一种枇杷果实木质化程度的细胞快速统计评价方法

1.本发明属于农产品检测方法，涉及一种枇杷采后果实品质评价的研究方法，特别涉及一种枇杷果实木质化程度的细胞快速统计评价方法。


背景技术：

2.枇杷原产于我国，是蔷薇科、枇杷属植物。枇杷果肉柔软多汁，风味鲜美，肉营养价值丰富，风味浓郁，因此广受消费者喜爱。枇杷成熟于高温多雨季节，果实的田间热过大，采后呼吸作用明显，对果实消耗明显，极易产生腐败，加速果实衰老木质化进程。低温处理广泛被应用到果实的储运过程中，以减小果实采后消耗，保持果实品质。但是，枇杷果实属于冷敏性水果,在低温环境下容易出现冷害症状,其主要表现为果实硬度上升，口感粗糙，果皮难剥，果汁减少,果肉中木质素含量上升，大大削减其果实风味，造成经济损失。因此，研究枇杷果实木质化过程对枇杷果实的采后果实贮运期间的保鲜,货架期的延长、商品价值的提升具有现实意义。
3.目前，评价枇杷木质化程度主要是通过测量果实的硬度或者果肉中的木质素含量。果实的硬度，主要是使用质构仪模拟人的咀嚼行为，使用探头对果实进行穿刺实验，在探头所受的力学曲线中提取特定的峰值，用来评价果实的软硬程度。硬度的升高是枇杷果实木质化的症状的表现之一，果实的硬度还受到多种因素的影响。果实内部细胞的膨压，细胞壁的不同的成分和结构，细胞壁之间的粘连性都是果实硬度的影响因素。因此，硬度指标评估果实的木质化程度存在不够全面和精确的问题。果实木质素含量一般通过化学提取法测量，首先基于果肉匀浆，通过一系列分离、过滤、提纯步骤获得果肉匀浆样本中木质素的总量。与果实的硬度相比，基于化学提取法的木质素含量更能直观的反映出枇杷果实的木质化状况。但是化学提取法费时费力，需要几天的时间才能完全得到分离纯化的木质素成分；另一方面，化学提取法的取样基于果实匀浆，仅仅能够反应出整体的平均值，而木质素的在果实中的空间分布信息则被隐藏。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于解决传统的采用质构仪或化学提取法评价枇杷木质化存在影响因素考虑不全面，评价标准不够全面和精确的问题，提供一种枇杷果实木质化程度的细胞快速统计评价方法，基于显微成像对木质化细胞的形态、空间分布进行识别，可以根据不同的木质化情况和位置进行加权统计，对枇杷果实木质化程度进行更科学的评价。
5.本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种枇杷果实木质化程度的细胞快速统计评价方法，其特征在于：包括以下步骤：
6.步骤a、将枇杷果实沿着果实的赤道面剖开，去除一半果实、并去除果核，计算果实整个赤道面的果肉面积s；
7.步骤b、将赤道面果肉连续冷冻切片，将全部的切片进行间苯三酚方法染色处理；
8.步骤c、使用光学显微镜获取切片染色结果图，根据木质化细胞形态的不同，定义
木质化程度，将木质化细胞分为三类：初级木质化细胞p、中级木质化细胞r和终级木质化细胞u；
9.步骤d、将赤道面果肉分为三个环形区域，从外到内分别为靠果皮区域x、中间区域y和靠果核区域z，三个环形区域在每个半径方向的宽度均相等；
10.步骤e、分别统计果肉的x、y和z区域中，三种类型的木质化细胞的染色总面积，分别记作：
[0011][0012][0013][0014]
矩阵中以为例，表示x区域中初级木质化细胞p的面积；
[0015]
步骤f、分别统计果肉的x、y和z区域中，n个木质化细胞成团的染色面积，2≤n≤n，n值不同的成团木质化细胞染色面积分开统计，分别记作：
[0016][0017][0018][0019]
矩阵中以为例，表示x区域内2个木质化细胞贴靠成团的成团木质化细胞的染色总面积；表示x区域内n个木质化细胞贴靠成团的成团木质化细胞的染色总面积；
[0020]
步骤g、统计果肉x、y和z三个区域中，维管束染色区域总面积，分别记作：并统计每个区域维管束的条数，分别记作i
x
，i
y
和i
z
；
[0021]
步骤h、取一批同品种刚成熟采摘未经贮藏的枇杷果实，获取果肉x、y和z三个区域中，维管束染色面积的矫正系数：将枇杷果实按照步骤a切出果肉赤道面，并按步骤b进行冷冻切片及染色，按照步骤g统计果肉x、y和z三个区域中，维管束染色区域总面积，分别计算果肉x、y和z三个区域中，每条维管束染色区域面积的平均值，作为维管束矫正常数,分别记作：
[0022]
步骤i、计算每个区域的木质化指数lig
x
、lig
y
和lig
z
和整个果实的木质化指数lig：
[0023][0024][0025][0026]
lig＝a*(2lig
x
+lig
y
+0.5lig
z
)
[0027]
其中，a为k可人为设定的归一化系数，让lig值接近于1，减少小数点位数方便统计；
[0028]
步骤j、以木质化指数lig作为枇杷果实木质化评价指数，lig值越大，枇杷果实木
质化程度越严重。
[0029]
本方法中，将枇杷果肉按照从内到外分成三个区域，越靠外的细胞发生木质化，在木质化评价中的权重越大。枇杷木质化细胞按照木质化发展程度进行区分，分为初级木质化细胞p、中级木质化细胞r和终级木质化细胞u并分别统计其面积，木质化程度越高的果肉细胞木质化评价中的权重越大。并将枇杷木质化细胞的团聚现象进行统计，木质化细胞团聚越严重的细胞群木质化评价中的权重越大。最后对枇杷果肉中维管束的面积进行统计，并与初摘果实的维管束面积进行相减，获取在贮藏过程中维管束的面积增大情况，用于木质化评价中。本方法在枇杷果实木质化程度评价中，充分考虑了木质化细胞的空间分布因素、木质化细胞的木质化程度因素、木质化细胞的团聚因素，维管束增粗的因素，评价体系更加合理，对于果实木质化的成因和各因素影响均进行了加权计算，为后续的果实木质化各要素分项研究奠定了基础。
[0030]
作为优选，步骤c中，对于枇杷果肉细胞：细胞壁增厚但增厚部分未成环形、以及细胞壁增厚至环形但细胞壁厚度占小于细胞半径的1/4，则记为初级木质化细胞p；细胞壁增厚至环形且细胞壁厚度为细胞半径的1/4～3/4，则记为中级木质化细胞r；细胞壁增厚至环形且细胞壁厚度超过细胞半径的3/4，则记为终级木质化细胞u。枇杷果肉细胞的木质化是一个逐渐变化的过程，是一个细胞壁逐渐增厚的过程。初级木质化细胞p、中级木质化细胞r、终级木质化细胞u分别对应着细胞木质化的初期、中期、末期，
[0031]
作为优选，步骤b中，连续冷冻切片的每片厚度为40μm。
[0032]
作为优选，所述枇杷果实为洛阳青枇杷果实，取a＝1000，lig＝1000*(2lig
x
+lig
y
+0.5lig
z
)，lig≤0.5为无木质化，0.5＜lig≤0.75为轻度木质化，0.75＜lig≤1为中度木质化，1lig为重度木质化。
[0033]
本发明在枇杷果实木质化程度评价时，基于细胞级的显微成像，既考虑了木质化细胞在果肉中的空间分布因素，又考虑了木质化细胞的发展程度因素，还考虑了木质化细胞的团聚因素，建立了多因素不同权重的细胞快速统计评价方法，本方法的评价更加全面准确，让枇杷的木质化评价结果与实际品质关联性更好。
附图说明
[0034]
下面结合附图对本发明做进一步说明。
[0035]
图1是本发明的初级木质化细胞p显微镜图。
[0036]
图2是本发明的初级木质化细胞p的示意图。
[0037]
图3是本发明的中级木质化细胞r显微镜图。
[0038]
图4是本发明的中级木质化细胞r的示意图。
[0039]
图5是本发明的终级木质化细胞u显微镜图。
[0040]
图6是本发明的终级木质化细胞u的示意图。
[0041]
图7是本发明的2个木质化细胞组成的成团木质化细胞显微镜图。
[0042]
图8是本发明的2个木质化细胞组成的成团木质化细胞的示意图。
[0043]
图9是本发明的3个木质化细胞组成的成团木质化细胞显微镜图。
[0044]
图10是本发明的维管束w的显微镜图。
具体实施方式
[0045]
下面通过具体实施例并结合附图对本发明进一步说明。
[0046]
实施例，一种枇杷果实木质化程度的细胞快速统计评价方法，包括以下步骤：
[0047]
步骤a、将枇杷果实沿着果实的赤道面剖开，去除一半果实、并去除果核，计算果实整个赤道面的果肉面积s；
[0048]
步骤b、将赤道面果肉连续冷冻切片，将全部的切片进行间苯三酚方法染色处理；连续冷冻切片的每片厚度为40μm；
[0049]
步骤c、使用光学显微镜获取切片染色结果图，根据木质化细胞形态的不同，定义木质化程度，将木质化细胞分为三类：初级木质化细胞p、中级木质化细胞r和终级木质化细胞u；如对于枇杷果肉细胞：细胞壁增厚但增厚部分未成环形、以及细胞壁增厚至环形但细胞壁厚度占小于细胞半径的1/4，则记为初级木质化细胞p，如图1、2所示,将细胞壁增厚至环形但细胞壁厚度占小于细胞半径的1/4的木质化细胞p也通过图2统一示意，以与中级木质化细胞r做区分；细胞壁增厚至环形且细胞壁厚度为细胞半径的1/4～3/4，则记为中级木质化细胞r，如图3、4所示；细胞壁增厚至环形且细胞壁厚度超过细胞半径的3/4，则记为终级木质化细胞u，如图5、6所示；
[0050]
步骤d、将赤道面果肉分为三个环形区域，从外到内分别为靠果皮区域x、中间区域y和靠果核区域z，三个环形区域在每个半径方向的宽度均相等；
[0051]
步骤e、分别统计果肉的x、y和z区域中，三种类型的木质化细胞的染色总面积，分别记作：
[0052][0053][0054][0055]
矩阵中以为例，表示x区域中初级木质化细胞p的面积；
[0056]
步骤f、分别统计果肉的x、y和z区域中，n个木质化细胞成团的染色面积，2≤n≤n，n值不同的成团木质化细胞染色面积分开统计，分别记作：
[0057][0058][0059][0060]
矩阵中以为例，表示x区域内2个木质化细胞贴靠成团的成团木质化细胞的染色总面积，如图7、8所示；表示x区域内3个木质化细胞贴靠成团的成团木质化细胞的染色总面积，如图9所示；
[0061]
步骤g、统计果肉x、y和z三个区域中，维管束染色区域总面积，维管束显微镜结构如图10速食，分别记作：并统计每个区域维管束的条数，分别记作i
x
，i
y
和i
z
；其中，每一束聚合在一起的维管束记为一条；
[0062]
步骤h、取一批同品种刚成熟采摘未经贮藏的枇杷果实，获取果肉x、y和z三个区域中，维管束染色面积的矫正系数：将枇杷果实按照步骤a切出果肉赤道面，并按步骤b进行冷
冻切片及染色，按照步骤g统计果肉x、y和z三个区域中，维管束染色区域总面积，分别计算果肉x、y和z三个区域中，每条维管束染色区域面积的平均值，作为维管束矫正常数,分别记作：
[0063]
步骤i、计算每个区域的木质化指数lig
x
、lig
y
和lig
z
和整个果实的木质化指数lig：
[0064][0065][0066][0067]
lig＝a*(2lig
x
+lig
y
+0.5lig
z
)
[0068]
其中，a为k可人为设定的归一化系数，让lig值接近于1，减少小数点位数方便统计；
[0069]
步骤j、以木质化指数lig作为枇杷果实木质化评价指数，lig值越大，枇杷果实木质化程度越严重。以木质化lig值为依据对枇杷进行品质分级，可以指导枇杷仓储策略和销售策略。同时本方案提出的木质化评价体系，可以作为枇杷采后各种不同处理方式的效果评价指标，指导后续的试验研究。
[0070]
本实施例中，以洛阳青枇杷果实为例，取a＝1000，lig＝1000*(2lig
x
+lig
y
+0.5lig
z
)，lig≤0.5为无木质化，0.5＜lig≤0.75为轻度木质化，0.75＜lig≤1为中度木质化，1lig为重度木质化。
[0071]
取两类枇杷样本，分别为刚新鲜采摘的“洛阳青”枇杷和0℃贮藏6d的“洛阳青”枇杷。
[0072]
新鲜采摘的“洛阳青”枇杷统计数据如下：
[0073]
s＝10.20687617cm2＝1020687617μm2[0074][0075][0076][0077][0078][0079][0080][0081][0082][0083][0084][0085]
[0086]
i
x
＝56
[0087]
i
y
＝48
[0088]
i
z
＝19
[0089]
最后计算的结果值：
[0090]
lig
x
＝0.0000595371433787208
[0091]
lig
y
＝0.000385471
[0092]
lig
z
＝0.000169979
[0093]
lig＝0.482368≤0.5，无木质化。
[0094]
0℃贮藏6d的“洛阳青”枇杷统计数据如下：
[0095]
s＝12.50953167902cm2＝1250953167.902μm2[0096][0097][0098][0099][0100][0101][0102][0103][0104][0105][0106][0107][0108]
i
x
＝68
[0109]
i
y
＝56
[0110]
i
z
＝17
[0111]
最后计算的结果值：
[0112]
lig
x
＝0.0000438954824737649
[0113]
lig
y
＝0.000776167
[0114]
lig
z
＝0.000337217
[0115]
lig＝1.032566＞1，已严重木质化。