小于等于0.53，则得出对象患有心梗或患上心梗的风险相对较低的诊断结果；若大于0.53，则得出对象患有心梗或患上心梗的风险相对较高的诊断结果。
43.本发明还提供一种同时检测对象血清中精氨酸，乙酰肉碱，次黄嘌呤的方法，所述方法包括采用质谱方法同时检测对象血清中精氨酸，乙酰肉碱，次黄嘌呤，获得精氨酸，乙酰肉碱，次黄嘌呤各自的离子响应丰度。
附图说明
44.图1显示最小绝对收缩和选择算子(lasso)回归筛选最佳代谢物组合。
45.图2是三种代谢物作为生物标志物进行roc分析，发现auc在训练集和测试数据集中分别为0.92和0.88，说明区分效果很好。
具体实施方式
46.应理解，在本发明范围中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成优选的技术方案。
47.本发明利用基于质谱技术的代谢组学，找出心梗病人特异的生物标志物，从而为疾病提供早期诊断和精准分型的标准和重要依据。
48.发明人收集了156个心梗和冠心病人的血清，其中心梗病人73个，其他冠心疾病患
者83个，使用目前为止最先进的非靶标代谢组学进行研究，最终通过基于机器学习的算法找到了3种可以准确区分和预测心梗和冠心病人的生物标志物。具体而言，本发明发现，精氨酸，乙酰肉碱，次黄嘌呤可作为心梗的特异性诊断生物标志物。可通过检测对象血清中精氨酸，乙酰肉碱，次黄嘌呤的浓度来诊断对象是否患有心梗或患上心梗的风险高低。
49.通常，可采用质谱方法来检测对象血清中的精氨酸，乙酰肉碱，次黄嘌呤的离子响应丰度。例如，可获得对象的外周血，采用常规方法分离获得血清。之后，可去除血清中的蛋白质。除去血清中的蛋白质的方法包括但不限于：盐析，有机溶剂沉淀以及调节ph等。例如，可使用中性盐如醋酸铵使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀。或者，可使用极性有机溶剂降低介电常数使蛋白质凝集沉淀，常用的有机溶剂包括醇类有机溶剂，如1-4个碳原子的一元醇如甲醇和乙醇，还包括丙酮、乙腈等。在某些实施方案中，也可使用磺基水杨酸沉淀蛋白质。使用磺基水杨酸时，需调节ph值，使之低于血清蛋白的pi值，使蛋白质带正电荷，从而与水杨酸酸根结合生成不溶盐而沉淀。由于血清蛋白质均带负电荷，因此，将血清的ph调节到血清蛋白的最低等电点以下。如血清白蛋白的等电点为4.7-4.9，因此可把ph调到4.7以下，可实现蛋白质沉淀和分离。
50.将血清中的蛋白质沉淀后，获得上清，即可进行质谱检测。可采用本领域周知的质谱技术进行检测。在本发明的实施方案中，采用tof质谱仪进行质谱检测。色谱柱可采用常规的色谱柱，如质谱公司提供的色谱柱。可根据不同的色谱柱选用不同的流动相。例如，在本发明的实施方案中，本发明使用的流动相中的a相为nh4oh和nh4oac的水溶液，b相为纯乙腈溶液。更具体而言，a相的水溶液中，nh4oh和nh4oac的浓度各自可为15-50mm，优选可为20-30mm，如25mm。在本发明的实施方案中，流动相的梯度可如下表所示：
51.时间a％b％流速(ml/min)05950.50.55950.5735650.5860400.5960400.59.15950.5125950.5
52.其它的质谱操作可按操作手册实施。由此可获得精氨酸，乙酰肉碱，次黄嘌呤的离子响应丰度。
53.本发明方法还可包括使用质谱检测内标的步骤。所述内标可为血清中任何可用作参照标准的物质。本文示例性的内标是肌苷-15
n4。为了进行质谱检测，将肌苷-15n4溶于提取溶剂例如前述有机溶剂中，形成浓度为0.5-5ug/ml的溶液。常用的有机溶剂包括醇类有机溶剂，如1-4个碳原子的一元醇如甲醇和乙醇，还包括丙酮、乙腈等。在一实施例中，将肌苷-15
n4溶于提取溶剂甲醇中，形成浓度为1ug/ml的肌苷-15
n4的甲醇溶液。使用检测葫芦巴碱、花生四烯酸、甜菜碱、甘胆酸、吡哌酸、十四烷酸和尿嘧啶的离子响应丰度的相同流动相和操作进行质谱检测，得到肌苷-15
n4的离子响应丰度。
54.之后，可将上述离子响应丰度代入下式，计算得到判定阈值：
55.判定阈值＝-2.43-0.0000005961
×
m1+0.0000029616
×
m2+0.0000000103
×
m3
56.其中，m1表示精氨酸的离子响应丰度与内标的比值；m2表示乙酰肉碱的离子响应丰度与内标的比值；m3表示次黄嘌呤的离子响应丰度与内标的比值。
57.若判定阈值大于0.53，则可得出对象患有心梗或患上心梗风险相对较高的结论；若判定阈值小于等于0.53，则可得出对象患有心梗或患心梗相对较低的结论。
58.本发明还提供一种计算机可读存储介质，其上存储有计算机程序，该程序被处理器执行时计算得到下述判定阈值：
59.判定阈值＝-2.43-0.0000005961
×
m1+0.0000029616
×
m2+0.0000000103
×
m3
60.其中，m1表示精氨酸的离子响应丰度与内标的比值；m2表示乙酰肉碱的离子响应丰度与内标的比值；m3表示次黄嘌呤的离子响应丰度与内标的比值。
61.优选地，该程序被处理器执行时还实现以下步骤：判定该判定阈值是否小于等于0.53，如果小于等于0.53，则得出对象患有心梗或患心梗相对较低的诊断结果；如果大于0.53，则得出对象患有心梗或患上心梗风险相对较高的诊断结果。
62.本发明还提供一种装置，所述装置包括输入设备和计算设备，其中，所述输入装置用于输入精氨酸，乙酰肉碱，次黄嘌呤的离子响应丰度；所述计算装置用于根据所输入的离子响应丰度用下述式子计算判定阈值，并根据计算得到的判定阈值给出对象是否患有心梗的结论：
63.判定阈值＝-2.43-0.0000005961
×
m1+0.0000029616
×
m2+0.0000000103
×
m3
64.其中，m1表示精氨酸的离子响应丰度与内标的比值；m2表示乙酰肉碱的离子响应丰度与内标的比值；m3表示次黄嘌呤的离子响应丰度与内标的比值。
65.其中，若判定该判定阈值小于等于0.53，则得出对象患有心梗或患心梗相对较低的诊断结果；若大于0.53，则得出对象患有心梗或患上心梗风险相对较高的诊断结果。在某些实施方案中，所述装置还包括输出设备，用以将诊断结果输出；该输出设备可以是，例如显示器或打印设备。
66.本发明还提供一种计算机设备，包括存储器、处理器及存储于该存储器上并可在处理器上运行的程序，其中，所述处理器执行所述程序时执行以下步骤：
67.(1)根据下式计算得到判定阈值：
68.判定阈值＝-2.43-0.0000005961
×
m1+0.0000029616
×
m2+0.0000000103
×
m3
69.其中，m1表示精氨酸的离子响应丰度与内标的比值；m2表示乙酰肉碱的离子响应丰度与内标的比值；m3表示次黄嘌呤的离子响应丰度与内标的比值。
70.(2)根据计算得到的判定阈值获得诊断结果，其中，若判定该判定阈值小于等于0.53，则得出对象患有心梗或患心梗相对较低的诊断结果；若大于0.53，则得出对象患有心梗或患上心梗风险相对较高的诊断结果。
71.本发明还提供精氨酸，乙酰肉碱，次黄嘌呤作为生物标志物在心梗诊断中的应用，以及在制备用于检测它们以诊断心梗的试剂或试剂盒中的应用。本发明还提供检测精氨酸，乙酰肉碱，次黄嘌呤所需的试剂在制备心梗诊断试剂盒中的应用。所述试剂可以是采用质谱检测所述精氨酸，乙酰肉碱，次黄嘌呤所需的试剂。例如，所述试剂可以是质谱检测时所用到的流动相。在某些实施方案中，所述流动相试剂包括nh4oh、nh4oac和乙腈(acn)。在某些实施方案中，所述流动相分为a相和b相，a相为nh4oh和nh4oac的水溶液，优选地，nh4oh和nh4oac各自的浓度为15-50mm，优选可为20-30mm，如25mm；所述b相为acn。优选地，所述检测
精氨酸，乙酰肉碱，次黄嘌呤所需的试剂还包括从血清中分离出血清所含蛋白质的试剂，如采用盐析、有机溶剂沉淀和/或调节ph的方法除去蛋白质所需的试剂，如醇类试剂、盐等。在某些实施方案中，所述醇类试剂为甲醇。
72.应理解的是，本发明所述的患心梗风险高低是相对于而言的。若患者检出的判定阈值小于等于0.53，则表明该患者不患有心梗，或只有轻度疾病(例如冠心病)，或相对于判定阈值大于0.53的对象而言患有心梗的风险低。在患者检出的判定阈值大于0.53、但患者并未表现出心梗症状时，可根据需要结合本领域常规的其它心梗检测手段进行检测。
73.此外，本发明上述计算公式和阈值是在使用50μl血清样品的基础上获得的。因此，当使用的血清样品量不一样时，上述计算公式的系数和阈值会不同，但可由本领域技术人员根据本技术说明书公开的方法容易确定相应的系数和阈值。
74.下文将以具体实施例的方式阐述本发明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，并非用于限制本发明的保护范围。实施例中所用到的方法和试剂，除非另有说明，否则均为本领域常规的方法和试剂。
75.实施例
76.实施例1、样品准备
77.从医院获得156份心梗和其他冠心病人血液样品，按照如下方法提取代谢物(所有操作均在冰上进行)：
78.1)：用排枪或自动进样器吸取50ul血清样品到96孔板中；
79.2)：每个孔中加入溶油内标的150ul冰甲醇；
80.3)：盖紧贴膜，斡旋30s，4℃，4000rpm离心20min；
81.4)：离心完毕用排枪或自动进样器吸取100ul上清加入对应的样品瓶中；
82.质控的制备
83.取出所有样品，待样品在冰上融化以后，震荡混匀，从每个样品中取10ul混匀，作为质控，制备完成后取50ul，跟随其他样品同步前处理。
84.实施例2、数据采集
85.(1)液相方法：
86.仪器：岛津nexera uhplc lc-30a
87.流动相：a：25mm nh4oh+25mm nh4oac+h2o；
88.b：100％acn；
89.色谱柱：waters beh 2.1*100mm，1.7um；
90.进样量：2ul；
91.液相流速：0.5ml/min；
92.分子量范围：60-1200；
93.梯度如下表：
94.[0095][0096]
(2)质谱方法
[0097]
①
dda(data dependent acquire)数据依赖性采集
[0098]
仪器：ab triple tof 6600
[0099]
参数设置：
[0100]
(1)离子源参数设置：
[0101]
gas1气体1：60
[0102]
gas2气体2：60
[0103]
cur帘气：30
[0104]
温度：650℃
[0105]
isvf源内电压：5000(正离子)，-4000(负离子)
[0106]
dp去簇电压：60
[0107]
(2)tof ms扫描参数设置
[0108]
分子量范围：60-1200
[0109]
累积时间(accumulation time)：150ms
[0110]
ce碰撞能量：10
[0111]
q1传送窗(transmission window)
[0112]
分子量(da)
ꢀꢀꢀꢀ
％
[0113]
70.000
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
33
[0114]
120.000
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
33
[0115]
280.000
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
34
[0116]
分子量自动调节：uncheck
[0117]
动态背景扣除：check。
[0118]
(3)产物离子扫描参数设置
[0119]
分子量范围：25-1200
[0120]
累积时间：30ms
[0121]
ce：30
[0122]
q2传送窗
[0123]
分子量(da)
ꢀꢀꢀꢀ
％
[0124]
15.000
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
50
[0125]
60.000
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
50
[0126]
分子量自动调节：核实(check)
[0127]
分辨率：unit
[0128]
转换标准：
[0129]
带电荷状态：1到1
[0130]
超出(which exceeds)：100cps
[0131]
同位素去除：4da
[0132]
质量轴偏差：10ppm
[0133]
每轮监控的候选物离子的最大数量：12
[0134]
排除前期的目标离子：出现2次后，4秒
[0135]
(4)自动采样参数
[0136]
注射器尺寸：20(ul)
[0137]
注射体积：2ul
[0138]
吸取速度：20
[0139]
注射速度：100
[0140]
针规格：0
[0141]
温度控制：4℃
[0142]
洗涤细节：
[0143]
洗涤位置：冲洗孔
[0144]
洗涤次数：5次自动延迟量减少(automatic delay volume reduction)：
[0145]
启用(enabled)：核实(check)
[0146]
样本清洗因素：5
[0147]
平衡时间：5
[0148]
进样瓶底部探测：为核实(uncheck)
[0149]
(5)柱温箱参数设置
[0150]
左温度：25℃
[0151]
右温度：25℃
[0152]
温度耐受：2℃
[0153]
温度误差：5℃。
[0154]
②
仪器矫正
[0155]
每十个小时矫正一次，走一针矫正液，不通过则需要就行质量轴矫正。矫正液为质谱公司标配的矫正液。
[0156]
矫正方法按照质谱公司的标配方法进行。下文给出了示例性的矫正方法(metabolomics_amide 12min_calibration法)：
[0157]
(a)lc参数如下表：
[0158]
时间a％b％流速(ml/min)05950.50.460400.5260400.52.15950.555950.5
[0159]
(b)质谱参数如下设置
[0160]
正离子模式：
[0161]
tof ms扫描参数：累积时间为0.25s，dp为80；
[0162]
产物离子扫描参数：产物分子量为609.2807，累积时间为0.1s，ce为45；
[0163]
负离子模式：
[0164]
tof ms扫描参数：累积时间为0.25s，dp为80；
[0165]
产物离子扫描参数：产物分子量为403.1121，累积时间为0.1s，ce为45。
[0166]
其它参数与数据采集方法相同。
[0167]
实施例3、结果
[0168]
所得结果如附图所示。图1使用最小绝对收缩和选择算子(lasso)回归算法进行变量选择，最后筛选到3种代谢物。图2使用roc分析，得出计算公式和阈值0.53，即：
[0169]
判定阈值＝-2.43-0.0000005961
×
m1+0.0000029616
×
m2+0.0000000103
×
m3
[0170]
其中，m1表示精氨酸的离子响应丰度与内标的比值；m2表示乙酰肉碱的离子响应丰度与内标的比值；m3表示次黄嘌呤的离子响应丰度与内标的比值。
[0171]
该判定阈值是由模型计算得出。
[0172]
结果显示，156份样品中，获自73个心梗患者的样品中有52个样品的判定阈值都大于0.53，而获自83个其他冠心病患者的样品中有77个样品的判定阈值都小于0.53。根据图2，三种代谢物作为生物标志物的auc在训练集和测试数据集中分别为0.92和0.88，说明区分效果很好。