一种乳制品中磺胺间二甲氧嘧啶的拉曼快速检测方法与流程

本发明涉及一种乳制品检测方法，尤其涉及一种乳制品中磺胺间二甲氧嘧啶的拉曼快速检测方法。

背景技术：

磺胺类药物是指具有对氨基苯磺酰胺结构的一类药物的总称，是常用的广谱抗菌药。磺胺类药物由于抗菌谱广、高效、低毒和价格低廉，被广泛用于动物养殖，用于细菌感染性疾病的预防和治疗。由于磺胺类药物在动物体内作用和代谢时间较长，往往造成动物可食性组织中磺胺类药物的残留，长期食用含磺胺类药物残留的食品，可能引起磺胺类药物在体内的蓄积，使人体健康受到严重威胁。其危害性主要表现为人体内产生耐药菌株导致过敏反应；损害免疫系统和血液系统造成造血紊乱；损害泌尿系统及致畸、致突变和致癌作用等。

目前，磺胺的主要检测方法包括酶联免疫法，固相萃取-高效液相色谱法，液相色谱-质谱法等。酶联免疫法作为筛选方法得到广泛应用，但容易出现假阳性。液相色谱法和液相色谱质谱法虽能获得较精确的结果，但往往具有仪器设备昂贵、样品处理方法复杂、检测所需时间长等一系列问题，无法满足目前食品安全问题频发局面下，样品检测急需的实时性、现场性、有效性要求。因此研发出一种快速、便捷、灵敏性高的方法具有十分重要的意义。拉曼光谱分析方法具有信息丰富、无需样品处理、检测快速便捷、高特异性等优点，因此在食品或药品检验中体现了独特的优势，它能反映出不具红外活性的分子的对称性振动和非极性基团的振动，因此拉曼光谱常常与红外光谱结合在一起，共同对物质分子进行完整分析。但一般情况下，样品的拉曼信号非常微弱，表面增强拉曼光谱(sers)克服了传统拉曼光谱灵敏度低的缺点，完全继承了拉曼光谱特异性好、不受水的干扰、能够提供丰富的分子结构信息、支持多组分同时检测等优点，显示出食品药品现场快速检测的优越能力。随着便携式拉曼光谱仪市场化，基于sers的鉴定技术得到了迅速的发展。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种乳制品中磺胺间二甲氧嘧啶的拉曼快速检测方法，能够满足磺胺间二甲氧嘧啶在乳制品等食品基质中简单、快速、廉价、高灵敏度等方面的检测需求。

本发明为解决上述技术问题而采用的技术方案是提供一种乳制品中磺胺间二甲氧嘧啶的拉曼快速检测方法，包括如下步骤：s1)样品处理：称取适量乳制品样品，加入蛋白沉淀剂和有机提取溶剂，超声或涡旋1-5min，4000rpm/min离心2-5min；取上清液加入净化填料超声或涡旋1-5min，4000rpm/min离心1-5min；取上层液体氮气吹干，吹干后加入复溶液复溶形成待测液；s2)拉曼检测：在拉曼检测池中加入适量待测液、金属溶胶和辅助增强试剂，混匀后检测。

进一步地，所述步骤s1中乳制品样品为新鲜乳样或牛奶制品。

进一步地，所述步骤s1中蛋白沉淀剂是质量浓度为20％-40％的乙酸锌与饱和亚铁氰化钾的混合溶液，或者所述步骤s1中蛋白沉淀剂是质量浓度为8-15％的三氯乙酸水溶液。

进一步地，所述步骤s1中有机提取溶剂包括石油醚、乙酸乙酯和正己烷中的一种。

进一步地，所述步骤s1中样品经涡旋和离心处理，直至发生明显沉淀现象。

进一步地，所述步骤s1中净化填料包括c18、中性氧化铝和佛罗里硅土中的一种。

进一步地，所述步骤s1中复溶液为体积浓度为10％-20％的乙醇水溶液和体积浓度为10％-20％的甲醇水溶液中的一种，加入体积为200-500μl。

进一步地，所述步骤s2中金属溶胶为包含金纳米粒子或银纳米粒子的纳米金属溶胶。

进一步地，所述步骤s2中辅助增强试剂是摩尔浓度为0.01-1m的氯化钠溶液。

进一步地，所述步骤s2中检测过程如下：向样品检测瓶中的按体积比1：0.5～2：0.1～1加入待测液，纳米金属溶胶和氯化钠溶液，并混合均匀，于拉曼样品检测池中，用便携式拉曼光谱仪进行检测。

本发明对比现有技术有如下的有益效果：本发明提供的乳制品中磺胺间二甲氧嘧啶的拉曼快速检测方法，现场采集乳制品样本，并通过简单前处理结合金属纳米粒子的表面增强拉曼散射效应，操作简便，满足磺胺间二甲氧嘧啶在乳制品等食品基质中简单、快速、廉价、高灵敏度等方面的检测需求。检测结果符合国标《gb31650-2019食品安全国家标准，食品中兽药最大残留量》中磺胺间二甲氧嘧啶的要求，满足各地海关口岸、时长监管部门的快速筛查、复核的检测要求，且检测时间短、成本低。

附图说明

图1为本发明实施例中巴氏杀菌全脂牛奶中磺胺间二甲氧嘧啶的加标检测信号图；

图2为实施例中巴氏杀菌脱脂牛奶中磺胺间二甲氧嘧啶的加标检测信号图；

图3为实施例中新鲜牛乳中磺胺间二甲氧嘧啶的加标检测信号图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的描述。

本发明提供的乳制品中磺胺间二甲氧嘧啶的拉曼快速检测方法，包括如下步骤：

s1)样品处理：称取适量乳制品样品，加入蛋白沉淀剂和有机提取溶剂，超声或涡旋1-5min，4000rpm/min离心2-5min，直至发生明显沉淀现象，去除加入蛋白沉淀剂后发生聚沉的蛋白质；取上清液加入净化填料超声或涡旋1-5min，4000rpm/min离心1-5min，直至发生明显沉淀现象除去净化填料；取上层液体氮气吹干，吹干后加入复溶液复溶形成待测液。

蛋白沉淀剂可以选择质量浓度为8-15％的三氯乙酸，或者选择质量浓度为20％-40％的乙酸锌与饱和亚铁氰化钾的混合溶液，乙酸锌与亚铁氰化钾发生化学反应生成的氰亚铁酸锌与样品中的蛋白发生络合作用形成沉淀，从而除去样品中的蛋白质。这两种试剂为协同作用，同时加入可以更好的除去样品中的蛋白。

有机提取溶剂包括石油醚、乙酸乙酯和正己烷中的一种；净化填料包括c18、中性氧化铝和佛罗里硅土中的一种；复溶液为水溶液、体积浓度为10％-20％的乙醇水溶液和体积浓度为10％-20％的甲醇水溶液中的一种，加入体积为200-500μl。

s2)拉曼检测：在拉曼检测池中加入适量待测液、金属溶胶和辅助增强试剂，混匀后检测。为了避免影响灵敏度，导致仪器最终测试信号值偏低，具体检测过程如下：向样品检测瓶中的按体积比1：0.5～2：0.1～1加入待测液，纳米金属溶胶和氯化钠溶液，并混合均匀，于拉曼样品检测池中，用便携式拉曼光谱仪进行检测。金属溶胶为包含金纳米粒子或银纳米粒子的纳米金属溶胶,辅助增强试剂是摩尔浓度为0.01-1m的氯化钠溶液。

实施例一

对巴氏杀菌脱脂牛奶样品中不同浓度加标的检测，其步骤如下：

标准品制备：配置浓度为0.1mg/kg的磺胺间二甲氧嘧啶标准溶液。

样品加标及前处理：将上述样品，以《gb31650-2019食品安全国家标准，食品中兽药最大残留量》中限值点进行不同样品加标，使加标浓度符合国标限值要求。

取1ml牛奶，加入50μl30％硫酸锌、50μl饱和亚铁氰化钾，再加入2ml乙酸乙酯，涡旋振荡2min，4000rpm/min离心2min。取全部上清液，加0.3g中性氧化铝，涡旋振荡2min，4000rpm/min离心1min。取所有上层液体氮气吹干，吹干后加200μl水复溶。

测定时，取50μl待测液，加入20μl1mnacl，加入100μl金纳米粒子，快速混匀，上机检测，检测结果为图1，特征峰为664、822cm^-1。

实施例二

采用实施例一中系列浓度的标准品,并采用相同的加标方法，对巴氏杀菌全脂牛奶样品进行加标、前处理和检测，检测结果为图2，特征峰为664、822cm^-1。

实施例三

采用实施例一中系列浓度的标准品,并采用相同的加标方法，对新鲜牛乳样品进行加标、前处理和检测，检测结果为图3，特征峰为664、822cm^-1。

上述实施例检测过程中，样品的检测时间不超过20min，单次实验物料检测的成本在5～10元内，相对于传统的液相色谱、气相色谱、质谱等检测方法，不仅快速，廉价，检测结果也满足各地海关口岸、市场监管部门的快速筛查、复核的检测要求。

由上可见，本发明基于sers技术，以金属纳米粒子作为sers基底，通过前处理对乳制品中残留的磺胺间二甲氧嘧啶进行富集分离，应用便携式拉曼光谱设备，得到磺胺间二甲氧嘧啶的sers谱图。本发明的优势在于：1、本发明结合简捷、高效、廉价的前处理方案，完成巴氏杀菌全脂牛奶、巴氏杀菌脱脂牛奶、新鲜牛乳快速检测；本方法检测时间在20min内，单次检测成本控制在5-10元内，与液相色谱、气相色谱、质谱等方法相比，成本仅为其10％-20％。2、具备较好的除杂效果，检测准确性好，无假阳性与假阴性错误发生，满足各地海关口岸、市场监管部门的快速筛查、复核的检测要求。3、灵敏度高，可检出至0.1mg/kg,满足国标限量《gb31650-2019食品安全国家标准，食品中兽药最大残留量》要求。

虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许的修改和完善，因此本发明的保护范围当以权利要求书所界定的为准。