一种测定极低密度脂蛋白亚组份成分分布的方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体地，涉及一种测定极低密度脂蛋白亚组份及其成分分布的方法。

背景技术：

肝脏是脂肪代谢重要器官，极低密度脂蛋白(vldl)是肝脏最为重要的脂代谢载体：极低密度脂蛋白，是由肝脏利用乳糜颗粒、残粒、胆汁酸、脂肪酸、糖和蛋白质的中间代谢物与肝脏内合成的载脂蛋白组成的一种脂蛋白。vldl的主要功能是运输肝脏中合成的内源性甘油三酯。无论是血液运输到肝细胞的脂肪酸，或是糖代谢转变而形成的脂肪酸，在肝细胞中均可合成甘油三酯，最终由vldl运送至肝外器官执行机体全身的脂类代谢，因而vldl是肝脏参与脂代谢的最为重要的载体。

vldl大小为30-80nm，含有甘油三酯、胆固醇、游离胆固醇、磷脂和蛋白成分(apob100为主)，在总vldl中甘油三酯(tg)约占60％，胆固醇(tc)约占20％，载脂蛋白约占10％，其他成份约10％，成分占比相对固定。

使用超速离心或核磁共振等方法可根据密度对总vldl进行亚组份划分，将vldl分为2-5个组分，并可通过测量得到每个亚组份中的成分含量(甘油三酯、胆固醇、游离胆固醇、磷脂)，但测定结果无公认正常范围，个体波动大，无法得到有效应用。

技术实现要素：

发明目的：本发明的目的在于提供一种测定极低密度脂蛋白亚组份成分分布的方法，该方法针对血液样本中vldl亚组份成分进行检测后，对亚组份及其各成分的占比进行计算，通过自身总vldl检测值指标对个体化差异进行归一，可在多次检测中对个体的变化进行监控，变化趋势与基线进行对比，可反映个体的代谢及疾病状况。

技术方案：本发明提供一种测定极低密度脂蛋白亚组份成分分布的方法，包括以下步骤：

(1)根据vldl密度，将总vldl划分为2-5个亚组分，并测定每个亚组分中甘油三酯、胆固醇、游离胆固醇、磷脂的含量；

(2)计算每个亚组分中甘油三酯与各个亚组分中总甘油三酯的比值，胆固醇、游离胆固醇、磷脂按照同样方法计算比值，得到vldl的成分在每个亚组份中的分布情况；

(3)根据个体时间/干预进程，进行多次测量，比较中各成分分布的变化情况。

作为优选：

步骤(1)中使用超速离心法对总vldl进行亚组份划分(4个亚组分)，然后采用比色法和比浊法测定每个亚组分中甘油三酯、胆固醇、游离胆固醇、磷脂的含量。

或者，使用核磁共振法进行检测，利用脂蛋白链-ch3及-ch2-信号群的积分对脂蛋白各亚类进行定量(划分为5个亚组分)，并从检测指标中提取vldl亚组分及各成分的定量信息。

所述方法能够根据甘油三酯、胆固醇、游离胆固醇、磷脂在亚组分中的分布变化规律，反映出个体脂代谢的变化状态。

步骤(3)中所述干预包括手术或者药物。

本发明使用空腹血液样本，离心去除血细胞，得到血清/血浆，将血清/血浆与缓冲液等量配比/超速离心分离后，转入检测管中等待检测，样本前处理步骤简单、试剂稳定性高，兼容性好，能够为后续检测提供稳定的检测信号样本环境。

本发明使用核磁共振波谱仪/比色法和比浊法对样本进行检测，从检测值中提取以下指标，进行后续计算：极低密度脂蛋白第一组份-胆固醇(vldl-1-tc)、极低密度脂蛋白第一组份-甘油三酯(vldl-1-tg)、极低密度脂蛋白第一组份-游离胆固醇(vldl-1-fc)、极低密度脂蛋白第一组份-磷脂(vldl-1-pl)、极低密度脂蛋白第二组份-胆固醇(vldl-2-tc)、极低密度脂蛋白第二组份-甘油三酯(vldl-2-tg)、极低密度脂蛋白第二组份-游离胆固醇(vldl-2-fc)、极低密度脂蛋白第二组份-磷脂(vldl-2-pl)、极低密度脂蛋白第三组份-胆固醇(vldl-3-tc)、极低密度脂蛋白第三组份-甘油三酯(vldl-3-tg)、极低密度脂蛋白第三组份-游离胆固醇(vldl-3-fc)、极低密度脂蛋白第三组份-磷脂(vldl-3-pl)、极低密度脂蛋白第四组份-胆固醇(vldl-4-tc)、极低密度脂蛋白第四组份-甘油三酯(vldl-4-tg)、极低密度脂蛋白第四组份-游离胆固醇(vldl-4-fc)、极低密度脂蛋白第四组份-磷脂(vldl-4-pl)、极低密度脂蛋白第五组份-胆固醇(vldl-5-tc)、极低密度脂蛋白第五组份-甘油三酯(vldl-5-tg)、极低密度脂蛋白第五组份-游离胆固醇(vldl-5-fc)、极低密度脂蛋白第五组份-磷脂(vldl-5-pl)、极低密度脂蛋白总胆固醇(vldl-tc)、极低密度脂蛋白总甘油三酯(vldl-tg)、极低密度脂蛋白总游离胆固醇(vldl-fc)、极低密度脂蛋白总磷脂(vldl-pl)。

如图1所示，总的极低密度脂蛋白(vldl)中的成分含量，包括甘油三酯、胆固醇、游离胆固醇、磷脂在健康人及肝癌患者中无明显变化，不能反映脂代谢状态，无法提供疾病/代谢状态判断、监控的有效价值。因此，本发明使用vldl各亚组份的各成分与总vldl中的该成分进行比值计算，得到极低密度脂蛋白亚组份成分占比(即v1-v5组份中四种组成成分分别与其对应的vldl组成成分的比值，例如：ratiov1/vldl总量、ratiov5/vldl总量等)，得到vldl中的成分分布，并通过多次测量，判断个体时间/干预进程中各成分分布的转化比例，为个体的脂代谢及疾病状态的观察、判断提供依据。

有益效果：与现有技术相比，本发明从脂蛋白检测指标中，提取极低密度脂蛋白亚组份结果，对亚组份中的成分及成分分布/占比进行计算。在个体疾病或脂代谢异常时，总极低密度脂蛋白检测结果稳定的情况下，本发明方法能够根据甘油三酯、胆固醇、游离胆固醇、磷脂在亚组分中的分布变化规律，反映出个体脂代谢的变化状态。

附图说明

图1为总vldl中四种成分在健康人和肝癌患者中的含量。

图2为vldl各亚组份的密度与粒径范围。

图3为极低密度脂蛋白亚组份成分分布在健康人、肝癌患者术前及术后样本中的变化情况。

具体实施方式

以下对本发明的配方和方式全面的描述，所数的实施案例是本发明中最优选实施方式，但本发明并不限于以下实施例。

实施例1核磁共振法

1)样本：本方法检测针对空腹采集的血液，采集后的血液经过离心，弃去沉淀的血细胞，取上层血浆/血清样本，检测可接受新鲜血液或分离或冻存的血清/血浆，血液样本不可发生溶血。为了保持检测结果的一致性，同一个体的多次检测结果应采取同样的采血管。

2)样本缓冲液配制：磷酸二氢钠缓冲液0.075mol/l，氘化水20％，0.03％tsp，使用纯净水配制，充分溶解及混匀，进行分装及冷藏，每次使用之前应预热至室温。

3)样本前处理：新鲜或完全融化的血清/血浆，置于室温中回复温度并摇匀，取340ul样本加入到含有340ul缓冲液的ep管中，轻缓并充分的混合摇匀后，转移600ul到核磁管中等待检测。

4)样本检测：样本数据采集前，使用质控标准品经核磁自检合格，以确保仪器状态良好、环境温度稳定、定量性能达标。为了保证检测质量，被检样本在检测前保存在280k的温度下，检测过程中使用温控流程对样本进行加热，确保样本达到检测温度(310k)后，对样本的1^hnmrnosey谱图进行采集。使用缓冲液中加入的tsp(trimethylsilylpropanoicacid)信号峰及1.48ppm处的丙氨酸双峰信号对化学位移进行校正；使用0.8ppm及1.25ppm处的脂蛋白链-ch3及-ch2-信号群的积分对脂蛋白各亚类进行定量，并从检测指标中提取vldl亚组分及各成分的定量信息。

如图2所示，显示为vldl五个亚组份的密度与粒径分布，以及密度与粒径的关系，本发明中的成分分布即在每个亚组份中胆固醇、甘油三酯、游离胆固醇、磷脂与对应其在总vldl中的占比。

5)指标提取及计算：从检测指标中提取用于计算的24个指标，并对极低密度脂蛋白亚组份的成分占比进行计算。

注：tc，胆固醇；tg，甘油三酯；fc，游离胆固醇；pl，磷脂；％，组份指标与总指标的比值。

在不同人群中测定数据的统计结果如下：

在不同人群中成分占比计算数据的统计结果如下：

以vldl第一组份及第五组份为例(vldl-1、vldl-5)，如图3所示，列举了本发明中的指标—vldl的成分在亚组份中的分布情况，通过在各组分中占比情况及不同状态下占比的转化情况能够看出，vldl-1、vldl-5的相关指标在肝癌患者术前样本中与健康个体有非常明显的差异，但成分分布情况在肝癌术后样本中(与术前样本配对)逐渐向健康人的分布特征转化。

实施例2超速离心法

1)样本：本方法检测针对空腹采集的血液，采集后的血液经过离心，弃去沉淀的血细胞，取上层血浆/血清样本，检测可接受新鲜血液或分离或冻存的血清/血浆，血液样本不可发生溶血。为了保持检测结果的一致性，同一个体的多次检测结果应采取同样的采血管。

2)样本缓冲液：edta溶液(0.5mol/l):186gedta-na2加入去离水950ml，用naoh调准ph值，再加水到1l。密度溶液：nacl11.40g，0.5ml0.5mol/ledta液，加去离子水至1l。

3)样本前处理：取3ml血浆，加入1.5ml密度溶液，使用超速离心在40500rev/min，18℃的条件下离心16小时，分离出总vldl，总vldl在40,000rev/min的超速离心条件下，依次离心28min，78min，80min，18hr分离出各亚组分。

4)样本检测：采用比色法和比浊法，使用546nm波长对亚组分的各成分进行检测，并通过吸光值的比对，对各亚组分中的各成分进行定量。

5)指标提取及计算：从检测指标中提取用于计算的20个指标，并对极低密度脂蛋白亚组份的成分占比进行计算。

针对健康人、肝癌术前和肝癌术后进行多次测量，数据统计，比较vldl亚组分中各成分分布的变化情况，结果与实施例1类似。