一种快速检测莪术质量的检测模型及方法

本发明属于中药材检测技术领域，具体涉及一种快速检测莪术质量的检测模型及方法。

背景技术：

莪术在中国作为传统的活血化瘀药用于中医临床已有上千年的历史。目前，市面上存在生莪术制成的饮片和经过醋炮制得到的醋莪术产品，长期的临床用药实践结果表明，生莪术活血化瘀能力强于醋莪术，但是有时也存在个别醋莪术活血能力强于生莪术，这种不规律的质量情况源于植物生长中环境、年份等因素的影响，同时也受到植物本身种质的影响。然而，莪术活血效果源自多种活性，医生在开具处方的过程中通常根据药材重量控制给药量，这是基于一个理想的前提——每一份药材的生物活性是相同的。事实往往并非如此，由于药材炮制工艺和植株个体间差异，每一份药材的生物活性是不同的。

现行的方法是抽取同批次药材中的几个代表整体批次，以其中几个化合物的含量作为质量控制的标准。然而这种方法仍然存在问题，一是同批次药材之间仍然存在差异，抽样无法代表整体；二是该方法费时费力，且对医生开具处方没有帮助，药材中对同一靶标作用的活性物质基础通常是多个，检测的几种化合物并不一定能够代表药材真正的生物活性。因此，建立一种能够在线快速无损检测每一份药材生物活性指标的方法是推进中医药现代化发展的关键。

凝血酶(fⅱa)是凝血通路的关键酶，它直接作用于血液凝固过程的最后一步，促使血浆中的可溶性纤维蛋白原转变成不溶的纤维蛋白，从而达到速效止血的目的。探究莪术对该酶的抑制活性能很好地体现莪术的活血能力。过氧化脂质是引起中医“气滞血瘀”证的关键因素之一，它和自由基一起会损伤血管内皮细胞，引起血小板聚集，从而引起中医所说的“癥瘕痞块”和“血瘀”。因此，测定莪术的凝血酶抑制能力和抗氧化能力，对全面评价莪术“活血化瘀”能力有重要意义。

目前，测定凝血酶抑制活性的方法有很多，常用的主要有发色底物法和滴定法，抗氧化能力测试需要借助酶标仪检测。这些方法都是基于实验室环境的，需要专业技术和仪器，不利于其广泛地应用。此外，这些检测技术需要复杂的样品制备和重复性好的提取条件，这导致这些指标的检测可能重现性较差。

手提便携式近红外光谱仪(micro-nir)是一种非常便携的光学设备，只有手机大小，且可以通过蓝牙连接手机完成户外或者各种类似场景的近红外光谱获取，所得数据可以通过网络上传至服务器，快速，在线地得到各种定性定量结果，且检测时间仅需数秒，价格大幅降低。目前关于手提便携式近红外光谱仪的应用包括对天然产物含量的定量测试和食品风味的预测等。若能够将手提便携式近红外光谱仪用于莪术药材的生物活性的检测，则能够很好地解决上述问题。

手提便携式近红外光谱仪成本低，价格仅为台式近红外光谱仪的1/20，且操作简便，不受限于实验室环境，这对发展近红外光谱技术在中药质量检测的应用是至关重要的。然而，相比较于成熟的台式近红外光谱仪，手提便携式近红外光谱仪采集光谱的范围较窄，且采样点数少，导致光谱分辨率的下降，即，针对莪术药材样品，即使用手提便携式近红外光谱仪采集得到其低分辨的红外光谱，检测人员仍然无法确定这些谱线与莪术药材的抗凝血效果和自由基清除效果有何关联，进而无法根据这些谱线判断莪术药材生物活性。

技术实现要素：

针对现有技术的困难，本发明提供一种快速检测莪术质量的检测模型及方法，其目的在于：探究出最适的预处理方法去除噪音，最适的特征选择方法保留最重要的相关波段数据，最大程度保留了目的信息，实现了目标指标的准确检测模型的建立。进而实现利用手提便携式近红外光谱仪采集到的红外光谱预测莪术的生物活性参数。

一种快速检测莪术质量的检测模型，它是通过检测莪术的红外光谱曲线对莪术的生物活性参数进行预测，所述生物活性参数为凝血酶抑制率、abts的清除率或dpph的清除率。

优选的，该检测模型的构建方法包括如下步骤：

(1)测试莪术样品的红外光谱曲线和生物活性参数；

(2)将步骤(1)的得到的红外光谱曲线和生物活性参数构成训练集和预测集；

(3)使用kennarda-stone算法，基于步骤(2)得到的训练集和预测集建立莪术生物活性参数的检测模型。

优选的，步骤(1)中，所述莪术样品为生莪术或醋莪术的干燥粉末或提取物。

优选的，步骤(1)中，所述红外光谱曲线通过手提便携式近红外光谱仪采集，采谱的范围为950-1650nm。

优选的，所述手提便携式近红外光谱仪在950-1650nm范围内采集的数据点数为228个。

优选的，所述红外光谱曲线通过如下步骤获得：

(a)对莪术样品进行红外光谱测试，得到原始光谱数据；

(b)对所述原始光谱数据进行平滑处理；

(c)对步骤(b)得到的平滑后的光谱数据进行特征波段筛选，即得红外光谱曲线。

优选的，步骤(b)中，所述平滑处理的方法为多元散射校正、标准正态变换或savitzky-golay平滑中的至少一种，所述savitzky-golay平滑的参数选择为5-15个数据点、1-2阶导数平滑；

优选的，所述生物活性参数为凝血酶抑制率，所述平滑处理的方法为标准正态变换，或，所述生物活性参数为abts的清除率，所述平滑处理的方法为savitzky-golay平滑，参数选择为9个数据点、2阶导数平滑；或，所述生物活性参数为dpph的清除率，步骤(b)中，所述平滑处理的方法为savitzky-golay平滑，参数选择为15个数据点、2阶导数平滑。

优选的，步骤(c)中，所述特征波段筛选的方法为cars算法、iriv算法、ga算法、vcpa-iriv算法或vcpa-ga算法；

优选的，所述生物活性参数为凝血酶抑制率，所述特征波段筛选的方法为iriv算法；或，所述生物活性参数为abts的清除率，所述特征波段筛选的方法为cars算法；或，所述生物活性参数为dpph的清除率，所述特征波段筛选的方法为vcpa-iriv算法；

进一步优选的，所述生物活性参数为凝血酶抑制率，步骤(b)中，所述平滑处理的方法为标准正态变换，步骤(c)中，所述特征波段筛选的方法为iriv算法；或，所述生物活性参数为abts的清除率，步骤(b)中，所述平滑处理的方法为savitzky-golay平滑，参数选择为9个数据点、2阶导数平滑；步骤(c)中，所述特征波段筛选的方法为cars算法；或，所述生物活性参数为dpph的清除率，步骤(b)中，所述平滑处理的方法为savitzky-golay平滑，参数选择为15个数据点、2阶导数平滑，步骤(c)中，所述特征波段筛选的方法为vcpa-iriv算法。

优选的，步骤(3)中，所述检测模型为偏最小二乘回归模型。

优选的，步骤(3)中，通过确定系数和均方根误差对检测模型最优特征值进行选取。

本发明还提供一种快速检测莪术质量的方法，包括如下步骤：

(ⅰ)取待测莪术样品，测红外光谱曲线；

(ⅱ)将步骤(ⅰ)得到红外光谱曲线输入上述检测模型中，得到生物活性参数的预测值；

(ⅲ)判断莪术质量。

通过本发明方法建立的检测模型，能够基于手提便携式近红外光谱仪采集到的窄波长范围、低分辨率的红外光谱对莪术样品的凝血酶抑制率、abts的清除率和dpph的清除率进行预测。通过模型的确定系数(r2)、均方根误差(rmse)和性能偏差比(rpd)，可知本发明的检测模型准确性和鲁棒性好，能够满足对莪术样品生物活性的现场、快速检测。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1是手提便携式近红外光谱仪(micro-nir，a)和台式红外光谱仪(ft-nir，b)检测莪术样品得到的红外光谱曲线；

图2是实施例1(a)、实施例2(b)、实施例3(c)及实验例2中对凝血酶抑制率(d)、abts的清除率(e)和dpph的清除率(f)得到的检测模型的参数；

图3是实施例1-3(a)和实验例2(b)得到的检测模型中经过特征波段筛选后的特征波段位置。

具体实施方式

实施例1莪术凝血酶抑制率的预测

检测模型的建立方法如下：

1、测试莪术样品的红外光谱曲线

1)使用手提便携式近红外光谱仪(nir-s-r2:innospectra公司，中国台湾)在室温下以吸收模式收集生、醋莪术样品的光谱数据。该光谱仪重约80克，光谱范围为900-1650nm。它可以通过蓝牙连接到其他设备，如智能手机或平板电脑。制造商(中国，台湾innospectra公司)提供了一款智能手机应用程序。中国)的手提便携式近红外光谱仪。根据制造商的说明，该应用程序已下载并安装在一台运行android系统的智能手机上，用于收集和存储光谱数据，格式为cvs。然后，存储在智能手机上的频谱文件通过通无线网络上传至实验室主机。传输的数据在计算机中转换为数据矩阵。最后，将矩阵导入matlab(mathworksinc.)为接下来的处理作准备。将置于透明密封袋中的粉末置于micro-nir的光谱采集端口处，隔着透明密封膜进行检测。使用仪器内厂家提供的内置白色参考，用于自检和数据矫正。使用前首先根据厂家的建议预热30分钟，随后对样品进行6次扫描，取其平均值作为单次测量值。每份样品在不同点平行测量三次，平均值作为该样品最终的nir光谱数据。检测得到的micro-nir光谱曲线如图1a所示。

取范围为950-1650nm的数据作为原始光谱数据，数据点数为228个(去除机械噪音区后为214个)。

2)在matlab中采用标准正态变换(snv)、多元散射校正(msc)或savitzky-golay平滑中的至少一种对原始光谱数据进行平滑处理；所述savitzky-golay平滑的参数选择为5-15个数据点、1-2阶导数平滑。以下数据表格中，“ndms”是指采用savitzky-golay平滑，参数选择为m个数据点、n阶导数平滑。

3)利用cars算法、iriv算法、ga算法、vcpa-iriv算法或vcpa-ga算法对平滑后的光谱数据进行特征波段筛选，即得用于建模的红外光谱曲线。这些算法均为现有技术。

2、测试莪术样品的凝血酶抑制率

1)取1000u凝血酶冻干粉(上海翊圣生物科技有限公司)分次加入2ml的pbs缓冲液(1x，corning,inc.ph＝7.2-7.4,批号：21040024)充分溶解，溶液转移至200ml容量瓶中，随后以pbs定容，配置成5u/ml的凝血酶溶液，分批罐装至10ml的microcentrifugetube中，经过封口膜密封后置于-80℃条件下储存备用。25mg发色底物s-2238(98％，源叶)以2ml的pbs缓冲液分次充分溶解，转移至10ml容量瓶中定容，配置成2.5mg/ml的发色底物储备液，每1ml转移至1.5ml的ep管中置于-20℃条件下储存备用。

2)凝血酶抑制实验根据现有技术方法实现，具体如下：取96孔板，将20μl的莪术提取液加入孔板，每份提取液平行加入三个孔，共需要93孔，剩余3孔加入20μl的甲醇作为空白对照。接着在96孔中加入100μl的5u/ml的凝血酶溶液，加入完毕后立即放入温度为37℃的孵育器中孵育40分钟，孵育完成后，立即使用排枪在每个孔中加入20μl的s-2238发色底物，然后通过酶标仪(赛默飞)检测，检测模式为不震动的动力学法，检测时间10分钟，间隔6秒，检测波长为405nm。观察发色底物分解的动力学特征，选取线性较好的时间段计算凝血酶抑制率。

3、进行模型训练，建立检测模型

1)将上述步骤得到的红外光谱曲线和生物活性参数构成训练集和预测集，训练集和预测集的样本量为2:1；

2)利用kennarda-stone(k-s)算法，基于训练集和预测集建立莪术凝血酶抑制率的检测模型。

建立的检测模型为偏最小二乘回归(plsr)模型。其中x数据为红外光谱曲线，y数据为凝血酶抑制率。

为了评估两组检测数据之间的交叉，通过多次迭代计算得到确定系数(r2，训练集记为r2c，预测集记为r2p)、均方根误差(rmse，训练集记为rmsec，预测集记为rmsep)等参数，通过监督和筛选操作确定最优特征值。这些参数可以在很大程度上反映所建模型的优劣:当r2接近1，rmse接近0时，该方法所建模型的准确性和鲁棒性都较好。采用性能偏差比(rpd)来判断预测结果，当rpd＞3表示很好的预测当rpd在2到3之间，表示较好的预测能力。同时限制偏最小二乘回归(plsr)模型的最大潜在变量数(lvs)为15。

所有建模结果数据如下：

表1不同平滑处理方法和特征波段筛选方法的所有建模结果数据

本实施例建立的最佳检测模型中，平滑方法为snv，特征波段筛方法为iriv算法。训练集的r2为0.9637，预测集的r2为0.7759，训练集的rmse为0.0327，预测集的rmse为0.0690，rpd为2.434。可见，本实施例建立的检测模型准确率和鲁棒性很好，能够很好地对莪术样品的凝血酶抑制率进行预测。

基于上述检测模型，本实施例的预测方法为：

(ⅰ)取待测莪术样品，测试红外光谱曲线；

(ⅱ)将步骤(ⅰ)得到红外光谱曲线输入检测模型中，得到凝血酶抑制率的预测值；

(ⅲ)判断莪术质量。

实施例2莪术abts的清除率的预测

检测模型的建立方法如下：

1、测试莪术样品的红外光谱曲线

方法与实施例1相同。

2、测试莪术样品的abts的清除率

abts自由基脱色实验属于现有技术，用于描述样本自由基清除能力(abts的清除率)。abts(麦克林)以水溶解至7mmol/l后，取等量abts溶液与140mmol/l的k2s2o8水溶液反应，混合前均以0.22um微孔滤膜过滤。反应液在室温(25±2℃)下避光保存12-16h。由于抑制率应在20-80％之间，首先通过预实验探索了自由基清除能力最强和最弱的样品，得到了适宜的浓度为用无水乙醇稀释5倍，得到适宜浓度的abts溶液。加入100μl稀释abts溶液和20μl莪术提取液于96孔板中，通过酶标仪在734nm下测定每种化合物的吸光度。以100μlabts溶液与20μl甲醇的混合液作为空白对照，所有的分析都进行了三次。abts的清除率计算方法如下：

abts的清除率＝(a2-a1)/ao×100

其中a2为莪术提取液与abts溶液反应开始的初始吸光度，al为莪术提取液与abts溶液反应结束的吸光度，ao为样品溶剂与abts的混合物的吸光度。

3、进行模型训练，建立检测模型

方法与实施例1相同。

本实施例的最佳模型中平滑处理方法为savitzky-golay平滑，参数选择为9个数据点、2阶导数平滑；特征波段筛选的方法为cars算法。

所有建模结果数据如下：

表2不同平滑处理方法和特征波段筛选方法的所有建模结果数据

本实施例建立的最佳检测模型对训练集的r2为0.9439，预测集的r2为0.8011，训练集的rmse为0.0652，预测集的rmse为0.0802，rpd为3.176。可见，本实施例建立的检测模型准确率和鲁棒性很好，能够很好地对莪术样品的abts的清除率进行预测。

基于上述检测模型，本实施例的预测方法为：

(ⅰ)取待测莪术样品，测试红外光谱曲线；

(ⅱ)将步骤(ⅰ)得到红外光谱曲线输入检测模型中，得到abts的清除率的预测值；

(ⅲ)判断莪术质量。

实施例3莪术dpph的清除率的预测

检测模型的建立方法如下：

1、测试莪术样品的红外光谱曲线

方法与实施例1相同。

2、测试莪术样品的dpph的清除率

dpph的清除率的测定属于现有技术，通过分光光度法检测在乙醇溶液中呈紫色的自由基变化，当样品呈现良好的自由基清除能力时，微板阅读器能通过显色的降低来测定样本对自由基的还原程度，从而间的得到样本的抗氧化能力。在本研究中，微型板块被用于一次性检测，以避免多次检测引起的误差。具体方案是取20μl的莪术提取液与0.2mmol/l的dpph溶液100μl混合加入96孔板中，以甲醇作为对照，每份混合液一式三份。加入后立即放入预设温度30℃的微孔阅读器中避光孵育20分钟，随后检测在517nm处每个孔的吸光度。

以甲醇作为空白对照，所有的分析都进行了三次。dpph的清除率计算方法如下：

dpph的清除率＝ao-(a1-a2)/ao×100

其中a2为莪术提取液与dpph的溶剂的混合物的吸光度，al为莪术提取液与dpph溶液反应结束时的吸光度，ao为莪术提取液的溶剂与dpph溶液的混合物的吸光度。

3、进行模型训练，建立检测模型

方法与实施例1相同。

本实施例的最佳模型中平滑处理的方法为savitzky-golay平滑，参数选择为15个数据点、2阶导数平滑。特征波段筛选的方法为vcpa-iriv算法。

所有建模结果数据如下：

表3不同平滑处理方法和特征波段筛选方法的所有建模结果数据

本实施例建立的最佳检测模型对训练集的r2为0.9441，预测集的r2为0.8750，训练集的rmse为0.0606，预测集的rmse为0.0680，rpd为3.590。可见，本实施例建立的检测模型准确率和鲁棒性很好，能够很好地对莪术样品的dpph的清除率进行预测。

基于上述检测模型，本实施例的预测方法为：

(ⅰ)取待测莪术样品，测试红外光谱曲线；

(ⅱ)将步骤(ⅰ)得到红外光谱曲线输入检测模型中，得到dpph的清除率的预测值；

(ⅲ)判断莪术质量。

实验例1不进行特征波段筛选步骤建立的凝血酶抑制率检测模型

本实验例建立检测模型的方法与实施例1相同，区别在于，本实验例去除了特征波段筛选的步骤。此外，基于r2、rmse和rpd值对不同的平滑处理方法进行筛选，筛选确定的最佳平滑处理方法为多元散射校正(msc)。

本实验例与实施例1建立的检测模型对比如下：

表4本实验例与实施例1建立的检测模型的对比

从上表数据可以看到，若不进行特征波段的筛选步骤，得到的模型r2值大幅偏离1，rmse值大幅偏离0，rpd<2，是一个很差的检测模型，无法用于对莪术样品的凝血酶抑制率进行预测。

实验例2基于台式的全近红外波长范围扫描的近红外光谱的红外光谱数据对莪术样品的生物活性参数进行预测

本实验例采用与实施例1-3相同的方法，建立基于台式的全近红外波长范围扫描的近红外光谱(ft-nir)的红外光谱数据对莪术样品的生物活性参数进行预测的模型。

模型的建立包括如下步骤：

1、测试莪术样品的红外光谱曲线

通过配备有tango-rintegratingsphericaldiffusereflectionsystem的tangoft-近红外光谱仪(brukeropticsinc,ettlingen,germany)对每批样品的8g粉末进行检测，以空气作为参考标准，扫描32次，扫描范围12000-4000cm^-l，分辨率为8cm^-1。每批样品平行测量三次，每次平行测量均将粉末取出后再填充，以保证获取样品完整的信息用每批样品的平均光谱进行分析。如图1b所示。

依次对原始光谱数据进行平滑处理和特征波段筛选。得到用于建模的红外光谱曲线。

2、莪术凝血酶抑制率(thrombin)、abts的清除率和dpph的清除率的检测

方法与实施例1-3对应的步骤相同。

3、进行模型训练，建立检测模型

方法与实施例1相同。

在建模过程中，对不同的平滑处理方法和特征波段筛选方法进行筛选，筛选确定的最佳方法及其r2、rmse和rpd值如表2和图2所示，表2和图2还同时给出了实施例1-3的给出的最佳方法及其r2、rmse和rpd值。

表5本申请实施例和实验例1中建立的检测模型的条件及参数

从上述对比结果可以看出，采用手提便携式近红外光谱仪和台式红外光谱仪采集的红外数据需要进行的平滑处理方法、特征波段筛选方法完全不同。且，针对不同的检测参数(凝血酶抑制率、abts的清除率或dpph的清除率)，需要进行的平滑处理方法、特征波段筛选方法也完全不同。

图3给出了上述模型经过特征波段筛选后的特征波段位置，其中灰色代表nir光谱，红色点、紫色点和黄色点分别代表对凝血酶抑制率、abts的清除率和dpph的清除率预测所选波段。从图中可以看到，采用手提便携式近红外光谱仪和台式红外光谱仪采集的红外数据中，检测模型选择的特征波段差别非常大。在台式红外光谱仪采集的红外数据中，能够选择与生物活性参数更加相关的波段范围的数据，因此其检测模型的准确性和鲁棒性更好。而手提便携式近红外光谱仪的红外数据采集波长范围小、分辨率低，因此无法选择与台式红外光谱仪采集的红外数据相同的波段范围作为特征波段，只能在有限的范围内选择与生物活性参数关联度相对较好的一些波段范围作为特征波段范围。本发明优选的平滑处理方法和特征波段筛选方法对这些波段范围内的数据处理效果更好，因而将检测模型的准确性和鲁棒性等参数提高到了满足实际应用需求的程度，顺利实现了利用手提便携式近红外光谱仪的红外光谱数据预测莪术的生物活性的目的。

综上所述，本发明提供了一种建模方法和利用建立的模型进行预测的方法。实现了利用手提便携式近红外光谱仪采集的红外数据预测莪术的凝血酶抑制率、abts的清除率和dpph的清除率，能够有效辅助判断莪术样品的活血化瘀功效。本发明方法快速、简便，能够进行现场检测，在中药材产区、市场、医院等场合具有很高的应用潜力。