本发明涉及微芯片分析平台领域，尤其涉及一种高通量高灵敏度的单细胞转染蛋白质分析芯片。
背景技术：
：：复杂的信号转导和蛋白质修饰表达是生物体许多功能的基础。生物学家经常将外源dna，rna和蛋白质引入细胞以改变其信号和行为(1)。转染是将外来核酸引入细胞的过程产生转基因细胞，它是研究基因功能和调控以及蛋白质功能的强大分析工具(2)。转染可分为两类：瞬时转染和稳定转染。稳定转染通常是指具有选择标记基因的引入的遗传物质(转基因)被整合到宿主基因组中，即使在宿主细胞复制后，转基因表达也可以得到维持。然而，稳定转染的细胞的构建需要很长时间并且很繁琐(3)。与稳定转染的基因相比，瞬时转染的基因仅在有限的时间内以高水平表达，并且没有整合到基因组中。瞬时转染既简单又快速，是信号通路研究中常用的重要工具(4)。瞬时转染的转染效率受许多因素影响。例如细胞类型，转染环境，基因传递载体，目标基因大小，转染试剂等(5)。根本原因是这些因素影响质粒的完整性和质粒到达细胞核的能力(6)。此外，在生物学研究中，靶基因和报告基因通常形成融合dna质粒，并被转染到细胞中。标记基因通常是表达荧光蛋白的基因，例如egfp，mcherry等，可用于荧光流式细胞术分选或荧光显微镜观察(7)。从理论上讲，该融合基因意味着报告基因与靶基因将共同表达，但实际上，表达报告基因的转染细胞不能100％表达靶基因。这可能是由于细胞中复杂的酶促环境和翻译修饰机制所致(8)。这种情况导致可以成功转染用于研究的细胞比例大大降低。对于转染效率低的细胞，通常使用荧光流分选法进行富集，然后进行后续的蛋白质组或转录组分析。然而，通过荧光流式细胞术筛选表达报告基因的细胞，将掺入仅表达报告基因的假阳性转染细胞。在随后的蛋白质组学分析中，这些假阳性会干扰分析结果。此外，传统的蛋白质组学分析方法(例如免疫印迹分析，免疫共沉淀分析，荧光流式细胞术和质谱流式细胞术)对加载细胞的数量有严格的要求。例如，传统的蛋白质印迹法要求总蛋白质上样浓度达到1μg/μl，然后需要从至少106个细胞中提取蛋白质(9)。作为最新的高通量蛋白质组学分析工具，质谱流式细胞术还需要至少105个细胞的样本量以确保统计意义(10)。对于稀有细胞，例如卵细胞，肿瘤循环细胞和精母细胞，转染困难且效率低下，这些方法不再适用(11)。此外，这些分析方法仍然对大量细胞进行统计分析，从而忽略了细胞之间的异质性。然而，细胞异质性的分析对于理解生物体的特殊生理功能以及疾病的诊断和发生具有重要意义(12)。因此，需要一种技术：无需筛选和富集便可以轻松、清晰地确定转染效果并进行单细胞蛋白质分析。近年来，微流体技术发展迅速，并且出现了一系列基于微芯片的技术，为单细胞组学分析提供了更有效平台(13)。微芯片技术的最新发展为单细胞研究提供了各种新的可行解决方案(14)。通过建立一个约一个单元大小的微型实验室，可以减少样品消耗和反应时间，同时显着提高通量和分析规模(15)。此外，在层流条件下操作可提供良好控制的环境，从而可以在单细胞水平上进行更精确的操作和更灵敏的测量(16)。这些技术还提供了自动化，集成和并行化的平台，可以进一步减少人工和成本要求，从而将基于单细胞的研究推向更高的水平(17)。但是，芯片制备工艺复杂，对单细胞分离检测难以控制。芯片制备所用材料生物相容性不够好，可能会引起细胞功能表征改变，使得测得结果并不能反映真实人体生命活动状态中的真实情况。荧光流式细胞术、质谱流式细胞术、质谱流式成像技术、单细胞分泌蛋白测定技术、单细胞westernblot等高通量、高灵敏度、高分辨率的分析手段，为单细胞蛋白组学的研究提供了强有力的工具。荧光流式细胞术广泛应用于细胞蛋白表达水平的分析。irish等人使用多参数流式细胞术检测了急性骨髓性白血病细胞在多种细胞因子刺激下的信号蛋白磷酸化状态(18)。sachs等人使用流式细胞荧光分选技术检测了人的cd4+t细胞中11种蛋白和脂类的磷酸化水平(19)。但荧光流式细胞分选术无法去除假阳性的细胞，导致后续实验中真实的蛋白表达变化被湮没而得出错误的结论。bendall和nolan等人结合流式细胞术和质谱分析，提出一种新的质谱流式细胞分选术(masscytometry)(20)。应用金属元素标签标记抗体染料，利用质谱原理对单细胞进行多参数定量检测，在单细胞蛋白组学分析方面的应用炙手可热。传统流式细胞技术主要基于对荧光发射光谱的检测，故而存在检测通道数量限制以及光谱重叠串色而需进行复杂补偿的过程。质谱流式细胞技术则是质谱技术与流式细胞技术两种实验平台的融合，既继承了传统流式细胞仪的高速分析的特点，又具有质谱检测的高分辨能力。与传统流式技术相比，质谱流式中的icp质谱装置具有非常宽的原子量检测范围(88～210da)，且分辨率极高，相邻通道间的干扰<0.3％，通道数量增加的同时避免了补偿计算。这样不仅使实验流程得到简化，也节约了标本和试剂。evanw.newell等人利用质谱流式细胞术细致分析了人的cd8t细胞的25个表面marker和功能蛋白表达情况及三种不同病毒表位的结合情况，展示了t细胞成熟的连续过程，揭示出t细胞群体内存在复杂的功能多态性(21)。但仅依赖于抗原抗体的结合识别靶蛋白分子的检测方法易受结合特异性的影响，可能存在较高的假阳性，同时也受到特异性探针的种类限制而使得应用受限。为了获得蛋白质表达的空间信息，giesenc等学者(22)利用激光剥蚀技术将免疫组化和质谱流式有机结合起来，获得了同一视野内32种蛋白的亚细胞定位图像(图像分辨率可以达到1μm)。作者利用这种成像质谱流式技术研究了人乳腺癌切片样本，根据对所获得图像信息的分析，作者实现了对细胞进行亚群分型及肿瘤组织细胞的多态性研究，将有力地推动组织功能和多态性方面研究，为个性化分子靶向性治疗提供技术基础。isoplexis公司的isolight单细胞功能信息多重检测系统(23)是目前在单细胞分析领域中最前沿且不可或缺的解决方案，能够在单细胞的分辨率与灵敏度下，提供完整的免疫细胞功能响应分析，以帮助预测和理解癌症免疫疗法的复杂患者反应，使免疫功能反应与car-t或其他重要免疫治疗临床结果建立起直接性关联，从而推进细胞免疫治疗研究开发、产品表征分析、免疫生物标志物发现、患者疗效预测与后期监测等高需求领域发展。但是在流式细胞术中，胞内及核内蛋白的直接检测操作难度较大，检测应用主要还是针对分泌蛋白，无法检测细胞表面、跨膜蛋白、胞内及核蛋白。蛋白质印迹术(westernblot)是细胞与分子生物学和免疫遗传学中常用的一种蛋白测定方法。具体流程是通过使用凝胶电泳分离样品中的蛋白质，随后将蛋白质转移到膜(典型的，硝酸纤维素或pvdf)，接着用对靶蛋白质具有特异性的抗体探测来检测样品中的蛋白质。由于蛋白是经过电泳分离后再进行抗体结合反应，故较少受到抗体交叉反应性的影响。因此，即使在复杂的样品如细胞裂解物中，也能够清楚地区分靶上和靶外信号。然而，传统的蛋白印迹方法中所测定的结果是基于大量细胞样品的蛋白平均表达水平，其结果掩盖了单个细胞蛋白的表达量的特殊性和多样性(24-26)。hughes和herr开发了单细胞免疫印迹(scwb)，这是一种单细胞蛋白质检测技术，将基于微芯片的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)与凝胶内蛋白质光捕获和免疫检测相结合。scwb利用光诱导的印迹技术原位固定蛋白质，并可以通过检测荧光抗体来检测单个细胞中的11个蛋白质靶标(27)。基于这个技术，herr等人监测了单只大鼠的神经干细胞分化和对有丝分裂原刺激的反应(28)。同时该技术也用于分析来自单个ctc的八种蛋白在乳腺癌患者中的表达，对于了解癌症转移也具有重要意义。毫无疑问，scwb的发展为稀有细胞的蛋白质组学分析提供了强大的推动力。但是，由于凝胶中光敏试剂的限制，光敏固定效率较低，检测下下限为单细胞27000个蛋白分子，难以应用于低丰度蛋白质的检测，仍然存在很大提升空间，且scwb在检测目标蛋白时具有较高的背景荧光，灵敏度低，这对于检测低丰度蛋白并不令人满意。此外，较短的激发波长(uvb，280～320nm)可能引起蛋白抗原位点失活，造成假阴性影响。而且同样难以应用于稀有细胞类群的单细胞蛋白质分析。因此，本领域的技术人员致力于开发一种高通量、高灵敏度的蛋白质检测芯片，以解决转染后单细胞、尤其是稀有细胞类群的蛋白质分析问题。技术实现要素：有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是开发一种基于原位微芯片免疫印迹法的单细胞转染分析芯片，从而可以快速、准确、高效地分析转染细胞中外源基因的表达，尤其针对低共表达情况下蛋白质表达水平的检测及报告基因和靶基因表达水平关系的分析，以及其他稀有细胞的基因表达检测分析。为实现上述目的，本发明提供了一种高通量高灵敏度的单细胞转染蛋白质分析芯片，所述芯片由载体与光敏感型蛋白质固定凝胶涂层组成，其中所述涂层由疏水隔带分隔为一个以上的检测区域；所述检测区域中设置细胞阱。进一步地，所述光敏感型蛋白质固定凝胶选用四氮唑为光敏基团的聚丙烯酰胺凝胶。进一步地，所述聚丙烯酰胺凝胶选用结构式中拉电子基团为1,2-二甲基-1h-吡咯，2-甲基-1h-吡咯，2-甲基噻吩，2-甲基呋喃，或甲苯的分子。进一步地，所述疏水隔带的构建采用疏水性隔离笔划分，或采用疏水涂层分隔。进一步地，所述细胞阱的直径尺寸根据待检测的细胞的尺寸设置。本发明还提供一种利用上述的高通量高灵敏度的单细胞转染蛋白质分析芯片检测细胞表达蛋白质的方法，所述方法包括以下步骤：步骤1、加载细胞，使细胞沉降到所述细胞阱中；步骤2、冲洗过量细胞后，用共聚焦荧光显微镜定位记录表达靶基因和报告基因的转染细胞的坐标；步骤3、根据靶蛋白的大小进行电泳；步骤4、之后立即进行紫外线(uv)照射交联固定蛋白质；步骤5、加入抗体探针并孵育后进行信号检测，对所述靶蛋白的表达进行分析。进一步地，所述步骤5中的所述抗体探针选用荧光、酶、胶体金或超顺磁性微球标记。进一步地，所述步骤5中的所述信号检测的对象为抗体探针或包括适配体、纳米抗体、凝集素在内的试剂。进一步地，所述步骤4中照射的波长范围为300～340nm，时间范围为30s～10min。进一步地，所述方法的应用对象包括单细胞或多细胞的蛋白质表达、提取出的蛋白质溶液或纯化的蛋白质溶液及dna-蛋白质、rna-蛋白质；其中所述蛋白质溶液可以包括一种及以上的蛋白质分析物质。与现有技术相比，本发明至少具备以下有益的技术效果：(1)可以进行报告基因和靶基因之间的表达相关性的研究，尤其是低共表达的情况下，为评估转染策略的可靠性提供了有力的平台；(2)检测范围的区域化设计可以进行多靶点的同时分析，实现对融合蛋白和下游蛋白表达的同时研究；(3)可以进行真正的单细胞上采样，不仅可以检测转染细胞的低丰度蛋白，还可以研究稀有细胞类群的相关基因表达；(4)便携性高、成本低廉、结果直观、储存稳定性好；(5)功能稳定性好，储存期达3个月，信号无明显变化。以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。附图说明图1是本发明的一个较佳实施例的芯片基本外观及原理示意图；图2是本发明的一个较佳实施例的对转染细胞的装载定位及报告基因检查结果图；图3是本发明的一个较佳实施例的光敏感型蛋白质固定凝胶的紫外激发交联蛋白质的作用原理示意图；图4是本发明的一个较佳实施例的光敏感型蛋白质固定凝胶的合成路线图；图5是本发明的一个较佳实施例的合成光敏感型蛋白质固定凝胶的流程中步骤一产物2-(1-甲基-1h-吡咯-2-基)-2h-四唑-5-羧酸乙酯的核磁共振氢谱；图6是本发明的一个较佳实施例的合成光敏感型蛋白质固定凝胶n-(3-甲基丙烯酰胺基丙基)-2-(1-甲基-1h-吡咯-2-基)-2h-四唑-5-甲酰胺的质谱鉴定图谱；图7是本发明的一个较佳实施例的合成光敏感型蛋白质固定凝胶n-(3-甲基丙烯酰胺基丙基)-2-(1-甲基-1h-吡咯-2-基)-2h-四唑-5-甲酰胺的核磁共振氢谱；图8是本发明的一个较佳实施例的不同浓度光敏感型蛋白质固定凝胶固定蛋白质的照片；图9是本发明的一个较佳实施例的不同浓度光敏感型蛋白质固定凝胶经紫外激发捕获蛋白质的效率曲线图；图10是本发明的一个较佳实施例的不同紫外光照时间对光敏感型蛋白质固定凝胶捕获蛋白质的效率的影响曲线图；图11是本发明的一个较佳实施例的光敏感型蛋白质固定凝胶的紫外吸收谱图。具体实施方式以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。本发明基于四氮唑为光敏基团的丙烯酰胺凝胶建立了区域化小型的可定位芯片，具体步骤如下：步骤1、芯片模板生产：该掩膜板由cad软件设计，由深圳纳米芯片电子公司生产，然后将涂有适量su8-2050凝胶的硅晶片在热板上于65℃烘烤1分钟，再在95℃的温度下烘烤8分钟；其次先将将玻璃板放在曝光机上，将曝光时间设置为4分钟，然后进行uv曝光；曝光完成后，将其在65℃下烘烤2分钟，然后在95℃下烘烤7分钟；接下来，将su8-2050的第二层涂覆到晶片上进行二次均质，然后加热；将设计好的胶片掩膜贴在玻璃板上，然后放入曝光机中进行紫外线曝光。然后，将其在65℃下烘烤2分钟，然后在95℃下烘烤7分钟；完成后，用镊子固定模板并用显影液冲洗，2-3分钟后，用异丙醇、丙酮、乙醇和去离子水清洁模板，然后在65℃下干燥；步骤2、根据图4所示的合成路线示意图合成光敏感型蛋白质固定凝胶mmp凝胶：首先用n-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺合成了2-(1-甲基-1h-吡咯-2-基)-2h-四唑-5-羧酸，以生成功能性的光捕获产品n-(3-甲基丙烯酰胺丙基)-2-(1-甲基-1h-吡咯-2-基)-2h-四唑-5-甲酰胺(map-mpytc)，通过edcl/hobt催化的酰胺缩合反应。将合成的map-mpytc与丙烯酰胺和n，n'-亚甲基双丙烯酰胺共聚，形成mpytc改性的聚丙烯酰胺(mmp)凝胶，在制备mpytc改性的聚丙烯酰胺(mmp)凝胶时，从裂解组分中除去tritonx-100，以确保在随后的共聚焦荧光显微镜观察过程中细胞状态是完整的；步骤3、单细胞蛋白质印迹芯片的制备：将标准载玻片用硅烷化试剂(175528，j&k)处理30分钟，然后用甲醇，去离子水洗涤两次，并用氮气干燥；由30％的储备溶液制备12％的凝胶溶液，并添加tris-hcl，sds，tritonx-100，ddh2o；加入aps和temed以引发聚合；制备的溶液铺展在二氧化硅芯片模板上，然后用硅烷化的载玻片覆盖；20分钟后提起载玻片，并保存在4℃的湿箱中；形成凝胶后，将芯片从模具中轻轻提起。芯片覆盖有一层模板，由于模板的设计，隔离区域没有凝胶。疏水性隔离笔沿屏障创建疏水区域。为了准确定位转染的细胞，我们为每个细胞分配了陷阱坐标。将不同的转染细胞同时加载到芯片上，除了直径为30μm的圆柱体外，还在模具上设计了2mm宽的隔离区。在这项研究中，该芯片根据实验要求分为三个隔离域。如图1所示，加载细胞后，细胞需要5-10分钟才能沉降到细胞阱中。用磷酸盐缓冲液冲洗过量的细胞后，将表达re-porter基因的转染细胞置于共聚焦荧光显微镜下，并记录坐标。整个过程耗时5分钟，以确保细胞中的蛋白质状态正常。定位后，根据scwb电泳程序进行电泳。靶蛋白的大小决定了电泳时间。电泳后，立即通过uv交联固定蛋白质。在紫外线的照射下，蛋白质与mmp凝胶将发生交联反应，过程如图3所示。并在之后可以通过检测抗体探针的荧光强度对靶向蛋白进行特异性定量或半定量检测(如图2所示)。由于mmp凝胶的高效和快速特性，暴露60秒可以满足低丰度蛋白质的固定要求。在抗体检测阶段，由于存在疏水性分离带，因此可以在每个区域中同时孵育多个抗体。我们去除了表面上多余的细胞，并在共聚焦荧光显微镜下观察到掉入细胞陷阱的细胞。我们的数据表明，在某些陷阱中，可能有2-3个细胞，并记录了它们的坐标，以便可以在随后的抗体检测分析中将其丢弃。然后，进行电泳。紫外线照射60秒后，用mmp凝胶固定蛋白质。与荧光抗体孵育后检测荧光信号。实施例1、合成光敏感型蛋白质固定凝胶n-(3-甲基丙烯酰胺基丙基)-2-(1-甲基-1h-吡咯-2-基)-2h-四唑-5-甲酰胺步骤一、合成2-(1-甲基-1h-吡咯-2-基)-2h-四唑-5-羧酸乙酯，包括以下步骤：1.1.溶解甲基-1氢-吡咯(5g，12.5mmol)于30ml三氟乙醇；1.2.在-40℃，往1.1中溶液加入二乙酸碘苯(20g，62.5mmol)；1.3.氮气保护，于-40℃，搅拌2h；1.4.将产物浓缩至黑色油状，溶解于二氯甲烷；1.5.往1.4中溶液加入5-甲酸乙酯四氮唑(3g，21.6mmol)，三氟甲烷磺酸铜(ii)(3.1g，8.6mmol)，和三乙胺(16ml，108mmol)；1.6.氮气保护下，室温搅拌24h；1.7.反应结束后，用饱和氯化铵、卤水洗涤产物，无水硫酸镁干燥，过滤干燥；1.8.用硅胶快速层析(洗脱剂为pe：ea＝5：1)进一步纯化产物，得到棕色油状产物i。所述产物i的产量为450mg，产率为9.6％，其核磁共振氢谱表征如图5所示。步骤二、合成2-(1-甲基-1h-吡咯-2-基)-2h-四唑-5-羧酸，包括以下步骤：2.1.溶解步骤一中的产物i(450mg，2mmol)于1：1meoh/h2o(20ml)中；2.2.于0℃，往2.1的溶液加入氢氧化锂(850mg，10mmol)；2.3.将2.2得到的混合物置于室温，在氮气保护下，搅拌反应2h；2.4.反应结束后，于0℃加入2nhcl，调节ph为4-5；2.5.用乙酸乙酯溶液萃取，并用卤水洗涤混合有机相，无水硫酸钠干燥，过滤浓缩为棕色固体产物ii。所述产物ii的产量为370mg，产率为94％。步骤三、合成光敏感型蛋白质固定凝胶n-(3-甲基丙烯酰胺基丙基)-2-(1-甲基-1h-吡咯-2-基)-2h-四唑-5-甲酰胺，包括以下步骤：3.1.将n-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐(370mg，1.67mmol)溶解于20ml四氢呋喃中；3.2.于0℃，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edcl.hcl，650mg，3.34mmol),1-羟基苯并三唑(hobt，220mg，1.67mmol)，反应30min；3.3.将步骤二中的所述产物ii(300mg，1.67mmol)、三乙胺(850mg，8.35mmol)加入3.2中的混合溶液，搅拌回流反应过夜；3.4.反应结束后，用制备型hplc纯化产物，得到白色粉末iii，其产量为41mg,产率为6.7％。产物iii的质谱鉴定结果如图6所示，其核磁共振氢谱表征如图7所示。实施例2、不同浓度光敏感型蛋白质固定凝胶对牛血清白蛋白bsa的固定效率1.将实施例1中的产物iii，溶解于二甲亚砜dmso中，配置成浓度为100mm的储存溶液s1；2.在1.5mlep管内，25μl1.5mph8.8tris-hcl，166.7μl30％丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺(29：1)，265.3μlddho，及分别加入15μl(3％)，7.5μl(1.5％)，3.75μl(0.75％)，0μl(0％)的s1，配置成胶precursor；3.并加入10μl5％sds，10μl5％tritonx-100，4μlaps，4μltemed，轻轻摇匀，配制成不同浓度的s1溶液。滴加该溶液于多孔微阵列模具上，并将玻片轻缓盖上，避免气泡产生，静置20min，待胶凝固，剥离模具，制成多孔微阵列凝胶；4.按照0.5％sds，0.1％v/vtritonx-100，0.25％脱氧胆酸钠，12.5mmtris，96mmglycine，ph8.3配置ripa-like裂解液(radioimmune-precipitationassaylysisbuffer，也是电泳缓冲液)，保存于4℃；5.取裂解液/电泳液水浴加热至50-55℃，提前开启紫外，使光源稳定；6.将芯片置于新的皿中，胶面朝上，滴加200μlbsa溶液(5.12mg/ml)，轻摇玻片，使bsa溶液分布均匀，静置3min；7.将胶置于电泳槽内，从电泳槽一角轻柔尽快倒入水浴55℃预热的10mlripa-like裂解液；8.立即开启电压电源，200v电压(e＝40v/cm2)，蛋白电泳分离30s；9.立即终止电压，紫外曝光10min；10.曝光结束，取出胶，置于考马斯亮蓝染液(0.1g考马斯亮蓝粉末溶于20ml甲醇+16ml水+4ml乙酸)中染色5min；11.拍摄照片，记录蛋白固定情况；12.tbst摇洗，每15min换液一次，持续2h，后摇洗过夜；13.拍摄照片，记录蛋白固定情况。蛋白质固定情况照片如图8所示。统计不同浓度光敏感型蛋白质固定凝胶经紫外照射后对蛋白质的捕获效率绘制变化曲线(如图9所示)，说明低浓度水平的s1光敏感型蛋白质固定凝胶在经紫外激发后就对胶内蛋白质具有较强较高固定效率。实施例3、不同紫外光照时间对光敏感型蛋白质固定凝胶对牛血清白蛋白bsa的固定效率1.将实施例1中的产物iii，溶解于二甲亚砜dmso中，配置成浓度为100mm的储存溶液s1；2.在1.5mlep管内，25μl1.5mph8.8tris-hcl，166.7μl30％丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺(29：1)，265.3μlddho，3.75μl(0.75％)的s1，配置成胶precursor；3.并加入10μl5％sds，10μl5％tritonx-100，4μlaps，4μltemed，轻轻摇匀，滴加该溶液于多孔微阵列模具上，并将玻片轻缓盖上，避免气泡产生，静置20min，待胶凝固，剥离模具，制成多孔微阵列凝胶；4.按照0.5％sds，0.1％v/vtritonx-100，0.25％脱氧胆酸钠，12.5mmtris，96mmglycine，ph8.3配置ripa-like裂解液(radioimmune-precipitationassaylysisbuffer，也是电泳缓冲液)，保存于4℃；5.取裂解液/电泳液水浴加热至50-55℃，提前开启紫外，使光源稳定；6.将芯片置于新的皿中，胶面朝上，滴加200μlbsa溶液(5.12mg/ml)，轻摇玻片，使bsa溶液分布均匀，静置3min；7.将胶置于电泳槽内，从电泳槽一角轻柔尽快倒入水浴55℃预热的10mlripa-like裂解液；8.立即开启电压电源，200v电压(e＝40v/cm2)，蛋白电泳分离30s；9.立即终止电压，紫外曝光，曝光时间分别设置为10min，6min，4min，2min，1min，30s，15s；10.曝光结束，取出胶，置于考马斯亮蓝染液(0.1g考马斯亮蓝粉末溶于20ml甲醇+16ml水+4ml乙酸)中染色5min；11.拍摄照片，记录蛋白固定情况；12.tbst摇洗，每15min换液一次，持续2h，之后摇洗过夜；13.拍摄照片，记录蛋白固定情况。同样的操作进行了对鸡卵清蛋白、胰蛋白酶抑制剂、溶菌酶的实验。将本实施例采用的光敏感型蛋白质固定凝胶对几种蛋白质的捕获效率随紫外曝光时间的变化情况统计绘制曲线(如图10所示)，说明光敏感型蛋白质固定凝胶在经较短时间(30s以内)的紫外激发后就对胶内蛋白质具有较强较高固定效率。实施例4、光吸收特性检测以安捷伦科技(中国)有限公司生产的紫外-可见分光光度计测量实施的化实例1中所合成化合物的紫外-可见吸收光谱。仪器型号为evolution220uv-vis，光谱扫描范围从300nm到800nm。获得如图11所示的紫外-可见吸收光谱，从而获得了本发明所述代表光敏感型蛋白质固定凝胶的光吸收特性。以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本
技术领域：
：中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。参考文献：1.warren,l.etal.highlyefficientreprogrammingtopluripotencyanddirecteddifferentiationofhumancellswithsyntheticmodifiedmrna.cellstemcell7,618-630(2010).2.ballabio,c.etal.modelingmedulloblastomainvivoandwithhumancerebellarorganoids.naturecommunications11,583,(2020).3.donahue,p.s.etal.thecomettoolkitforcomposingcustomizablegeneticprogramsinmammaliancells.naturecommunications11,779,(2020).4.chen,r.,xie,r.,meng,z.,ma,s.&guan,k.-l.stripakintegratesupstreamsignalstoinitiatethehippokinasecascade.naturecellbiology21,1565-1577,(2019).5.glover,d.j.,lipps,h.j.&jans,d.a.towardssafe,non-viraltherapeuticgeneexpressioninhumans.naturereviewsgenetics6,299-310,(2005).6.zohar,m.,mesika,a.&reich,z.analysisofgeneticcontrolelementsineukaryotes:transcriptionalactivityornuclearhitchhiking？bioessays23,1176-1179(2001).7.quenneville,s.p.etal.nucleofectionofmuscle-derivedstemcellsandmyoblastswithphic31integrase:stableexpressionofafull-length-dystrophinfusiongenebyhumanmyoblasts.molther10,679-687,2004.05.034(2004).8.recillas-targa,f.multiplestrategiesforgenetransfer,expression,knockdown,andchromatininfluenceinmammaliancelllinesandtransgenicanimals.molecularbiotechnology34,337-354,(2006).9.gou,l.-t.etal.ubiquitination-deficientmutationsinhumanpiwicausemaleinfertilitybyimpairinghistone-to-protamineexchangeduringspermiogenesis.cell169,1090-1104.e1013(2017).10.spitzer,m.h.&nolan,g.p.masscytometry:singlecells,manyfeatures.cell165,780-791(2016).11.sinkala,e.etal.profilingproteinexpressionincirculatingtumourcellsusingmicrofluidicwesternblotting.naturecommunications8,1-12(2017).12.liang,s.-b.&fu,l.-w.applicationofsingle-celltechnologyincancerresearch.biotechnologyadvances35,443-449(2017).13.deng,y.,finck,a.&fan,r.single-cellomicsanalysesenabledbymicrochiptechnologies.annualreviewofbiomedicalengineering21,365-393(2019).14.el-ali,j.,sorger,p.k.&jensen,k.f.cellsonchips.nature442,403-411(2006).15.takayama,s.etal.subcellularpositioningofsmallmolecules.nature411,1016-1016(2001).16.takayama,s.etal.selectivechemicaltreatmentofcellularmicrodomainsusingmultiplelaminarstreams.chemistry&biology10,123-130(2003).17.yin,h.&marshall,d.microfluidicsforsinglecellanalysis.currentopinioninbiotechnology23,110-119(2012).18.irish,j.m.；hovland,r.；krutzik,p.o.；perez,o.d.；bruserud,o.；gjertsen,b.t.；nolan,g.p.singlecellprofilingofpotentiatedphospho-proteinnetworksincancercells.cell,2004,118,217-228.19.sachs,k.；perez,o.；pe'er,d.；lauffenburger,d.a.；nolan,g.p.causalprotein-signalingnetworksderivedfrommultiparametersingle-celldata.science,2005,308,523-529.20.bendall,s.c.；simonds,e.f.；qiu,p.；amir,e.d.；krutzik,p.o.；finck,r.；bruggner,r.v.；melamed,r.；trejo,a.；ornatsky,o.i.；balderas,r.s.；plevritis,s.k.；sachs,k.；pe’er,d.；tanner,s.d.；nolan,g.p.single-cellmasscytometryofdifferentialimmuneanddrugresponsesacrossahumanhematopoieticcontinuum.science,2011,332,687-696.21.newell,e.w.,sigal,n.,bendall,s.c.,nolan,g.p.,anddavis,m.m.cytometrybytime-of-flightshowscombinatorialcytokineexpressionandvirus-specificcellnicheswithinacontinuumofcd8+tcellphenotypes.immunity,2012,36,142-152.22.giesen,c.,wang,h.a.,schapiro,d.,zivanovic,n.,jacobs,a.,hattendorf,b.,schuffler,p.j.,grolimund,d.,buhmann,j.m.,brandt,s.,etal.highlymultiplexedimagingoftumortissueswithsubcellularresolutionbymasscytometry.naturemethods,2014,11,417-422.23.lu,y.,xue,q.,eisele,m.r.,sulistijo,e.s.,brower,k.,han,l.,amirel,a.d.,pe'er,d.,miller-jensen,k.,andfan,r.highlymultiplexedprofilingofsingle-celleffectorfunctionsrevealsdeepfunctionalheterogeneityinresponsetopathogenicligands.procnatlacadsciusa,2015,112,e607-615.24.hughes,a.j.；spelke,d.p.；xu,z.；kang,c.c.；schaffer,d.v.；herr,a.e.single-cellwesternblotting:supplimentary.naturemethods,2014,11,749-760.25.kang,c.c.,yamauchi,k.a.,vlassakis,j.,sinkala,e.,duncombe,t.a.,andherr,a.e.singlecell-resolutionwesternblotting.natprotoc,2016,11,1508-1530.26.sinkala,e.,sollier-christen,e.,renier,c.,rosas-canyelles,e.,che,j.,heirich,k.,duncombe,t.a.,vlassakis,j.,yamauchi,k.a.,huang,h.,etal.profilingproteinexpressionincirculatingtumourcellsusingmicrofluidicwesternblotting.naturecommunications,2017,8,14622.27.cc,k.etal.singlecell-resolutionwesternblotting.natureprotocols,11,1508–1530,(2016).28.hughes,a.j.etal.single-cellwesternblotting.naturemethods,11,749–755,(2014).当前第1页12当前第1页12