一种工程化设计方法及交链孢酚的系列核酸适配体及应用其的传感器与流程

1.本发明涉及通过工程化设计获得的真菌毒素交链孢酚的系列核酸适配体及应用其的超灵敏传感器，具体涉及一种工程化设计方法及交链孢酚的系列核酸适配体及应用其的传感器，属于生物技术和分析测试领域。


背景技术：

2.真菌毒素是由寄生于谷物或水果等农作物上的真菌或酶菌，在适宜条件下产生的具有生物活性的一类物质。真菌毒素的种类很多，据目前不完全统计超过400多种，其中对人和动物危害比较大的主要有：黄曲霉毒素(aflatoxin，af)、赭曲霉毒素a(ochratoxin，ota)、呕吐毒素(deoxynivalnol，don)、玉米赤霉烯酮(zearalenone，zen)、伏马毒素(fumonisin b1，fb1)、交链孢酚(aoh)、交链孢酚单甲醚(ame)等。真菌毒素广泛污染农作物、食品及饲料等植物源产品，不仅能导致农产品霉败变质，营养物质损失，品质降低，还通过对机体dna、rna、蛋白质的合成抑制以及对细胞结构的破坏而引起真菌毒素中毒。由于它们容易造成食品的污染，对人体健康构成很大的威胁，因此食品中真菌毒素的污染已经成为全世界关注的问题。
3.为加强对食品中真菌毒素的监控，各国均对不同食品中真菌毒素设置了限量标准。真菌毒素实验室常用检测方法是基于色谱技术和质谱技术的各种方法。这类方法虽具有准确度高和同时检测多种靶标的优势，但存在样品前处理步骤复杂繁琐、耗时长、仪器昂贵、需要专业技术人员操作、不适合现场操作等不足之处。为了解决上述问题，满足快速检测的需求，近些年来还开发了一些快速检测产品。其主流是基于抗体的快速检测产品方法，比如酶联免疫试剂盒和胶体金试纸条。这类方法最大的优势是操作简单、快速、检测成本低，缺点是高特异性小分子靶标的抗体比较难以获得，而且抗体批次与批次间的性能差异较大。
4.核酸适配体是通过selex技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,即系统指数富集的适配体系统进化技术)获得的单链或双链的dna或rna(nature,1990,346,818-822；nature,1992,355,564-566)。核酸适配体能够特异性识别包括蛋白质、小分子、细胞和组织在内的多种多样的靶分子。与抗体相比，核酸适配体化学和物理结构稳定，化学合成获得，因而价格较低，且批次与批次间性能差异小。近些年来核酸适配体在分析测试领域备受关注，报道了一系列用于食品中真菌毒素快速检测的新方法。目前成功筛选出核酸适配体的真菌毒素主要包括黄曲霉毒素、赭曲霉毒素a、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮、伏马毒素、交链孢酚。
5.除了亲和力和特异性之外，核酸适配体的长度和结合位点数也直接影响其实际应用的效果。比如在亲和柱的应用中，短的核酸适配体的合成成本更低，具有多结合位点的核酸适配体(多价核酸适配体)比具有单一结合域的核酸适配体(单价核酸适配体)的柱容量更高。在传感器的应用中，除了有利于降低成本之外，短的核酸适配体便于在固相载体上的
固定，便于传感器的探针设计。然而原始核酸适配体的碱基数一般在60～100个左右，合成成本高，与下游应用难以兼容，因此需要经过截短和工程化设计。遗憾的是，由于截短和工程化设计的工作量和难度较大，绝大多数核酸适配体尚未进行截短和确定关键结合域，小分子靶标多价核酸适配体的报道更是寥寥无几，极大地限制了其下游应用。


技术实现要素：

6.在本发明中，我们将原长59个碱基的aoh核酸适配体aoh-59进行截短、裂分、碱基变换多种工程化设计。利用aoh与核酸适配体结合后其荧光发射会增强的特性，方便地鉴定出aoh-59与aoh的关键结合域；优化出仅具有23个碱基的aoh的核酸适配体aoh 6c；裂分获得长度仅为15个碱基的aoh的核酸适配体aoh 6c-5-7-l；并依据结合域成功地设计出长度分别仅为30个碱基和39个碱基的二价核酸适配体(aoh 6c-d-1)和三价的核酸适配体(aoh 6c-h-1)。其中多价核酸适配体的设计包括如下步骤：(1)通过截短、碱基变换的方法鉴定出原长核酸适配体的关键结合域；(2)设计含有多个关键结合域的序列，各结合域之间通过若干互补碱基对隔开，末端添加若干互补碱基对稳定最末端的关键结合域；(3)对所设计的系列多价核酸适配体的亲和力、特异性进行测试，筛选出性能最佳的序列；(4)测定每个序列与靶标的实际结合比。本发明还利用上述截短和裂分获得的核酸适配体分别构建了两个倏逝波光纤传感器，实现对aoh的超灵敏检测，对缓冲液中aoh的检出限分别为42fm和7.4fm，对小麦萃取液中标准添加的aoh的检出限分别为0.096ng/g和0.015ng/g，均低于10ng/g的国家限量标准。
7.本发明的aoh的系列核酸适配体具有如下优势：
8.1)本发明获得的aoh的系列核酸适配体的长度均远小于原始的核酸适配体的长度(59个碱基)。短的核酸适配体长度有利于降低合成成本，与下游应用的兼容性更好。
9.2)本发明鉴定出了aoh与核酸适配体的关键结合位点(5个碱基的结合域)，为aoh核酸适配体的工程化设计奠定了基础。
10.3)本发明方法获得的截短的和裂分的核酸适配体仅分别具有23个和15个碱基，有利于提高核酸适配体在传感器界面上的上载密度，特别是简化核酸适配体互补dna链(通常12-15个碱基)的设计。
11.4)本发明获得了二价和三价的aoh的核酸适配体，其亲和力比原始的核酸适配体高，且每一条核酸适配体可以结合2个或者3个aoh，有利于提高亲和柱应用中aoh的柱容量。
12.5)本发明方法利用截短的和裂分的核酸适配体构建的倏逝波传感器，分别比使用原长aoh核酸适配体的基于荧光增强的方法的灵敏度高一百万倍和六百万倍。
13.6)本发明方法利用截短的和裂分的核酸适配体构建的倏逝波传感器，均实现了对小麦萃取液中aoh的具有超高灵敏度和特异性的检测，检出限分别低于国家限量标准100和600倍。
14.7)本发明方法利用截短的和裂分的核酸适配体构建的倏逝波传感器，对小麦萃取液中aoh的检测，无需样品富集和纯化，大幅降低检测成本，将检测时间从1-2天，缩短到1个小时。
附图说明
15.图1a-1d为原长aoh核酸适配体aoh-59的性能表征图：图1a表示aoh-59滴定aoh的荧光光谱图、图1b表示aoh-59滴定aoh的标准曲线、图1c表示aoh-59的靶标选择性、图1d表示aoh对aoh-59二级构象的影响。
16.图2a和2b分别为利用aoh-59荧光检测缓冲溶液中aoh(图2a)和小麦粉加标aoh(图2b)的工作曲线图。
17.图3为对aoh-59进行截短的设计的示意图。
18.图4为基于aoh-59截短的12条短链的二级结构预测结果图。
19.图5为基于aoh-59工程化设计的12条短链对aoh的相对亲和力示意图。图中横坐标数字为对应的各序列名称的缩写，例如aoh 1记为1，以此类推；aoh 6c记为6。
20.图6a和6b为aoh 6c、aoh 6ct、aoh 6ca、aoh 6cg和aoh 7的碱基组成(图6a)和它们对aoh相对亲和力(图6b)的示意图。横坐标中aoh代表仅含aoh的负控制样品。
21.图7a和7b为基于aoh 6c，改变未配对c碱基周围的碱基组成所得到的一系列短链(从aoh 6c-1到aoh 6c-10的碱基组成(图7a)和它们对aoh相对亲和力(图7b)示意图。图中横坐标数字为对应的序列名称的缩写，例如aoh 6c-1记为1，以此类推。
22.图8a和8b为aoh系列二价核酸适配体(图8a)及其对aoh的相对亲和力(图8b)示意图。图中横坐标数字为对应的二价核酸适配体的缩写，例如aoh 6c-a1记为1，以此类推。
23.图9a-9d为单价核酸适配体aoh 6c(图9a，图9c)和二价核酸适配体aoh 6c-d-1(图9b，图9d)的解离常数(kd)和选择性测试结果图。
24.图10a和10b为aoh系列三价核酸适配体(图10a)及其对aoh的相对亲和力(图10b)示意图。图中横坐标数字为对应的三价核酸适配体的缩写，例如aoh 6c-e1记为e1，以此类推。
25.图11a和11b为aoh三价核酸适配体aoh 6c-h1的解离常数(kd)(图11a)和选择性(图11b)的测定图。
26.图12a-12c为利用jobs plot测定aoh单价核酸适配体aoh 6c(图12a)、二价核酸适配体aoh 6c-d1(图12b)和三价核酸适配体aoh 6c-h1(图12c)与aoh的结合比示意图。
27.图13a-13c为基于单价核酸适配体aoh 6c构建的倏逝波光纤传感器实现了对aoh的超灵敏和高特异性的检测图。(图13a)对缓冲溶液中aoh进行检测的工作曲线、(图13b)对其它毒素小分子(交链孢酚单甲醚(ame)、棒曲霉素(patulin)、玉米赤霉烯酮(zen)、赭曲霉毒素(ota)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(don))的选择性测试柱状图及(图13c)对小麦萃取液中标准添加的aoh进行检测的工作曲线。所有测试在缓冲液(0.9mm氯化钙、2.685mm氯化钾、1.47mm磷酸二氢钾、0.49mm氯化镁、137mm氯化钠、8.1mm磷酸氢二钠，ph 7.4)中进行。
28.图14a-14e为基于裂分的aoh核酸适配体aoh 6c-5-7-l和aoh 6c-5-7-r构建的倏逝波光纤传感器实现了对aoh的超灵敏和高特异性的检测图。(图14a)裂分核酸适配体的设计；(图14b)对缓冲溶液中aoh进行检测的工作曲线(aoh与aoh 6c-5-7-r-cy5.5同时通入光纤反应池)；(图14c)对缓冲溶液中aoh进行检测的工作曲线(先在光纤反应池中通入aoh，再通入aoh 6c-5-7-r-cy5.5)；(图14d)对其它毒素小分子(交链孢酚单甲醚(ame)、棒曲霉素(patulin)、玉米赤霉烯酮(zen)、赭曲霉毒素(ota)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(don))的选择性测试柱状图；(图14e)对小麦萃取液中标准添加的aoh进行检测的工作曲线。(图14d-14e)均
采用(图14c)的测试方法。所有测试在缓冲液(0.9mm氯化钙、2.685mm氯化钾、1.47mm磷酸二氢钾、0.49mm氯化镁、137mm氯化钠、8.1mm磷酸氢二钠，ph 7.4)中进行。
具体实施方式
29.表1.本发明所使用的dna探针
30.[0031][0032]
实施例1.aoh原长核酸适配体aoh-59解离常数kd、选择性和二级结构的表征。
[0033]
aoh在紫外光激发下会发射出微弱的荧光。我们发现当aoh与其核酸适配体aoh-59混合以后，400nm(纳米)处的荧光值会发生显著的增加。因此我们基于荧光强度的性质来方
便地测定aoh核酸适配体的解离常数kd、选择性。
[0034]
kd的测定：首先用1
×
aoh筛选缓冲溶液(0.9mm(毫摩尔每升)cacl2,2.7mm kcl,1.5mm kh2po4,0.5mm mgcl2,137mm nacl and 8mm na2hpo4,ph 7.5)配置1μm(微摩尔每升)的aoh溶液。接着在1
×
aoh筛选缓冲溶液中分别配置浓度为0、20、100、400、1000、2000和4000nm(纳摩尔每升)的aoh-59溶液。然后将上述aoh溶液与不同浓度的aoh-59溶液按照体积比1：1进行混合，并于常温下避光孵育30分钟。孵育结束后，进行荧光检测，荧光激发波长为260nm，扫描范围为300-480nm。
[0035]
选择性测试：首先用1
×
aoh筛选缓冲溶液(即上述kd测定的缓冲液)配置浓度为0.4μm的aoh-59溶液。接着用1
×
aoh筛选缓冲溶液分别配置1μm的交链孢酚(aoh)、交链孢酚单甲醚(ame)，呕吐毒素(don)，棒曲霉素(patulin)和玉米赤霉烯酮(zen)溶液。然后将上述配制好的aoh-59溶液与各个靶标溶液按照体积比1：1进行混合，并于常温下避光孵育30分钟。孵育结束后，利用荧光仪进行检测。荧光激发波长为260nm，扫描范围为300-480nm。
[0036]
利用圆二色谱表征aoh-59与aoh结合所引起的aoh-59的二级构象的变化情况。首先用1
×
aoh缓冲溶液(即上述aoh-59kd测定的缓冲液)配置0、1、10、20μm的系列aoh溶液。然后将1μl 100μm的原长核酸适配体aoh-59加入上述配好的100μl不同浓度的aoh溶液当中，并于常温下避光孵育30分钟。孵育结束后，利用圆二色谱仪进行检测。cd的参数设置：扫描范围为180-400nm，data pitch为1nm，扫描方式为连续扫描，扫描速度为100nm/分钟，响应时间为1s，带宽为2nm，扫描次数为3次。
[0037]
上述实验的结果如图1a-1d所示。其中图1a为不同浓度的aoh-59滴定固定浓度的aoh得到的荧光光谱图,图1b为aoh 400nm处的荧光值随aoh-59浓度变化的标准曲线。随着aoh-59浓度的增加，400nm处的荧光强度逐渐增加，按照1:1的结合比例，经过非线性拟合得到aoh-59的kd为423
±
20nm。该测试结果说明aoh-59对aoh具有中等的亲和力。如图1c所示，把aoh与aoh-59混合样品的荧光值设定为100％，对ame的信号响应为75％，对于其他真菌毒素，信号变化在15％左右。ame是aoh的同系物，两者的分子结构仅有一个甲基的区别。该选择性测试结果说明aoh-59对aoh和ame的亲和力远高于其它种类的真菌毒素，因而对aoh和ame具有好的特异性。如图1d所示，在圆二色谱实验中，不同浓度的aoh滴定固定浓度的aoh-59，随着aoh浓度的增加，aoh-59在275nm处的正峰逐渐增强，在250nm处的负峰逐渐减弱。该结果表明aoh-59具有茎环结构，aoh与aoh-59的结合增强了茎环结构的稳定性。
[0038]
实施例2.利用原长aoh核酸适配体aoh-59荧光测定缓冲液和小麦粉中的aoh。
[0039]
对于缓冲液中aoh的测定，首先用1
×
aoh筛选缓冲溶液(即上述aoh-59kd测定的缓冲液)将aoh-59至0.4μm备用。用1
×
aoh筛选缓冲溶液配制浓度分别为0nm、20nm、100nm、400nm、1μm、2μm、4μm和10μm的aoh溶液。然后将上述配制好的aoh-59溶液与不同浓度的aoh按照体积比1：1进行混合，并于常温下避光孵育30分钟。孵育结束后，利用荧光仪进行检测。荧光激发波长为260nm，扫描范围为300-480nm。
[0040]
对于在小麦样品中aoh的测定，目前针对真实样本中真菌毒素的检测主要依赖于大型的分析仪器。而真实样本中复杂基质成分的去除往往过于繁琐，这也是传统检测手段所存在的弊端之一。核酸适配体亲和柱是将核酸适配体通过化学方法偶联到固相填充材料上，起到保留和净化目标物作用的一种新型固相萃取技术。我们利用aoh-59亲和柱，对小麦粉样本进行了前处理，将净化得到的aoh利用上述荧光增强的方法进行检测。具体操作流程
如下所述：
[0041]
1、加标：取1g(克)小麦粉，加入5ml的50％纯乙腈，然后分别加入0、258ppb、645ppb、1290ppb、2580ppb的aoh(终浓度分别为：0nm、200nm、500nm、1μm、2μm)。
[0042]
2、提取：将标准添加了aoh的上述小麦粉混合液震荡30分钟，然后在每分钟10000转的转速下离心10分钟。对上清液进行过滤，取1ml(毫升)滤液，加入9ml 1
×
aoh筛选缓冲溶液。
[0043]
3、过柱：将aoh适配体亲和柱用5ml 1
×
aoh筛选缓冲溶液活化备用，然后取上述稀释过的提取液5ml过柱，丢弃过柱液。
[0044]
4、淋洗：用1ml 1
×
aoh筛选缓冲溶液淋洗亲和柱，丢弃淋洗液。
[0045]
5、洗脱：用1ml纯甲醇进行洗脱，收集洗脱液。6、aoh的荧光检测：取上述20μl(微升)甲醇洗脱液，加入80μl 1
×
aoh筛选缓冲溶液，然后加入1μl 100μm的aoh-59，避光孵育30分钟后测荧光。
[0046]
对缓冲液和小麦粉中标准添加的aoh的荧光检测结果如图2a和2b所示。如图2a所示，在测试的浓度范围内(0-5μm)，荧光强度随着aoh的浓度增加而线性增加(r2＝0.986)。基于三倍信噪比计算得到的aoh检出限(lod)为20nm。
[0047]
如图2b所示，检测了小麦粉标准添加的aoh。由于小麦粉本身成分较为复杂，为了尽可能地消除基质对于识别和测试的干扰，我们先利用了aoh的核酸适配体亲和柱对小麦粉当中的aoh进行了纯化。对小麦粉标准添加的aoh的lod为50nm。考虑到在整个前处理当中的稀释过程，转换为加标浓度lod为645ng/g,高于国家限量标准。
[0048]
实施例3.对aoh-59的剪切(截短)、裂分、碱基变换工程化设计。
[0049]
如图3所示，aoh-59由59个碱基组成，按照mfold软件模拟，其具有茎环结构。我们分别对aoh-59采取了12种不同的截短设计，所有设计的探针的序列见表1，预测的二级结构见图4。
[0050]
①
将aoh-59从箭头所示位置裂分两条短链aoh 1和aoh 2；
[0051]
②
由于aoh-59中间有一个大环，为了确定是否此环状区域参与识别aoh，剪切掉虚线圆环部分的碱基，得到aoh 3；
[0052]
③
、
④
由于aoh-59的茎部分较长，为确定茎部是否是aoh的结合位点，截掉箭头所示以下部分的碱基，分别得到aoh 4和aoh 5。
[0053]
⑤
通过实验我们发现，去除大环的aoh 3、去除箭头
③
下方碱基的aoh 4对aoh的亲和力aoh-59相当(图5)，因此我们将大环、
③
下方的碱基同时进行了去除，得到了aoh 6c。
[0054]
⑥
aoh 6c存在一个未配对的c碱基(红圈区域)，为了探究其是否是与aoh结合的关键位点，我们将c碱基剔除得到了aoh 7。
[0055]
⑦
、
⑧
、
⑨
为确定茎部是否存在aoh的结合位点，我们将aoh 6c分别从
⑦
、
⑧
、
⑨
箭头的位置剪切，去除了箭头以下的碱基，分别得到了aoh 10、aoh 9和aoh 8。
[0056]
⑩
为了验证aoh 6c能否设计为裂分的核酸适配体，将aoh 6c从箭头所示位置裂分两条短链aoh 11和aoh 12。
[0057]
我们采用了上述荧光法对这些截短的核酸短链对aoh的识别能力进行了测定。结果如图5所示，各短链对aoh的响应差别很大。基于aoh-59裂分得到的aoh 1和aoh 2，只有两者同时存在时荧光强度才大幅增加，说明aoh-59可以进行裂分设计，仍然保持其与aoh的结
合能力，单独的一条裂分链不能与aoh结合。aoh 3、aoh 4、aoh 5和aoh 6c均能够与aoh结合，引起荧光增加，说明均含有aoh的结合域。随着双链区域长度的缩短(从aoh 3到aoh 6c)，荧光增加逐渐减小，说明双链结构可以稳定aoh与其结合域的结合。
[0058]
为了进一步探索靶标与适配体结合的详细情况，我们对aoh 6c进行了截短设计。具体的剪切思路如图3所示。通过对比荧光值的变化，我们可以看出截短后的短链aoh 8、aoh 9和aoh 10的荧光增强值比aoh 6c低。结果表明，互补碱基对的确起到稳定aoh与其结合域结合的作用。基于aoh 6c裂分得到的aoh 11与aoh 12在两者单独或者同时存在时均不能引起荧光强度的增加。说明aoh 6c不能进行裂分。同时，我们发现aoh 7比aoh 6c少一个未配对的c碱基，其完全丧失了对aoh的结合能力(图5)。说明该c碱基是aoh的关键结合位点。
[0059]
实施例4.利用碱基变换探明aoh 6与aoh的关键结合位点。
[0060]
如图6a所示，我们将aoh 6c中的c碱基进行了碱基种类的替换，得到了新的短链aoh 6t、aoh 6a和aoh 6g。如图6b所示，aoh 6t、aoh 6a和aoh 6g与aoh相互作用引起的荧光增强均没有aoh 6c高，说明c碱基是与aoh相互作用的关键结合位点。
[0061]
实施例5.aoh 6c中未配对c碱基的周围碱基顺序及种类对其与aoh结合亲和力的影响。
[0062]
如图7a所示，将未配对c碱基周围的“a-t”和“t-a”两组碱基对进行了变换，通过引入其他类型的碱基对和改变组成顺序，我们得到了9种具有不同“结构域”的短链。
[0063]
从图7b可以看出，c碱基周围的互补碱基对对于识别aoh有较大影响。当c碱基由“a-t”碱基对包围时，荧光增强最大；当均由“c-g”碱基对包围时，荧光增强最小；当碱基对分别为“a-t”和“c-g”时，荧光值略高于均为“c-g”碱基对时的荧光值。结果表明“a-t”碱基对是识别aoh的关键性结合位点。结合实施例4的实验结果，确定aoh 6c与aoh的关键结合域为两对“a-t”碱基对和一个未配对的c碱基形成“口袋”结构。其中“a-t”和“t-a”对核酸适配体与aoh的结合亲和力没有影响。
[0064]
实施例6.aoh 6c二价核酸适配体的工程化设计。
[0065]
我们通过在aoh 6c中引入上述提及的“a-t”、“t-a”、“c”五个碱基所构成的结构域来构建二价核酸适配体。研究了核酸适配体尾端互补碱基的数目(1-3)、相邻两个结合域之间的互补碱基数目(共用碱基对、0-2)对亲和力的影响。图8a为基于aoh 6c设计的12条二价核酸适配体的二级结构。由图8b可以看出，在保持相邻结合域之间的互补碱基数目不变的情况下，随着核酸适配体尾端互补碱基对的缩短，荧光信号在逐渐递减，这意味着当尾端互补碱基数较少时，整个二价适配体的结构处于不太稳定的状态，此时对于靶分子的识别是非常不利的；同时，当尾端互补碱基数保持不变时，随着相邻结合域之间互补碱基数目的增加，其信号响应也呈现递增的趋势，如前所述，数量较多的互补碱基不仅能维持二价探针的结构稳定性，同时还可以尽可能地避免相邻结合域靠的太近所引起靶标结合时的相互干扰。互补碱基数目最多的aoh 6c-d-1在12条二价适配体中对aoh的亲和力最高。
[0066]
实施例7.单价和二价核酸适配体解离常数kd和选择性的表征。
[0067]
为了证实工程化设计的单价和二价核酸适配体较原长核酸适配体而言性能更为突出的优势，参照原长适配体aoh-59的表征方法，分别对这两种探针进行了亲和力和选择性的测试。如图9a和9b所示，aoh 6c和aoh 6c-d-1的kd分别为701
±
136nm和445
±
138nm。可
其中二价核酸适配体aoh 6c-d-1与aoh-59的亲和力相当，但长度仅为30个碱基，比原长的59个碱基短了近一半。另外，如图9c和9d所示,归功于结合域识别aoh的特异性，单价和二价核酸适配体也显现出了类似的结果，即除了对aoh有识别以外，同时对aoh的同系物ame也表现出较强的亲和力。
[0068]
实施例8.aoh三价核酸适配体的工程化设计和解离常数及特异性的测定
[0069]
按照二价核酸适配体的设计思路和方法，我们基于aoh 6c构建了系列三价核酸适配体。图10a、图10b分别为12条三价核酸适配体的二级结构与相对亲和力的测试结果。与二价核酸适配体的变化规律一致：随着尾端互补碱基的数目、相邻两个结合域之间的互补碱基数目逐渐地增多，三价核酸适配体的信号响应也在逐渐增强，最终三价核酸适配体当中识别作用最明显的是互补碱基数目最多、长度最长的aoh 6c-h-1。
[0070]
参照原长适配体aoh-59的表征方法(图1)，对三价核酸适配体aoh 6c-h-1的解离常数kd和特异性的进行了测试。如图11a所示，kd分别为274
±
233nm,亲和力高于aoh-59。但长度仅为39个碱基，比原长少了20个碱基。同时可以看出随着结合域数量的增加，多价核酸适配体对于aoh的识别能力变得更强。如图11b所示，归功于结合域识别aoh的特异性，三价核酸适配体也显现出了类似的结果，即除了对aoh有识别以外，同时对aoh的同系物ame也表现出较强的亲和力。按照本设计方法还可以设计出具有更高结合位点数和亲和力的多价核酸适配体。
[0071]
实施例9.aoh二价和三价核酸适配体与aoh的结合比的测定
[0072]
为了进一步的探究二价、三价适配体是否会与我们所设想的一致：分别按照靶标与适配体以2：1、3：1的比例进行结合。于是，我们选择了以aoh 6c、aoh 6c-d-1和aoh 6c-h-1分别作为单价、二价和三价适配体的代表，利用job plot法，对这三种探针识别aoh的结合比例进行了测试。通过固定探针与毒素的总浓度保持不变，调节两者所占的浓度比，配合荧光法，得到了三种探针的job plot曲线,如图12a-12c所示。
[0073]
三种体系的荧光值均随探针在体系中所占浓度比的增加呈现出先增加后下降的趋势，并在不同的拐点处取得最大值。经过分析，单价、二价和三价适配体分别在浓度比为0.5、0.38和0.33时表现出最大的信号响应，换算得知，aoh与三种探针的结合比例分别为：1：1，1.63：1和2.03：1。除了aoh 6c是按照我们设想的那样以1：1的比例进行结合以外，aoh 6c-d-1和aoh 6c-h-1均比我们设想的2：1，3：1要小一些，也就是意味着多价核酸适配体与靶标的结合比与其整个结构中单价结合域的组成数量并不是简单的比例关系，但均高于1:1。
[0074]
实施例10.基于单价核酸适配体aoh 06构建倏逝波光纤传感器进行aoh的超灵敏和高特异性检测。
[0075]
通过光纤表面的羟基化、硅烷化、偶联、封闭和还原等步骤将氨基修饰的核酸适配体nh
2-aoh 6c(表1)偶联在光纤表面。具体实验条件参见专利(pct/cn2020/079442)。测试样品前，用浓度为1％的吐温80对光纤进行封闭。在缓冲溶液(0.9mm氯化钙、2.69mm氯化钾、1.47mm磷酸二氢钾、8.1mm磷酸氢二钠，0.49mm氯化镁、137mm氯化钠，ph 7.4)中配置不同终浓度的aoh标准溶液(0,10fm,100fm,1pm,10pm,100pm(皮摩尔每升),1nm,10nm,100nm,)。分别与50nm荧光修饰的互补链(c-aoh 6c-cy 5.5，表1)混合，依次由低浓度到高浓度通入光纤传感器中，每次测试完成后进行界面再生，清洗干净管道，使其荧光信号降到基线。记录
不同浓度下荧光随时间的变化，以不同靶标浓度下相对荧光信号减小百分比值为纵坐标绘制工作曲线。分别配置终浓度为100pm的其它毒素小分子ame、patulin、zen、ota和don标准液用于靶标选择性测试。
[0076]
对于小麦萃取液中加标aoh的测定，样品制备过程如下：取1g小麦粉，加入6ml纯乙腈，将混合液斡旋3min(分钟)之后，离心10min(9000r/min(转/分))。取1ml上清液，未过膜，用缓冲液稀释100倍。用该溶液配制不同浓度的aoh溶液，其终浓度分别为0，10pm,100pm，1nm，10nm，100nm，1μm和10μm。
[0077]
对缓冲溶液中的aoh的检测结果如图13a所示，按照3倍信噪比得出的检出限为42
±
3.4fm,线性动力学区间100fm-100pm。如图13b所示，除了ame外，100fm的aoh比100pm的其它毒素小分子荧光信号下降还要多，表明该传感器对aoh具有极高的靶标选择性(》1000)。对小麦萃取液中标准添加的aoh的检测结果如图13c所示，检出限62
±
7.2pm，即0.096ng/g，线性动力学区间10pm
–
10nm(r2＝0.999)。该检出限远低于小麦中aoh的国家标准限量10ng/g。因此，本发明获得的短链单价核酸适配体aoh 6c可以方便地用于传感器的构建，实现对小麦提取液中aoh的高灵敏和高特异检测。本发明中对光纤进行吐温80封闭时的浓度为1％(w/v),在我们之前申请的pct专利(pct/cn2020/079442)中吐温80封闭时的浓度为0.1％(w/v)。本发明对aoh的检测灵敏度和特异性均大幅提高。检出限由之前的666fm降低到42fm,选择性由之前的》100提高到》1000。
[0078]
实施例11.基于裂分设计的aoh核酸适配体aoh 6c-5-7-l和aoh 6c-5-7-r的倏逝波光纤传感器进行aoh的超灵敏和高特异性检测。
[0079]
探针设计如下(图14a)：在aoh 6c口袋结合域上下两端各增加两对g-c互补碱基对，自中间位置裂分得到两条短链，分别为aoh-6c-5-7-l和aoh-6c-5-7-r。其中aoh-6c-5-7-l与aoh结合亲和力率强于aoh-6c-5-7-r。两者同时存在时与aoh结合的亲和力最强。
[0080]
传感器制备和aoh检测过程与实施例10相同，除了将nh
2-aoh 6c-5-7-l固定在光纤上，用aoh 6c-5-7-r-cy 5.5为检测探针。我们首先按照实施例10的检测模式(同时通入靶标与荧光修饰的aoh 6c-5-7-r的混合物)，结果如图14b所示。低浓度端(1fm-1pm)的荧光信号高于空白样品，而高浓度端(10pm-100nm)依旧保持信号减的检测模式。该结果说明此检测体系同时存在多种竞争性相互作用。因此我们改变了检测模式，使界面上的相互作用单一化：即首先通入靶标孵育，其次通入荧光修饰的链，同时保证二者与核酸适配体的孵育时间相同。结果如图14c所示，荧光信号随着aoh浓度的升高逐渐下降，按照3倍信噪比得出的检出限为7.4fm,线性动力学区间1fm-1pm。其灵敏度比实施例10的灵敏度提高了6倍。如图14d所示，除了ame外(与荧光结果对应)，100fm的aoh比100pm的其它毒素小分子荧光信号下降还要多，该传感器具有极高的靶标选择性(》1000)。如图14e所示，将含有aoh的小麦萃取液稀释100倍后，无需任何样品前处理，直接进行检测，检出限10pm，即0.015ng/g,线性动力学区间10pm
–
10nm(r2＝0.991)。该检出限远低于小麦中aoh的国家标准限量10ng/g(6nm)。
[0081]
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。