益母草注射液的HPLC指纹图谱及其建立方法与流程

本发明属于注射制剂质量控制领域，具体涉及益母草注射液的hplc指纹图谱及其建立方法。

背景技术：

益母草注射液是一种治疗妇产科疾病的临床常用中药。研究表明，孕妇流产后采用益母草注射液能减少产后出血，因为益母草注射液作为收缩子宫药，它具有十分强烈的兴奋子宫平滑肌的作用，用于流产患者有助于恢复再生其子宫内膜的创伤，减少患者阴道的出血量和缩短出血的时间；此外，益母草注射液还具有治疗痛经的作用，能治疗月经期偏头痛。

益母草注射液的主要有效成分为总生物碱，根据物质基础研究结果表明，益母草注射液中总生物碱主要由盐酸水苏碱和氯化胆碱组成，其中盐酸水苏碱约占生物碱总量的90％。根据《卫生部药品标准中药成方制剂第二十册》，益母草注射液每支(1ml)含总生物碱以盐酸水苏碱(c7h13no2·hcl)计算，应为18～22mg。

由于益母草注射液中所含成分复杂，使益母草注射液的稳定性和可控性较差，不同药材、成品批次不同，质量也有较大的浮动。除总生物碱碱外，益母草注射液还包含很多其他已知或未知的成分。因此，单一成分含量测定不足以说明益母草注射液的质量，亦缺乏专属性。

中药指纹图谱是指某种(或某产地)中药材或中成药经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示该中药材或中成药药物特性的共有峰的图谱。根据质量控制目的，可分为指纹图谱和特征图谱。指纹图谱是基于图谱的整体信息，用于中药质量的整体评价，确保其内在质量的均一和稳定。指纹图谱从中医整体观念和中药药效来自多种化学物质综合作用的观点出发，能够建立比较客观、整体和多指标的综合评价体系，并通过图谱的整体特征，能够比较全面地反映出中药所含化学成分的种类与数量，是一种综合的、可量化的质量控制手段。与测定单一组分相比，它的优势在于能够提供更丰富、有效的质和量的信息，因此指纹图谱技术可以更客观、科学、合理地进行中药质量控制。中药指纹图谱能较为宏观和综合地反映中药的内在质量已被国内外研究者所认可。

因此，建立能够准确、全面的反应益母草注射液的化学成分的指纹图谱具有重要的意义。

杨超等(《益母草注射液指纹图谱的研究》)公开了一种建立益母草注射液指纹图谱的方法，该方法利用高效液相色谱-蒸发光散射检测法柱建立了益母草注射液指纹图谱，确定了该指纹图谱中的色谱峰有cl^-、5-羟甲基-2糠酸、水苏碱、na⁺、k⁺、胆碱。对31批益母草注射液进行指纹图谱检测，并采用中药指纹图谱相似度评价系统对各批样品指纹图谱进行相似度计算，相似度均大于0.90。

但是，随着对益母草注射液化学成分研究的深入，发现益母草注射液中存在生物碱类成分胡芦巴碱，而现有的益母草注射液hplc指纹图谱均不能对益母草注射液中的胡芦巴碱进行有效的控制。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种新的益母草注射液的hplc指纹图谱及其建立方法。该hplc指纹图谱中的共有特征峰包括2个未知峰、盐酸水苏碱峰和胡芦巴碱峰，利用该hplc指纹图谱能够对益母草注射液中的胡芦巴碱和盐酸水苏碱等物质进行有效的质量控制，使制剂更加稳定、可控。

本发明提供了一种益母草注射液的hplc指纹图谱的建立方法，所述方法利用高效液相色谱法，具体包括以下步骤：

(1)制备供试品溶液：取益母草注射液，即得；

(2)吸取供试品溶液，注入高效液相色谱仪中进行检测，检测条件如下：

色谱柱：填充剂为磺酸基键合硅胶的阳离子交换剂；

流动相：由a相b相组成，其中，a相为乙腈，b相为磷酸二氢钾溶液。

进一步地，步骤(2)中，所述磷酸二氢钾溶液的浓度为10mmol/l～40mmol/l；所述a相与b相的体积比为(5～11)：(89～95)；所述检测的流速0.6～1.2ml/min；所述检测的柱温为25～35℃；所述检测波长为185～200nm。

进一步地，步骤(2)中，所述磷酸二氢钾溶液的浓度为20mmol/l；所述a相与b相的体积比为8:92；所述检测的流速为0.8ml/min；所述检测的柱温为30℃；所述检测波长为192nm。

进一步地，所述步骤还包括取对照品溶液注入高效液相色谱仪中进行检测，所述对照品为盐酸水苏碱、胡芦巴碱中的一种或两种。

进一步地，所述对照品溶液的制备方法为：取盐酸水苏碱对照品，加水溶解，即得盐酸水苏碱对照品溶液；取胡芦巴碱对照品，加水溶解，即得胡芦巴碱对照品溶液。

进一步地，所述盐酸水苏碱对照品溶液的浓度为0.5～2.0mg/ml；所述胡芦巴碱对照品溶液的浓度为5～20μg/ml。

进一步地，所述盐酸水苏碱对照品溶液的浓度为0.7mg/ml；所述胡芦巴碱对照品溶液的浓度为8μg/ml。

本发明还提供了一种益母草注射液的hplc指纹图谱，它是按照上述的方法构建的，它包含以下4个共有特征峰：以4号峰为参照峰，1号峰相对保留时间0.23±0.05，2号峰相对保留时间0.77±0.05，3号峰相对保留时间0.88±0.05，4号峰相对保留时间1.00±0.05。

进一步地，它包含以下4个共有特征峰：按照保留时间升序排列，各共有特征峰分别是：1号峰：保留时间3.4±0.05min；2号峰：保留时间11.3±0.05min；3号峰：保留时间12.9±0.05min；4号峰：保留时间14.7±0.05min。

进一步地，所述共有特征峰的峰面积之比为1号峰：2号峰：3号峰：4号峰＝23:2:17:9。

进一步地，所述共有特征峰的峰面积占总峰面积的比例分别为：1号峰23％、2号峰2％、3号峰17％、4号峰9％。

进一步地，所述3号峰为盐酸水苏碱的吸收峰，所述4号峰为胡芦巴碱的吸收峰。

进一步地，所述hplc指纹图谱如图1所示。

本发明还提供了一种益母草注射液，它的hplc指纹图谱如上所述。

本发明首次建立了包括2个未知峰、盐酸水苏碱峰和胡芦巴碱峰的4个共有特征峰的益母草注射液hplc指纹图谱，利用该hplc指纹图谱能够对益母草注射液中的胡芦巴碱和盐酸水苏碱等物质进行有效的质量控制，使制剂更加稳定、可控。

本发明建立的益母草注射液的hplc指纹图谱有4个共有特征峰，利用该hplc指纹图谱为对照指纹图谱进行相似度分析，13批益母草注射液样品相似度分别为0.995、0.994、0.999、0.995、0.972、0.982、0.998、0.995、0.998、0.962、0.960、0.954、0.962，平均为0.982，各益母草注射液样品的hplc指纹图谱与对照指纹图谱相似度均大于0.9。说明本发明建立的益母草注射液hplc指纹图谱具有很强的代表性，本发明为益母草注射液提供了一种新的质量控制方法。

本发明建立益母草注射液的hplc指纹图谱方法耐用性、精密度和重复性良好。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为实施例2建立的益母草注射液的hplc指纹图谱，其中，1号峰为未知峰，2号峰为未知峰，3号峰为盐酸水苏碱，4号峰为胡芦巴碱。

图2为方法耐用性评价中柱温为25℃时所得的hplc指纹图谱。

图3为方法耐用性评价中柱温为30℃时所得的hplc指纹图谱。

图4为方法耐用性评价中柱温为35℃时所得的hplc指纹图谱。

图5为精密度测试中第1次进样所得的hplc指纹图谱。

图6为精密度测试中第2次进样所得的hplc指纹图谱。

图7为精密度测试中第3次进样所得的hplc指纹图谱。

图8为精密度测试中第4次进样所得的hplc指纹图谱。

图9为精密度测试中第5次进样所得的hplc指纹图谱。

图10为精密度测试中第6次进样所得的hplc指纹图谱。

图11为重复性考察中第1份供试品溶液测得的hplc指纹图谱。

图12为重复性考察中第2份供试品溶液测得的hplc指纹图谱。

图13为重复性考察中第3份供试品溶液测得的hplc指纹图谱。

图14为重复性考察中第4份供试品溶液测得的hplc指纹图谱。

图15为重复性考察中第5份供试品溶液测得的hplc指纹图谱。

图16为重复性考察中第6份供试品溶液测得的hplc指纹图谱。

具体实施方式

本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。

盐酸水苏碱对照品购自中国食品药品检定研究院，胡芦巴碱对照品购自中国食品药品检定研究院。

磺酸基键合硅胶(scx)的阳离子交换剂购自安捷伦公司。

实施例1、制备益母草注射液

取益母草加3倍重量的水煎煮三次，第一次2小时，第二次1.7小时，第三次1.5小时，滤过，滤液减压浓缩至相对密度为1.36～1.38(80℃)的清膏，放冷，加水稀释至含水量为35％；然后用乙醇沉淀处理三次，第一次加入乙醇使含醇量达78％，第二次加入乙醇使含醇量达88％，第三次加入乙醇使含醇量达92％；静置，取上清液回收乙醇至稠膏(命名为醇沉膏)。

取醇沉膏，加3～5倍重量的注射用水，搅拌，静置，取上清液用15wt.％活性炭脱色至溶液为淡黄色至黄色，用40％氢氧化钠溶液或稀盐酸调节ph至4.8～5.2，加入5wt.％活性炭，煮沸10～15分钟，脱炭过滤得益母草浓溶液(每1ml含总生物碱以盐酸水苏碱计，不得少于35mg)。

准确称取益母草浓溶液[含总生物碱(以盐酸水苏碱计)20g]，置配制罐中，加入适量注射用水，加入苯甲醇10ml，搅匀，加入活性炭(1～5g)，循环脱炭10分钟后补加注射用水使体系至1000ml，搅匀、精滤、灌封、灭菌、包装，即得益母草注射液。

实施例2、本发明益母草注射液的hplc指纹图谱的建立方法

(1)制备供试品溶液：取益母草注射液(按照实施例1的方法制得的)1ml，置水浴中加热0.5小时，取出，放冷，加水溶解转移至25ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

(2)制备对照品溶液：

称取7mg盐酸水苏碱对照品，精密称定，置于10ml容量瓶中，加水溶解并定容，即得盐酸水苏碱对照品溶液；该盐酸水苏碱对照品溶液中盐酸水苏碱浓度为0.7mg/ml；

称取80μg胡芦巴碱对照品，精密称定，置于10ml容量瓶中，加水溶解并定容，即得胡芦巴碱对照品溶液；该胡芦巴碱对照品溶液中胡芦巴碱浓度为8μg/ml。

(3)分别吸取10μl对照品溶液和供试品溶液，注入高效液相色谱仪中进行测定，色谱条件如下：

色谱柱：以磺酸基键合硅胶(scx)的阳离子交换剂为填充剂(agilentzorbax300-scx，4.6×250mm，5μm)；

流动相：由a相和b相组成，其中a相为乙腈，b相为20mmol/l磷酸二氢钾水溶液，a相与b相的体积比为8:92；

流速：0.8ml/min；

柱温：30℃；

检测波长：192nm。

盐酸水苏碱峰与胡芦巴碱峰的分离度应不小于2.0。

按照上述方法，测得益母草注射液的hplc指纹图谱(如图1所示)，其中1号峰为未知峰，2号峰为未知峰，3号峰为盐酸水苏碱，4号峰为胡芦巴碱。按保留时间升序排列，各色谱峰的保留时间分别是：1号峰：保留时间3.4min；2号峰：保留时间11.3min；3号峰：保留时间12.9min；4号峰：保留时间14.7min。各色谱峰的峰面积分别为：1号峰23％、2号峰2％、3号峰17％、4号峰9％。

以下通过实验例证明本发明检测方法的有益效果。

实验例1本发明益母草注射液hplc指纹图谱的相似度评价

1、实验方法

(1)按照实施例2的方法，检测24批益母草注射液(均为成都第一制药上市的市售品)，生成各hplc指纹图谱。

(2)按照实施例1的方法制得13批益母草注射液，按照实施例2的方法，检测13批益母草注射液的hplc指纹图谱。然后以实施例2所得hplc指纹图谱为对照指纹图谱进行相似度分析。

2、实验结果

(1)24批益母草注射液的hplc指纹图谱具有4个共有特征峰，按保留时间升序排列，各色谱峰的保留时间分别是：1号峰：保留时间3.4min；2号峰：保留时间11.3min；3号峰：保留时间12.9min；4号峰：保留时间14.7min；各色谱峰的峰面积分别为：1号峰23％、2号峰2％、3号峰17％、4号峰9％。

(2)以实施例2所得hplc指纹图谱为对照指纹图谱进行相似度分析，13批益母草注射液样品hplc指纹图谱相似度分别为0.995、0.994、0.999、0.995、0.972、0.982、0.998、0.995、0.998、0.962、0.960、0.954、0.962，平均为0.982，各样品hplc指纹图谱与对照指纹图谱之间的相似度均大于0.9。说明本发明建立的益母草注射液hplc指纹图谱具有很强的代表性。

实验例2本发明益母草注射液hplc指纹图谱建立方法的方法学考察

(1)方法耐用性评价

a.流速

按照实施例1的方法，制得益母草注射液(批号：190302)。参照实施例2的方法，以益母草注射液(批号：190302)为供试品，在不同的流速(表1所示)下进行hplc检测(其余检测条件与实施例2一致)，记录hplc色谱图。结果如下：

表1不同流速条件下益母草注射液(批号：190302)的相似度结果表

从以上结果可知，0.6～1.2ml/min流速下所得hplc指纹图谱的相似度均高达0.999，3号峰(盐酸水苏碱)与4号峰(胡芦巴碱)的分离度均高达2.02以上。

b.柱温

按照实施例1的方法，制得益母草注射液。参照实施例2的方法，以该益母草注射液为供试品，在流速为0.8ml/min，柱温分别为25℃、30℃、35℃条件下进行hplc检测(其余检测条件与实施例2一致)，记录色谱图，详见附图2-4。结果如下：

表2不同柱温考察结果表

从以上结果可知，柱温为25℃～35℃时下所得hplc指纹图谱的相似度均高达0.990以上；综合考虑分离度和分析时间，当柱温为30℃时，各性能参数最佳。

c.流动相比例

按照实施例1的方法，制得益母草注射液。参照实施例2的方法，以该益母草注射液为供试品，以流动相a:流动相b体积＝8:92为标准流动相比例，按中国药典2015年版四部0512高效液相色谱法的规定设计5种不同的流动相比例(参见表3)，分别进行hplc检测(其余检测条件与实施例2一致)，记录色谱图。结果如下表：

表3不同流动相比例条件下所得指纹图谱的相似度测定结果表

从以上结果可知，上述流动相比例下所得hplc指纹图谱的相似度均高达0.99以上，3号峰(盐酸水苏碱)与4号峰(胡芦巴碱)的分离度均高达3.68以上。

(2)精密度测试

以益母草注射液(按照实施例1的方法制得，批号：190302)为供试品，按照实施例2的方法进行hplc测定，重复进样6次，记录色谱图，详见附图5-10。结果如下：

表4精密度测试结果

从以上结果可知，6次进样所得hplc指纹谱图的相似度均为0.999，rsd＝0，说明本发明益母草注射液hplc指纹图谱建立方法的精密度良好。

(3)重复性考察

以益母草注射液(按照实施例1的方法制得，批号：190302)为供试品，按照实施例2的方法平行制备6份供试品溶液，分别按照实施例2的方法进行hplc测定，记录色谱图，详见附图11-16。根据测定结果计算相似度，结果如下：

表5重复性测试结果

从以上结果可知，重复性试验的6个供试品溶液的hplc指纹谱图相似度均为0.999，rsd＝0。说明本发明益母草注射液hplc指纹图谱建立方法的重复性好。

综上，本发明提供了一种益母草注射液的hplc指纹图谱及其建立方法。以该hplc指纹图谱为对照指纹图谱进行相似度分析，13批益母草注射液样品相似度分别为0.995、0.994、0.999、0.995、0.972、0.982、0.998、0.995、0.998、0.962、0.960、0.954、0.962，平均为0.982，各益母草注射液样品的hplc指纹图谱与对照指纹图谱相似度均大于0.9。本发明首次建立了包括2个未知峰、盐酸水苏碱峰和胡芦巴碱峰的4个共有特征峰的益母草注射液hplc指纹图谱，利用该hplc指纹图谱能够对益母草注射液中的胡芦巴碱和盐酸水苏碱等物质进行有效的质量控制，使制剂更加稳定、可控。本发明为益母草注射液提供了一种新的质量控制方法。