瑞香狼毒根际土壤和根内化感物质的提取和含量检测方法

1.本发明涉及植物化感物质分析技术领域，尤其涉及瑞香狼毒根际土壤和根内化感物质的提取和含量检测方法。


背景技术：

2.瑞香狼毒为瑞香科狼毒属多年生草本植物，在中国广泛分布于甘肃、新疆、宁夏等省区。近年来，瑞香狼毒由于强大的生态适应性和高度的竞争性，目前已成为中国草地退化的标志性植物之一。研究表明，瑞香狼毒能通过根系分泌物改变根际微生物群落结构及土壤酶活性，还能产生抑制其他植物生长的化感物质，从而创造利于自身生存繁衍的土壤生态系统。因此，建立一种准确测定瑞香狼毒根际土壤及根中化感物质的方法，对于控制瑞香狼毒草地入侵，治理瑞香狼毒引起的草地退化问题具有重要意义。
3.现今，对于瑞香狼毒的研究多集中在药理活性、化学物质、生态学等方面，关于瑞香狼毒根际土壤及根中化感物质的提取及检测方法，目前相关研究及报道较少。对于瑞香狼毒化感物质的报道，更多的是集中在单个化感物质的提取及活性测定的实验，还未有对不同生长时期、不同盖度下根际土壤中的化感物质含量进行全面的检测，也没有对不同生长时期、不同盖度瑞香狼毒根部化感物质进行含量测定的报道。
4.因此，为了有效控制瑞香狼毒的入侵，亟需建立一种能对瑞香狼毒根际土壤及根中化感物质进行全面检测和合理定量分析的新方法。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题是提供一种效率高、操作简单的瑞香狼毒根际土壤和根内化感物质的提取方法。
6.本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种定量检测、快速灵敏及准确的瑞香狼毒根际土壤和根内化感物质的含量检测方法。
7.为解决上述问题，本发明所述的瑞香狼毒根际土壤和根内化感物质的提取方法，包括以下步骤：
⑴
向瑞香狼毒根际土壤样品中按照每100g土样加入不少于300ml的甲醇溶液，超声提取不少于30min，重复三次；经抽滤除杂后，获得粗提溶液a；所述粗提溶液a使用旋转蒸发仪除去甲醇后，即得化感物质粗提物b；
⑵
称取50g瑞香狼毒植株的根部，通过粉样机粉碎后加入150ml甲醇，超声提取30min，重复三次，得到粗提溶液e；所述粗提溶液e通过使用旋转蒸发仪除去甲醇后，即得化感物质粗提物f；
⑶
分别称取5~10mg所述化感物质粗提物b、所述化感物质粗提物f，分别加入色谱级甲醇溶液，配制成2mg/ml的溶液，并通过0.22μm的有机滤膜除去杂质，分别得到待测溶液c、待测溶液d。
8.所述化感物质粗提物b与所述化感物质粗提物f中包含下述7种化感物质：伞形花
内脂（umbelliferone）、狼毒色原酮（chamaechromone）、西瑞香素（daphnoretin）、异新狼毒素a(isoneochamaejasmin a)、新狼毒素b（neochamaejasmin b）、二氢瑞香素b（dihydrodaphnodorin b）、7
‑
甲氧基新狼毒素a（ 7
‑
methoxyneochamaejasmine a ）。
9.各化感物质结构式如下：如上所述方法获得的瑞香狼毒根际土壤和根内化感物质的含量检测方法，其特征在于：首先采用高效液相色谱（hplc）分别建立伞形花内脂、狼毒色原酮、西瑞香素、异新狼毒素a、新狼毒素b、二氢瑞香素b以及7
‑
甲氧基新狼毒素a共计七种瑞香狼毒化感物质的的标准曲线；然后采用高效液相色谱（hplc）分别对待测溶液c、待测溶液d进行检测，通过外标法确定化感物质保留时间；最后，将化感物质含量通过比对化感物质标准曲线峰面进行换算即得。
10.所述高效液相色谱（hplc）的色谱条件如下：色谱柱：250 mm
×
4.6 mm、5μm粒径的
symmetryμ c18反相柱；流动相流速：1ml/min；流动相：a相为乙腈，b相为含0.2%乙酸的水；进样量：20μl；洗脱梯度：0~6min：20%~30% a；6~8min：30%~35% a；8~15min：35~45% a；15~18min：45~60% a；18~20min：60~80% a；20~25min：80% a。
11.本发明与现有技术相比具有以下优点：1、本发明通过甲醇对瑞香狼毒根际土壤及根内的化感物质进行超声提取并重复三次，可以实现对7种化感物质进行充分提取，不但操作简单，而且提取效率高。
12.2、本发明采用高效液相色谱法对瑞香狼毒七种化感物质中结构相似、分子式一致的狼毒色原酮、西瑞香素以及异新狼毒素a区进行有效分开，使其出现独立的峰，有效解决了化感物质出峰难、峰型不标准的问题。
13.3、本发明可以准确测定根际土壤五种化感物质、根内七种化感物质（根中伞形花内脂、西瑞香素含量较少），不仅检测快速、灵敏度高，而且选择性好，精确度高。
14.4、本发明可被检测、定量出的化感物质种类全、含量准确，为有效控制瑞香狼毒入侵具有重要意义，可广泛应用和推广。
附图说明
15.下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
16.图1为瑞香狼毒化感物质七种化感物质的色谱图。其中：峰1为伞形花内脂；峰2为狼毒色原酮；峰3为西瑞香素；峰4为异新狼毒素a；峰5为新狼毒素b；峰6为二氢瑞香素b；峰7为7
‑
甲氧基新狼毒素a。
17.图2为不同生长时期不同盖度每千克瑞香狼毒根际土壤中色原酮含量图。
18.图3为不同生长时期不同盖度每千克瑞香狼毒根际土壤中异新狼毒素a含量图。
19.图4为不同生长时期不同盖度每千克瑞香狼毒根际土壤中新狼毒素b含量。
20.图5为不同生长时期不同盖度每千克瑞香狼毒根际土壤中二氢瑞香素b含量。
21.图6为不同生长时期不同盖度每千克瑞香狼毒根际土壤中7
‑
甲氧基新狼毒素a含量。
22.图7为不同生长时期不同盖度50 g瑞香狼毒根中伞形花内脂含量图。
23.图8为不同生长时期不同盖度50 g瑞香狼毒根中狼毒色原酮含量图。
24.图9为不同生长时期不同盖度50 g瑞香狼毒根中西瑞香素含量图。
25.图10为不同生长时期不同盖度50 g瑞香狼毒根中异新狼毒素a含量图。
26.图11为不同生长时期不同盖度50 g瑞香狼毒根中新狼毒素b含量图。
27.图12为不同生长时期不同盖度50 g瑞香狼毒根中二氢瑞香素b含量图。其中：le为瑞香狼毒展叶期、fb为盛花期、sm为结实期、dp为休眠期；0%为瑞香狼毒生长盖度为0，25%、52%、89%分别为瑞香狼毒生长盖度达到25%、52%以及89%。
28.图13为不同生长时期不同盖度50 g瑞香狼毒根中7
‑
甲氧基新狼毒素a含量图。其中：le为瑞香狼毒展叶期、fb为盛花期、sm为结实期、dp为休眠期；0%为瑞香狼毒生长盖度为0，25%、52%、89%分别为瑞香狼毒生长盖度达到25%、52%以及89%。
具体实施方式
29.瑞香狼毒根际土壤和根内化感物质的提取方法，包括以下步骤：
⑴
向瑞香狼毒根际土壤样品中按照每100g土样加入不少于300ml的甲醇溶液，超声提取不少于30min，重复三次；经抽滤除杂后，获得粗提溶液a；粗提溶液a使用旋转蒸发仪除去甲醇后，即得化感物质粗提物b；
⑵
称取50g瑞香狼毒植株的根部，通过粉样机粉碎后加入150ml甲醇，超声提取30min，重复三次，得到粗提溶液e；粗提溶液e通过使用旋转蒸发仪除去甲醇后，即得化感物质粗提物f；
⑶
分别称取5~10mg化感物质粗提物b、化感物质粗提物f，分别加入色谱级甲醇溶液，配制成2mg/ml的溶液，并通过0.22μm的有机滤膜除去杂质，分别得到待测溶液c、待测溶液d。
30.其中：化感物质粗提物b与化感物质粗提物f中包含下述7种化感物质：伞形花内脂（umbelliferone）、狼毒色原酮（chamaechromone）、西瑞香素（daphnoretin）、异新狼毒素a(isoneochamaejasmin a)、新狼毒素b（neochamaejasmin b）、二氢瑞香素b（dihydrodaphnodorin b）、7
‑
甲氧基新狼毒素a（ 7
‑
methoxyneochamaejasmine a ）。
31.瑞香狼毒根际土壤和根内化感物质的含量检测方法：首先采用高效液相色谱（hplc）分别建立伞形花内脂、狼毒色原酮、西瑞香素、异新狼毒素a、新狼毒素b、二氢瑞香素b以及7
‑
甲氧基新狼毒素a共计七种瑞香狼毒化感物质的的标准曲线。然后采用高效液相色谱（hplc）分别对将采用上述提取方法获得的待测溶液c、待测溶液d进行检测，通过外标法确定化感物质保留时间；最后，将化感物质含量通过比对化感物质标准曲线峰面进行换算即得。具体过程如下：
①
筛选高效液相色谱条件：取瑞香狼毒七种化感物质标准品分别配制成1mg/ml的母液，再稀释为100μg/ml的溶液，分别取等量混合后进行条件的摸索。
32.首先使用甲醇和水作为液相色谱流动相，但出峰峰型不标准，且设计的流动梯度无法出现独立的峰，峰型波动较大；且在水相中加入0.2%乙酸也无法改变出峰问题。
33.将流动相改为乙腈及水相，设置梯度为0~6min，20~30%b；6~8min，30~35%b；8~15min，35~50%b；15~18min，50~60%b；18~20min，60~80%b；20~25min，80%b；此时，同样无法出现七个单独的峰，西瑞香素以及异新狼毒素a仍重叠在一起，但是峰型较为标准；将洗脱梯度改为0~6min：20%~30% a；6~8min：30%~35% a；8~15min：35~45% a；15~18min：45~60% a；18~20min：60~80% a；20~25min：80% a；西瑞香素以及异新狼毒素a仍有一部分重叠在一起。
34.在水相中加入0.2%乙酸，七种化感物质均能出现独立、标准的峰型。
35.②
确定高效液相色谱（hplc）的色谱条件如下：色谱柱：250 mm
×
4.6 mm、5μm粒径的symmetryμ c18反相柱；流动相流速：1ml/min；流动相：a相为乙腈，b相为含0.2%乙酸的水；进样量：20μl；洗脱梯度：0~6min：20%~30% a；6~8min：30%~35% a；8~15min：35~45% a；15~18min：45~60% a；18~20min：60~80% a；20~25min：80% a。
36.③
建立七种化感物质标准曲线y=ax+b；其中：x为所测样品浓度，单位μg/ml；y为高效液相色谱仪器检测出的峰面积，如表1所示。
37.在所选定的条件下，瑞香狼毒七种化感物质标准曲线r2均达到0.999以上。说明本条件能较好的检测并定量瑞香狼毒化感物质。
38.表1瑞香狼毒化感物质标准曲线
④
采用高效液相色谱（hplc）分别对将采用上述提取方法获得的待测溶液c、待测溶液d进行检测，通过外标法确定化感物质保留时间。
39.即：在标准曲线制作过程中，通过重复测量同一浓度以及不同浓度化感物质出峰时间，确定每一个化感物质出峰时间。当通过高效液相色谱仪测量待测溶液c、待测溶液d后，所得图谱出峰时间与标准品进行对比，从而确定样品中化感物质保留时间。各化感物质出峰及保留时间见图1。
40.⑤
按下式将化感物质含量通过比对化感物质标准曲线峰面进行换算：粗提物中单个化感物质质量m=v
•
a(y
‑
b)/（a
•
a1），a1=v
•
w，式中：v为每次进样的体积，单位μl ；a为粗提物总质量，单位g；a1为每次进样的消耗样品质量，单位mg；w为进样浓度，单位mg/ml。
41.以根提取的伞形花内脂含量为例进行说明：根部总粗提物质量a=17.0916g；每次进样的体积v=20μl，进样浓度w=2mg/ml，那么每次进样的消耗样品质量a1=v
•
w=0.02 ml
×
2mg/ml =0.04mg。
42.伞形花内脂的标准曲线为：y=49295x+28694（即y=ax+b）；y为峰面积，x为所测样品浓度，单位μg/ml；a代表49295，b代表28694。
43.通过一次高效液相色谱仪测得伞形花内脂峰面积y=46876；则所测样品浓度x=（46876
‑
28694）/49295=0.3688 μg/ml，即x=(y
‑
b)/a。
44.那么进样20μl中伞形花内脂质量m1=v
•
x =20μl
×
0.3688μg/ml =0.0074 μg；即0.02ml
×
x。
45.由于测量的总粗提物质量a=17.0916g，那么其中有伞形花内脂质量m=a
•ꢀ
m1/ a1=17.0916 g
÷
0.04 mg
×
0.0074 μg=3.1619 mg。
46.因此，总粗提物中伞形花内脂质量m= a(y
‑
b)/2a。
47.实施例1 对不同生长时期、不同盖度下瑞香狼毒根际土壤化感物质含量的分析比对：分别对瑞香狼毒展叶期、开花期、结实期以及休眠期根际土壤化感物质含量进行测定，检测到的化感物质如图2~6所示。由图中可知，随着生长盖度的增加，瑞香狼毒根际土壤化感物质含量大致呈现增加趋势；展叶期化感物质含量变化趋势最大；在盛花期，化感物质含量最高的为52%盖度。结实期与休眠期化感物质含量较少。因此，对于瑞香狼毒的防治，
应在瑞香狼毒展叶期或盛花期。
48.实施例2对不同生长时期、不同盖度下瑞香狼毒根部化感物质含量的分析比对：通过对不同生长时期不同盖度的瑞香狼毒植株根部样品化感物质含量进行测定。剪取阴干后的狼毒植株根部样品50g，依据上述提取方法进行提取，通过高效液相色谱方法进行含量检测。检测到的化感物质如表2及图7~13所示。由表2及图7~13可知，现今已证实属于瑞香狼毒的七种化感物质在其根中已全部检测出来。七种化感物质含量在展叶期以及盛花期含量较高，结实期以及休眠期含量明显下降。七种化感物质中，色原酮、以及新狼毒素b含量较多，伞形花内脂、西瑞香素以及二氢瑞香素b含量总体较少。根中化感物质的含量影响其分泌到根际土壤中的含量多少。对瑞香狼毒根中化感物质的含量测定，有利于对其入侵草地过程中化感作用效应的研究，从而找到更有效的瑞香狼毒防治方法。
49.表2不同生长时期不同盖度瑞香狼毒根中化感物质含量（mg）