一种用于血清特异性IgE筛查的试纸条及其制备方法

本发明属于免疫检测领域，涉及一种用于血清特异性ige筛查的试纸条及其制备方法。

背景技术：

过敏反应是人们对某些食物/环境等外界刺激产生的一种不良反应，在医学上属于一种变态反应，多由特异性ige介导。过敏的完整诊断包括临床病史、流行病学与免疫学病因、皮肤试验与过敏原特异性ige抗体检测试验等。

体外特异性ige抗体检测包括免疫印记法、放射变应原吸附诊断、荧光酶标法、酶联免疫法、免疫层析试纸条检测等。体外immunocap系统因其良好的重复性、精确性及全自动的技术，被视为体外sige检测方法的“金标准”，但该技术不仅需要精密的仪器，严苛的测试环境和昂贵的试剂耗材，还需要配备熟练操作的技术人员。而免疫层析试纸条检测技术具有操作简便、结果快速且稳定、不需要大型设备及成本低廉等优点，可以广泛应用于过敏原检测及血清中特异性ige的筛查。

已有用于筛查食物过敏特异性ige的试纸条大多数采用过敏原全蛋白作为检测线抗原，但蛋白质分离纯化的过程较为复杂，抗原的批间稳定性差；蛋白质容易受物理化学条件的影响而变性，存储稳定性差；全蛋白可能含有非特异性结合位点，导致出现假阳性。已有用于筛查食物过敏特异性ige的试纸条大多数将金标蛋白质喷洒在膜上得到胶体金结合垫，但全蛋白中各组分的等电点差异较大，胶体金标记效率不一。

技术实现要素：

本发明的目的是提出一种用于血清特异性ige筛查的试纸条及其制备方法。

本发明是通过以下技术方案实现的。

本发明所述的一种用于血清特异性ige筛查的试纸条，其特征在于：硝酸纤维素膜检测层上设置有一条检测线（t线）和一条质控线（c线），检测线上包被所需的肽段及肽段组合，质控线上包被兔抗人血清蛋白，胶体金分别标记肽段和鼠抗人血清蛋白，混合后制备胶体金结合垫。

本发明所述的一种用于血清特异性ige筛查的试纸条的制备方法，按如下步骤。

（1）肽段的制备：根据检测的对象，筛选并合成所需特异性ige的3-45肽的肽段，将肽段或其组合（包括2-25种肽段）分别用作金标肽段和检测线肽段。

（2）肽段溶液的制备：将合成的肽段分别溶解在0.8-1.1％nacl溶液中，使其最终溶度为0.5-5mg/ml，即得到待金标的肽段溶液和检测线肽段溶液。

（3）胶体金的制备：采用柠檬酸盐还原法用柠檬酸三钠还原剂将氯金酸还原制成20nm-40nm的胶体金溶液。准备一个250ml的三角角烧瓶，装入150ml的双蒸水，用恒温磁力搅拌器将溶液加热至沸腾，保持煮沸1min，弃去。加入双蒸水99ml，再加入1ml1％的四氯金酸溶液搅匀后加热至沸腾，在持续揽拌中的同时快速地加入2.25ml1％的柠檬酸三钠溶液，大约2min左右溶液的颜色变至紫红后并不再变化，再加热搅拌溶液15min。移去热源，冷却至室温，双蒸水定容至100ml，4℃保存备用。

（4）金标鼠抗人血清蛋白的制备：用0.1mk2co3溶液调鼠抗人血清蛋白溶液的ph值至8.5，边搅拌边向其中加入步骤（3）的胶体金溶液，鼠抗人血清蛋白溶液与胶体金溶液的体积比为1-10:100，同时加入稳定剂以防止抗原与胶体金颗粒聚合沉淀，即得胶体金-鼠抗人血清蛋白结合物。

（5）金标多肽的制备：用0.08-0.13mhcl溶液或0.08-0.13mk2co3溶液调节步骤（2）中待金标的肽段溶液，使溶液达到其最适ph值，边搅拌边向其中加入步骤（3）的胶体金溶液，肽段溶液与胶体金溶液的体积比为1-10:100，同时加入稳定剂以防止肽段与胶体金颗粒聚合沉淀，即得胶体金-肽段结合物。对于肽段组合，则将各多肽分别标记后，再按照浓度需求混合在一起。

（6）金标鼠抗人血清蛋白、金标多肽的纯化：将步骤（4）（5）中制备的金标鼠抗人血清蛋白、金标多肽经1500r/min离心10min；收集沉淀溶于稳定剂中，使其浓度达到5-30％；然后加至层析柱上进行纯化，过滤除菌，4℃保存。

（7）胶体金结合垫的制备：用三维平面点膜喷金仪，将各金标多肽及金标鼠抗人血清蛋白按5-10:1混合后均匀的喷在玻璃纤维膜上，喷液量0.8-1.2pl/cm，37℃烘干过夜，封袋备用。

（8）检测层的制备：用三维平面点膜喷金仪，将步骤（2）中检测线肽段溶液均匀喷在检测线上，将稀释好的兔抗人血清均匀喷在硝酸纤维素膜上，得到质控线。喷液量为0.8-1.8pl/cm，37℃烘干过夜，封袋备用。

（9）试纸条的组装：将样品垫，胶体金结合垫，硝酸纤维素膜，吸水垫由一端依次粘贴在pvc底板上，即得一种用于血清特异性ige筛查的试纸条。

肽段可以直接人工合成，不同批次之间稳定性良好；合成的肽段存储稳定性的远优于全蛋白。过敏原蛋白，尤其是食物过敏原蛋白，在人体中都只有部分片段以多肽被ige识别引发过敏反应，利用多肽检测血清中的特异性ige，结果更贴近事实。多轮筛选研究发现，有很多肽段能够且只能够与相应的ige特异性结合，这有效保证了多肽抗原检测结果的准确性。在用胶体金标记肽段时，肽段的等电点是确定的，胶体金能够稳定标记。利用肽段组合作为抗原时，也可分别标记肽段后，再将标记好的肽段混合使用。

本发明以筛选出的肽段或肽段组合作为血清中特异性ige筛查试纸条的检测抗原及标记对象，能有效改善试纸条的性能，提高检测的稳定性和准确性。

附图说明

图1为本发明用于食物过敏特异性ige筛查的试纸条示意图；其中，1为样品垫，2为胶体金结合垫，3为硝酸纤维素膜检测层，4为吸水垫，5为检测线t线，6为质控线c线，7为pvc底板。

图2为本发明实施例5检测结果照片。

具体实施方式

本发明筛选肽段或肽段组合，捕捉人血清中的特异性ige，并以此初步表征患者过敏情况。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1。花生过敏特异性ige筛查试纸条。

1)肽段的制备：根据检测的对象，选择花生过敏原蛋白优势表位肽，合成金标肽段elqgdrrcqsqler、rdpyspsqdpysps，合成检测线肽段rlpfspsqdpfsps。

2)肽段溶液的制备：将上述合成的金标肽段elqgdrrcqsqler、rdpyspsqdpysps分别溶解到0.9％nacl溶液中，使溶度都为2mg/ml，即得到待金标肽段溶液；将合成的检测线肽段rlpfspsqdpfsps溶解到0.8％nacl溶液中，使其溶度为5mg/ml，即得到检测线肽段溶液。

3)胶体金溶液的制备：采用柠檬酸盐还原法用柠檬酸三钠还原剂将氯金酸还原制成20nm的胶体金溶液。准备一个250ml的三角角烧瓶，装入150ml的双蒸水，用恒温磁力搅拌器将溶液加热至沸腾，保持煮沸1min，弃去。加入双蒸水99ml，再加入1ml1％的四氯金酸溶液搅匀后加热至沸腾，在持续揽拌中的同时快速地加入2.25ml1％的柠檬酸三钠溶液，大约2min左右溶液的颜色变至紫红后并不再变化，再加热搅拌溶液15min。移去热源，冷却至室温，双蒸水定容至100ml，4℃保存备用。通过扫描电镜图确定胶体金的径粒20nm左右。

4)金标鼠抗人血清蛋白的制备：用0.1mk2co3溶液调鼠抗人血清蛋白溶液的ph值至8.5，边搅拌边向其中加入步骤（3）的胶体金溶液，鼠抗人血清蛋白溶液与胶体金溶液的体积比为4:100，同时加入稳定剂以防止抗原与胶体金颗粒聚合沉淀，即得胶体金-鼠抗人血清蛋白结合物；所述稳定剂为bsa（牛血清白蛋白）和分子量20kd的聚乙二醇，二者终浓度分别为1％和0.1％。

5)金标肽段的制备：用0.13mhcl溶液分别调节金标肽段elqgdrrcqsqler、rdpyspsqdpysps溶液的ph值至6.77、4.71，边搅拌边向其中加入胶体金溶液，金标肽段elqgdrrcqsqler与胶体金溶液的体积比为8:100，金标肽段rdpyspsqdpysps与胶体金溶液的体积比为5:100，同时加入bsa以防止表位肽与胶体金颗粒聚合沉淀，即得金标肽段。

6)金标鼠抗人血清蛋白、金标肽段的纯化：将步骤（4）（5）中制备的金标鼠抗人血清蛋白、金标多肽经1500r/min离心10min；收集沉淀溶于稳定剂（所述稳定剂为1％bsa和0.1％分子量20kd的聚乙二醇溶液）中，使其浓度分别为20％、25%；然后加至层析柱上进行纯化，过滤除菌，4℃保存。

7)胶体金结合垫的制备：调试三维平面点膜喷金仪仪器，金标肽段elqgdrrcqsqler、rdpyspsqdpysps及金标鼠抗人血清蛋白8：8：1混合后均匀的喷在玻璃纤维膜上，喷液量0.8pl/cm，37℃烘干过夜，封袋备用。

8)检测层的制备：调试三维平面点膜喷金仪仪器，将2中检测线肽段溶液均匀喷洒，得到t检测线，喷液量为1.8pl/cm；将稀释好的兔抗人血清均匀喷在硝酸纤维素膜上，得到质控线，喷液量为0.8pl/cm。37℃烘干过夜，封袋备用。

9)试纸条的组装：将样品垫，胶体金结合垫，硝酸纤维素膜，吸水垫由一端依次粘贴在pvc底板上，即得一种用于血清特异性ige筛查的试纸条。

10)结果判断：

。

本产品利用花生过敏原蛋白优势表位肽及其突变体，提供一种用于花生过敏特异性ige筛查的试纸条，适于工业化大规模生产。采用该试纸条，检测了10个血样，其中来源于花生过敏患者的血样8个。检测结果显示，全部8个花生过敏患者的血样中特异性ige均为阳性，且其他2个非花生过敏患者的血清ige检测结果均为阴性。

实施例2。用于花生过敏特异性ige筛查的试纸条。

1）肽段的制备：根据检测的对象，合成金标肽段rdyyspsqdyysps、rlpfspsqdpfsps，合成检测线肽段elqgdrrcqsqlerrdpfspsqdpfsps。

2）肽段溶液的制备：将上述合成的金标肽段rdyyspsqdyysps、rlpfspsqdpfsps分别溶解到0.9％nacl溶液中，使其溶度为2mg/ml，即得到待金标肽段溶液；将合成的检测线肽段elqgdrrcqsqlerrdpfspsqdpfsps溶解到1.1％的nacl溶液中，使其溶度为4mg/ml，即得到检测线肽段溶液。

3）胶体金溶液的制备：采用柠檬酸盐还原法用柠檬酸三钠还原剂将氯金酸还原制成20nm的胶体金溶液。准备一个250ml的三角角烧瓶，装入150ml的双蒸水，用恒温磁力搅拌器将溶液加热至沸腾，保持煮沸1min，弃去。加入双蒸水99ml，再加入1ml1％的四氯金酸溶液搅匀后加热至沸腾，在持续揽拌中的同时快速地加入2.25ml1％的柠檬酸三钠溶液，大约2min左右溶液的颜色变至紫红后并不再变化，再加热搅拌溶液15min。移去热源，冷却至室温，双蒸水定容至100ml，4℃保存备用。通过扫描电镜图确定胶体金的径粒20nm左右。

4）金标鼠抗人血清蛋白的制备：用0.1mk2co3溶液调鼠抗人血清蛋白溶液的ph值至8.5，边搅拌边向其中加入步骤（3）的胶体金溶液，鼠抗人血清蛋白溶液与胶体金溶液的体积比为4:100，同时加入稳定剂以防止抗原与胶体金颗粒聚合沉淀，即得胶体金-鼠抗人血清蛋白结合物；所述稳定剂为bsa（牛血清白蛋白）和分子量20kd的聚乙二醇，二者终浓度分别为1％和0.1％。

5）金标肽段的制备：用0.13mhcl溶液分别调节金标肽段rdyyspsqdyysps、rlpfspsqdpfsps溶液的ph值至4.71、6.34，边搅拌边向其中加入胶体金溶液，金标肽段rdyyspsqdyysps与胶体金溶液的体积比为8:100，金标肽段rlpfspsqdpfsps与胶体金溶液的体积比为4:100，同时加入bsa以防止表位肽与胶体金颗粒聚合沉淀，即得金标肽段。

6）金标鼠抗人血清蛋白、金标肽段的纯化：将步骤（4）（5）中制备的金标鼠抗人血清蛋白、金标多肽经1500r/min离心10min；收集沉淀溶于稳定剂（所述稳定剂为1％bsa和0.1％分子量20kd的聚乙二醇溶液）中，使其浓度分别为20％、25%；然后加至层析柱上进行纯化，过滤除菌，4℃保存。

7）胶体金结合垫的制备：调试三维平面点膜喷金仪仪器，金标肽段rdyyspsqdyysps、rlpfspsqdpfsps及金标鼠抗人血清蛋白6：8：1混合后均匀的喷在玻璃纤维膜上，喷液量1.2pl/cm，37℃烘干过夜，封袋备用。

8）检测层的制备：调试三维平面点膜喷金仪仪器，将步骤2中检测线肽段elqgdrrcqsqlerrdpfspsqdpfsps肽段溶液均匀喷洒，得到t检测线，喷液量为1.5pl/cm；将稀释好的兔抗人血清均匀喷在硝酸纤维素膜上，得到质控线，喷液量为0.8pl/cm。37℃烘干过夜，封袋备用。

9）试纸条的组装：将样品垫，胶体金结合垫，硝酸纤维素膜，吸水垫由一端依次粘贴在pvc底板上，即得一种用于血清特异性ige筛查的试纸条。

10）结果判断：

。

本产品利用花生过敏原蛋白优势表位肽及其突变体，提供一种用于花生过敏特异性ige筛查的试纸条，适于工业化大规模生产。采用该试纸条，检测了30个血样，其中来源于花生过敏患者的血样5个。检测结果显示，全部5个花生过敏患者的血样中特异性ige均为阳性，且其他25个非花生过敏患者的血清ige检测结果均为阴性。

实施例3。用于花生过敏特异性ige筛查的试纸条。

1）肽段的制备：根据检测的对象，合成金标肽段rdpfspsqdpfsps、rlpfspsqdpfsps，合成检测线肽段cqs、hrdpyspsqdpyspsardwyspsqdwyspsardyyspsqdyysps。

2）肽段溶液的制备：将上合成的肽段rdpfspsqdpfsps、rlpfspsqdpfsps分别溶解到1.1％nacl溶液中，使其溶度为2mg/ml，即得到待金标肽段溶液；将合成的肽段cqs、hrdpyspsqdpyspsardwyspsqdwyspsardyyspsqdyysps分别溶解到0.9％nacl溶液中，使其溶度为5mg/ml、3mg/ml，即得到检测线肽段溶液。

3）胶体金溶液的制备：采用柠檬酸盐还原法用柠檬酸三钠还原剂将氯金酸还原制成20nm的胶体金溶液。准备一个250ml的三角角烧瓶，装入150ml的双蒸水，用恒温磁力搅拌器将溶液加热至沸腾，保持煮沸1min，弃去。加入双蒸水99ml，再加入1ml1％的四氯金酸溶液搅匀后加热至沸腾，在持续揽拌中的同时快速地加入2.25ml1％的柠檬酸三钠溶液，大约2min左右溶液的颜色变至紫红后并不再变化，再加热搅拌溶液15min。移去热源，冷却至室温，双蒸水定容至100ml，4℃保存备用。通过扫描电镜图确定胶体金的径粒20nm左右。

4）金标鼠抗人血清蛋白的制备：用0.1mk2co3溶液调鼠抗人血清蛋白溶液的ph值至8.5，边搅拌边向其中加入步骤（3）的胶体金溶液，鼠抗人血清蛋白溶液与胶体金溶液的体积比为4:100，同时加入稳定剂以防止抗原与胶体金颗粒聚合沉淀，即得胶体金-鼠抗人血清蛋白结合物；所述稳定剂为bsa（牛血清白蛋白）和分子量20kd的聚乙二醇，二者终浓度分别为1％和0.1％。

5）金标肽段的制备：用0.1mhcl溶液分别调节rdpfspsqdpfsps、rlpfspsqdpfsps溶液的ph值至4.71、6.34，边搅拌边向其中加入胶体金溶液，rdpfspsqdpfsps与胶体金溶液的体积比为5:100，rlpfspsqdpfsps与胶体金溶液的体积比为4:100，同时加入bsa以防止表位肽与胶体金颗粒聚合沉淀，即得金标肽段。

6）金标鼠抗人血清蛋白、金标肽段的纯化：将步骤（4）（5）中制备的金标鼠抗人血清蛋白、金标多肽经1500r/min离心10min；收集沉淀溶于稳定剂（所述稳定剂为1％bsa和0.1％分子量20kd的聚乙二醇溶液）中，使其浓度分别为20％、25%；然后加至层析柱上进行纯化，过滤除菌，4℃保存。

7）胶体金结合垫的制备：调试三维平面点膜喷金仪仪器，金标肽段rdpfspsqdpfsps、rlpfspsqdpfsps及金标鼠抗人血清蛋白7：8：1混合后均匀的喷在玻璃纤维膜上，喷液量1.0pl/cm，37℃烘干过夜，封袋备用。

8）检测层的制备：调试三维平面点膜喷金仪仪器，将2中cqs肽段溶液、hrdpyspsqdpyspsardwyspsqdwyspsardyyspsqdyysps肽段溶液均匀混合后喷洒，得到t检测线，喷液量为1.3pl/cm；将稀释好的兔抗人血清均匀喷在硝酸纤维素膜上，得到质控线，喷液量为0.8pl/cm。37℃烘干过夜，封袋备用。

9）试纸条的组装：将样品垫，胶体金结合垫，硝酸纤维素膜，吸水垫由一端依次粘贴在pvc底板上，即得一种用于血清特异性ige筛查的试纸条。

10）结果判断：

。

本产品利用花生过敏原蛋白优势表位肽及其突变体，提供一种用于花生过敏特异性ige筛查的试纸条，适于工业化大规模生产。采用该试纸条，检测了39个血样，其中来源于花生过敏患者的血样12个。检测结果显示，全部12个花生过敏患者的血样中特异性ige均为阳性，且其他27个非花生过敏患者的血清ige检测结果均为阴性。

实施例4。用于牛奶过敏特异性ige筛查的试纸条。

1）肽段的制备：根据检测的对象，合成金标肽段leivpnsaeerl、knrlnflkkisqryq，合成检测线肽段enllrffvapfpevfgk、seeivpnsve、ytdapsfsdipnpigsensek、neinqfyqkfpoyloyly。

2）肽段溶液的制备：将上述合成的金标肽段leivpnsaeerl、knrlnflkkisqryq分别溶解到1.1％nacl溶液中，使其溶度为4mg/ml、3mg/ml，即得到待金标肽段溶液；将合成的检测线肽段enllrffvapfpevfgk、seeivpnsve、ytdapsfsdipnpigsensek、neinqfyqkfpoyloyly分别溶解到0.9％nacl溶液中，使其溶度为4mg/ml、5mg/ml、2mg/ml、3mg/ml，即得到检测线肽段溶液。

3）胶体金溶液的制备：采用柠檬酸盐还原法用柠檬酸三钠还原剂将氯金酸还原制成20nm的胶体金溶液。准备一个250ml的三角角烧瓶，装入150ml的双蒸水，用恒温磁力搅拌器将溶液加热至沸腾，保持煮沸1min，弃去。加入双蒸水99ml，再加入1ml1％的四氯金酸溶液搅匀后加热至沸腾，在持续揽拌中的同时快速地加入2.25ml1％的柠檬酸三钠溶液，大约2min左右溶液的颜色变至紫红后并不再变化，再加热搅拌溶液15min。移去热源，冷却至室温，双蒸水定容至100ml，4℃保存备用。通过扫描电镜图确定胶体金的径粒20nm左右。

4）金标鼠抗人血清蛋白的制备：用0.1mk2co3溶液调鼠抗人血清蛋白溶液的ph值至8.5，边搅拌边向其中加入步骤（3）的胶体金溶液，鼠抗人血清蛋白溶液与胶体金溶液的体积比为4:100，同时加入稳定剂以防止抗原与胶体金颗粒聚合沉淀，即得胶体金-鼠抗人血清蛋白结合物；所述稳定剂为bsa（牛血清白蛋白）和分子量20kd的聚乙二醇，二者终浓度分别为1％和0.1％。

5）金标肽段的制备：用0.13mhcl溶液分别调节金标肽段leivpnsaeerl溶液的ph值分别至4.75，用0.13mk2co3溶液调节金标肽段knrlnflkkisqryq溶液的ph值分别至11.67，边搅拌边向其中加入胶体金溶液，金标肽段leivpnsaeerl、knrlnflkkisqryq与胶体金溶液的体积比分别为7:100、5:100，同时加入bsa以防止表位肽与胶体金颗粒聚合沉淀，即得金标肽段。

6）金标鼠抗人血清蛋白、金标肽段的纯化：将步骤（4）（5）中制备的金标鼠抗人血清蛋白、金标多肽经1500r/min离心10min；收集沉淀溶于稳定剂（所述稳定剂为1％bsa和0.1％分子量20kd的聚乙二醇溶液）中，使其浓度分别为20％、25%；然后加至层析柱上进行纯化，过滤除菌，4℃保存。

7）胶体金结合垫的制备：调试三维平面点膜喷金仪仪器，金标肽段leivpnsaeerl、knrlnflkkisqryq及金标鼠抗人血清蛋白6：7：1混合后均匀的喷在玻璃纤维膜上，喷液量1.0pl/cm，37℃烘干过夜，封袋备用。

8）检测层的制备：调试三维平面点膜喷金仪仪器，将步骤2）中检测线肽段enllrffvapfpevfgk、seeivpnsve、ytdapsfsdipnpigsensek、neinqfyqkfpoyloyly肽段溶液均匀混合后喷洒，得到t检测线，喷液量为1.3pl/cm；将稀释好的兔抗人血清均匀喷在硝酸纤维素膜上，得到质控线，喷液量为0.8pl/cm。37℃烘干过夜，封袋备用。

9）试纸条的组装：将样品垫，胶体金结合垫，硝酸纤维素膜，吸水垫由一端依次粘贴在pvc底板上，即得一种用于血清特异性ige筛查的试纸条。

10）结果判断：

。

本产品利用牛奶优势表位肽及其突变体，提供一种用于牛奶过敏特异性ige筛查的试纸条，适于工业化大规模生产。采用该试纸条，检测了22个血样，其中来源于牛奶过敏患者的血样3个。检测结果显示，全部3个牛奶过敏患者的血样中特异性ige均为阳性，且其他19个非牛奶过敏患者的血清ige检测结果均为阴性。

实施例5。用于坚果过敏特异性ige筛查的试纸条。

1）肽段的制备：根据检测的对象，合成金标肽段sgreqscqrqfe、creqiqrqqylnrcq，合成检测线肽ggydednqrqhf、qeegirgeemeemvq、kqevqrggrynq、slreccqelqev、qeqikgeevrel。

2）肽段溶液的制备：将上述合成的金标肽段sgreqscqrqfe、creqiqrqqylnrcq分别溶解到1.1％nacl溶液中，使其溶度为5mg/ml、3mg/ml，即得到待金标肽段溶液；将合成的检测线肽段ggydednqrqhf、qeegirgeemeemvq、kqevqrggrynq、slreccqelqev、qeqikgeevrel分别溶解到0.9％nacl溶液中，使其溶度为3mg/ml、3mg/ml、3mg/ml、3mg/ml、3mg/ml，即得到检测线肽段溶液。

3）胶体金溶液的制备：采用柠檬酸盐还原法用柠檬酸三钠还原剂将氯金酸还原制成20nm的胶体金溶液。准备一个250ml的三角角烧瓶，装入150ml的双蒸水，用恒温磁力搅拌器将溶液加热至沸腾，保持煮沸1min，弃去。加入双蒸水99ml，再加入1ml1％的四氯金酸溶液搅匀后加热至沸腾，在持续揽拌中的同时快速地加入2.25ml1％的柠檬酸三钠溶液，大约2min左右溶液的颜色变至紫红后并不再变化，再加热搅拌溶液15min。移去热源，冷却至室温，双蒸水定容至100ml，4℃保存备用。通过扫描电镜图确定胶体金的径粒20nm左右。

4）金标鼠抗人血清蛋白的制备：用0.1mk2co3溶液调鼠抗人血清蛋白溶液的ph值至8.5，边搅拌边向其中加入步骤（3）的胶体金溶液，鼠抗人血清蛋白溶液与胶体金溶液的体积比为4:100，同时加入稳定剂以防止抗原与胶体金颗粒聚合沉淀，即得胶体金-鼠抗人血清蛋白结合物；所述稳定剂为bsa（牛血清白蛋白）和分子量20kd的聚乙二醇，二者终浓度分别为1％和0.1％。

5）金标肽段的制备：用0.08mhcl溶液分别调节金标肽段sgreqscqrqfe溶液的ph值分别至6.36，用0.08mk2co3溶液调节金标肽段creqiqrqqylnrcq溶液的ph值分别至9.46，边搅拌边向其中加入胶体金溶液，金标肽段sgreqscqrqfe、creqiqrqqylnrcq与胶体金溶液的体积比分别为7:100、5:100，同时加入bsa以防止表位肽与胶体金颗粒聚合沉淀，即得金标肽段。

6）金标鼠抗人血清蛋白、金标肽段的纯化：将步骤（4）（5）中制备的金标鼠抗人血清蛋白、金标多肽经1500r/min离心10min；收集沉淀溶于稳定剂（所述稳定剂为1％bsa和0.1％分子量20kd的聚乙二醇溶液）中，使其浓度分别为20％、25%；然后加至层析柱上进行纯化，过滤除菌，4℃保存。

7）胶体金结合垫的制备：调试三维平面点膜喷金仪仪器，金标肽段sgreqscqrqfe、creqiqrqqylnrcq及金标鼠抗人血清蛋白8：7：1混合后均匀的喷在玻璃纤维膜上，喷液量1.0pl/cm，37℃烘干过夜，封袋备用。

8）检测层的制备：调试三维平面点膜喷金仪仪器，将步骤2）中检测线肽段ggydednqrqhf、qeegirgeemeemvq、kqevqrggrynq、slreccqelqev、qeqikgeevrel肽段溶液均匀混合后喷洒，得到t检测线，喷液量为1.3pl/cm；将稀释好的兔抗人血清均匀喷在硝酸纤维素膜上，得到质控线，喷液量为0.8pl/cm。37℃烘干过夜，封袋备用。

9）试纸条的组装：将样品垫，胶体金结合垫，硝酸纤维素膜，吸水垫由一端依次粘贴在pvc底板上，即得一种用于血清特异性ige筛查的试纸条。

10）结果判断：

。

本产品利用碧根果、核桃、腰果优势表位肽及其突变体，提供一种用于坚果过敏特异性ige筛查的试纸条，适于工业化大规模生产。采用该试纸条，检测了7个血样，其中来源于坚果过敏患者的血样1个。检测结果显示，其中1个坚果过敏患者的血样中特异性ige均为阳性，且其他6个非坚果过敏患者的血清ige检测结果均为阴性，结果见图2。

实施例6。用于屋尘螨、粉尘螨过敏特异性ige筛查的试纸条。

1）肽段的制备：根据检测的对象，合成金标肽段anneikkv、pnachymkcplvkgqq、danqntkta、canhe，合成检测线肽段hgsepciihrg、eanqntkta、dglei、vpgidtnachfmkcplvkgqq、wnvpkiapksen、akird、wnvpkiapksen、gdng、thgkird。

2）肽段溶液的制备：将上述合成的金标肽段anneikkv、pnachymkcplvkgqq、danqntkta、canhe分别溶解到1.1％nacl溶液中，使其溶度为4mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、5mg/ml，即得到待金标肽段溶液；将合成的检测线肽段hgsepciihrg、eanqntkta、dglei、vpgidtnachfmkcplvkgqq、wnvpkiapksen、akird、wnvpkiapksen、gdng、thgkird分别溶解到0.9％nacl溶液中，使其溶度为5mg/ml、2mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、2mg/ml、4mg/ml、2mg/ml、5mg/ml、4mg/ml，即得到检测线肽段溶液。

3）胶体金溶液的制备：采用柠檬酸盐还原法用柠檬酸三钠还原剂将氯金酸还原制成20nm的胶体金溶液。准备一个250ml的三角角烧瓶，装入150ml的双蒸水，用恒温磁力搅拌器将溶液加热至沸腾，保持煮沸1min，弃去。加入双蒸水99ml，再加入1ml1％的四氯金酸溶液搅匀后加热至沸腾，在持续揽拌中的同时快速地加入2.25ml1％的柠檬酸三钠溶液，大约2min左右溶液的颜色变至紫红后并不再变化，再加热搅拌溶液15min。移去热源，冷却至室温，双蒸水定容至100ml，4℃保存备用。通过扫描电镜图确定胶体金的径粒20nm左右。

4）金标鼠抗人血清蛋白的制备：用0.1mk2co3溶液调鼠抗人血清蛋白溶液的ph值至8.5，边搅拌边向其中加入步骤（3）的胶体金溶液，鼠抗人血清蛋白溶液与胶体金溶液的体积比为4:100，同时加入稳定剂以防止抗原与胶体金颗粒聚合沉淀，即得胶体金-鼠抗人血清蛋白结合物；所述稳定剂为bsa（牛血清白蛋白）和分子量20kd的聚乙二醇，二者终浓度分别为1％和0.1％。

5）金标肽段的制备：用0.08mk2co3溶液调节金标肽段anneikkv、pnachymkcplvkgqq溶液的ph值分别至9.14、9.46，用0.08mhcl溶液分别调节金标肽段danqntkta、canhe溶液的ph值分别至6.34、5.74，边搅拌边向其中加入胶体金溶液，金标肽段anneikkv、pnachymkcplvkgqq、danqntkta、canhe与胶体金溶液的体积比分别为7:100、5:100、4:100、10:100，同时加入bsa以防止表位肽与胶体金颗粒聚合沉淀，即得金标肽段。

6）金标鼠抗人血清蛋白、金标肽段的纯化：将步骤（4）（5）中制备的金标鼠抗人血清蛋白、金标多肽经1500r/min离心10min；收集沉淀溶于稳定剂（所述稳定剂为1％bsa和0.1％分子量20kd的聚乙二醇溶液）中，使其浓度分别为20％、25%；然后加至层析柱上进行纯化，过滤除菌，4℃保存。

7）胶体金结合垫的制备：调试三维平面点膜喷金仪仪器，金标肽段anneikkv、pnachymkcplvkgqq、danqntkta、canhe及金标鼠抗人血清蛋白5：7：10：8：1混合后均匀的喷在玻璃纤维膜上，喷液量1.0pl/cm，37℃烘干过夜，封袋备用。

8）检测层的制备：调试三维平面点膜喷金仪仪器，将步骤2）中检测线肽段hgsepciihrg、eanqntkta、dglei、vpgidtnachfmkcplvkgqq、wnvpkiapksen、akird、wnvpkiapksen、gdng、thgkird肽段溶液均匀混合后喷洒，得到t检测线，喷液量为1.3pl/cm；将稀释好的兔抗人血清均匀喷在硝酸纤维素膜上，得到质控线，喷液量为0.8pl/cm。37℃烘干过夜，封袋备用。

9）试纸条的组装：将样品垫，胶体金结合垫，硝酸纤维素膜，吸水垫由一端依次粘贴在pvc底板上，即得一种用于血清特异性ige筛查的试纸条。

10）结果判断：

。

本产品利用屋尘螨、粉尘螨优势表位肽及其突变体，提供一种用于屋尘螨、粉尘螨过敏特异性ige筛查的试纸条，适于工业化大规模生产。采用该试纸条，检测了16个血样，其中来源于屋尘螨、粉尘螨过敏患者的血样4个。检测结果显示，全部4个屋尘螨、粉尘螨过敏患者的血样中特异性ige均为阳性，且其他12个非屋尘螨、粉尘螨过敏患者的血清ige检测结果均为阴性。

实施例7。用于初步食物过敏特异性ige筛查的试纸条。

1）肽段的制备：根据检测的对象，合成金标肽段sqqikmankkmkkeqysc、elqgdrrcqsqler、eaglap、pgsag、enllrffvapfpevfgk、sdfieedelk、lqkevdrlede，合成检测线肽段rdpyspsqdpysps、stwselaqgdvddcaqsqlkedmp、avffpycmrdwygaspsqdwysps、ltkfttqkqvsslfqlwk、prpqhpere、gkffeitpeknpqlrdldifl、hiatnavlffgrcvsp、iaav、hclkdgkg、pksrpdqs、yveq、ees、ytdapsfsdipnpigsensek、knrlnflkkisqryq、seeivpnsve、altdaetk、altdaetk、lflqnfsasar、flaeeadrkydevarklamveadlera、ekd、easqaadesermrk、deerm、fnskaivilvinegda、nkve、leivpnsaeerl。

2）金标肽段溶液的制备：将上合成的金标肽段sqqikmankkmkkeqysc、elqgdrrcqsqler、eaglap、pgsag、enllrffvapfpevfgk、sdfieedelk、lqkevdrlede分别溶解到0.9％nacl溶液中，使肽段溶度分别为2mg/ml、1mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、1mg/ml、3mg/ml、3mg/ml，即得到待金标肽段溶液；将合成的金标肽段rdpyspsqdpysps、stwselaqgdvddcaqsqlkedmp、avffpycmrdwygaspsqdwysps、ltkfttqkqvsslfqlwk、prpqhpere、gkffeitpeknpqlrdldifl、hiatnavlffgrcvsp、iaav、hclkdgkg、pksrpdqs、yveq、ees、ytdapsfsdipnpigsensek、knrlnflkkisqryq、seeivpnsve、altdaetk、altdaetk、lflqnfsasar、flaeeadrkydevarklamveadlera、ekd、easqaadesermrk、deerm、fnskaivilvinegda、nkve、leivpnsaeerl分别溶解到1,1％nacl溶液中，使金标肽段溶度分别为3mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、1mg/ml、1mg/ml、4mg/ml、3mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、4mg/ml、0.5mg/ml、2mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、3mg/ml、2mg/ml、0.5mg/ml、4mg/ml、2mg/ml、4mg/ml、2mg/ml、4mg/ml、2mg/ml，即得到检测线肽段溶液。

3）胶体金溶液的制备：采用柠檬酸盐还原法用柠檬酸三钠还原剂将氯金酸还原制成20nm的胶体金溶液。准备一个250ml的三角角烧瓶，装入150ml的双蒸水，用恒温磁力搅拌器将溶液加热至沸腾，保持煮沸1min，弃去。加入双蒸水99ml，再加入1ml1％的四氯金酸溶液搅匀后加热至沸腾，在持续揽拌中的同时快速地加入2.25ml1％的柠檬酸三钠溶液，大约2min左右溶液的颜色变至紫红后并不再变化，再加热搅拌溶液15min。移去热源，冷却至室温，双蒸水定容至100ml，4℃保存备用。通过扫描电镜图确定胶体金的径粒20nm左右。

4）金标鼠抗人血清蛋白的制备：用0.1mk2co3溶液调鼠抗人血清蛋白溶液的ph值至8.5，边搅拌边向其中加入步骤（3）的胶体金溶液，鼠抗人血清蛋白溶液与胶体金溶液的体积比为4:100，同时加入稳定剂以防止抗原与胶体金颗粒聚合沉淀，即得胶体金-鼠抗人血清蛋白结合物；所述稳定剂为bsa（牛血清白蛋白）和分子量20kd的聚乙二醇，二者终浓度分别为1％和0.1％。

5）金标肽段的制备：用0.13mk2co3溶液调节sqqikmankkmkkeqysc溶液的ph值至10.25，用0.08-0.13mhcl溶液分别调节elqgdrrcqsqler、eaglap、pgsag、enllrffvapfpevfgk、sdfieedelk、lqkevdrlede溶液的ph值分别至6.77、4.50、6.46、6.74、4.33、4.68，边搅拌边向其中加入胶体金溶液，sqqikmankkmkkeqysc、elqgdrrcqsqler、eaglap、pgsag、enllrffvapfpevfgk、sdfieedelk、lqkevdrlede与胶体金溶液的体积比分别为6:100、8:100、9:100、:8:100、3:100、5:100、10:100。同时加入bsa以防止表位肽与胶体金颗粒聚合沉淀，即得金标肽段。

6）金标鼠抗人血清蛋白、金标肽段的纯化：将步骤（4）（5）中制备的金标鼠抗人血清蛋白、金标多肽经1500r/min离心10min；收集沉淀溶于稳定剂（所述稳定剂为1％bsa和0.1％分子量20kd的聚乙二醇溶液）中，使其浓度分别为20％、25%；然后加至层析柱上进行纯化，过滤除菌，4℃保存。

7）金标胶体金结合垫的制备：调试三维平面点膜喷金仪仪器，金标肽段sqqikmankkmkkeqysc、elqgdrrcqsqler、eaglap、pgsag、enllrffvapfpevfgk、sdfieedelk、lqkevdrlede及金标鼠抗人血清蛋白8：7：6：7：10：9：5：1混合后均匀的喷在玻璃纤维膜上，喷液量0.8pl/cm，37℃烘干过夜，封袋备用。

8）检测层的制备：调试三维平面点膜喷金仪仪器，将步骤2）中检测线肽段溶液均匀混合后喷洒，得到t检测线，喷液量为1.0pl/cm；将稀释好的兔抗人血清均匀喷在硝酸纤维素膜上，得到质控线，喷液量为0.8pl/cm。37℃烘干过夜，封袋备用。

9）试纸条的组装：将样品垫，胶体金结合垫，硝酸纤维素膜，吸水垫由一端依次粘贴在pvc底板上，即得一种用于血清特异性ige筛查的试纸条。

10）结果判断：

。

本产品利用八大主要食物原优势表位肽及其突变体，提供一种用于初步食物过敏特异性ige筛查的试纸条，适于工业化大规模生产。采用该试纸条，检测了24个血样，其中存在食物过敏患者的血样12个。检测结果显示，全部12个食物过敏患者的血样中特异性ige均为阳性，且其他12无食物过敏的血清ige检测结果均为阴性。