基于半球空间类复眼结构的体细胞激光诱导荧光探测方法与流程

本发明涉及一种激光诱导荧光检测方法，尤其涉及一种基于复眼仿生光学的单细胞三维分子体分布检测仪器方法。

背景技术：

细胞是构成生命体结构和实现生命功能的基本单位。从由单个细胞构成的细菌、蓝藻、原生动物，到高等动植物等多细胞生物，不同类型不同功能不同数量的细胞组成了生物体的组织、器官、系统等从简单到复杂的生命单元，从而实现了生命活动的多样性。

细胞体积较小，大部分典型细胞直径在1到30微米，个别较大的细胞可以大到厘米量级。借助于光学显微镜可以看到细胞的内部结构，对于细胞器的更细微的结构需要电子显微镜。由于细胞有运动、营养和繁殖等机能，含有生命活动丰富的信息，细胞内部有机无机分子的动态检测对理解细胞生理活动具有重要的作用。

用免疫荧光技术显示和检查细胞或组织内抗原或半抗原物质等方法称为免疫荧光细胞(或组织)化学技术，采用该技术与显微成像结合可以检测细胞内的特定蛋白分子，但常规方法无法得到特定待测分子在细胞内部的空间动态变化，因此无法满足对于细胞内部特定分子动态检测的需求，例如细胞内蛋白分子对某种分子的转运或作用过程；病毒分子在细胞内部与受体结合并侵蚀细胞的过程；药物分子在细胞内部的作用过程等。

例如已经公开的现有专利申请“一种免疫荧光检测装置”(中国专利公告号cn201917571u)的申请方案中公开了一种免疫荧光检测装置，其结构包括激光光源、激发光路、移动平台、荧光光路、光电转换系统、控制系统、数据处理系统及试剂卡，激光光源、激发光路和荧光光路装配在同一光学基座上，光学基座和移动平台安装在装置基座上，激光光源为一个固定在内套管和外套管中的半导体激光管。

上述现有的免疫荧光检测技术方案的缺陷十分显著，只能实现从单一固定光路角度对细胞进行检测，其检测结果是平面且非实时的，无法实现对特定待测分子在细胞内部的空间动态变化，因此无法满足对于细胞内部特定分子动态检测的需求。

技术实现要素：

本发明是为了克服现有的免疫荧光检测技术方案的上述不足之处，提供一种基于半球空间类复眼结构的体细胞激光诱导荧光探测方法，通过球形复眼结构在待测细胞周围的球形空间内设置均匀布置小眼光路结构，小眼光路结构连接激发光路结构和荧光光路结构构成的lif光路，进行激光激发和免疫荧光接收，能够实现的对待测细胞在三维空间各个角度上的动态检测，可实现对细胞内特定抗原分子空间分布及其变化的动态检测。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明的一种基于半球空间类复眼结构的体细胞激光诱导荧光探测方法，所述方法包括以下步骤：

步骤1，样品准备，根据需测定的抗原分子选择对应的抗体，使用荧光剂对抗体进行荧光标记，制备完成样品细胞混悬液；

步骤2，样品进样，将样品细胞混悬液以单细胞流方式加入球形复眼结构内，并通过上点头使待测细胞带均匀负电荷，所述球形复眼结构内设有对称的正电场，待测细胞运动至其质心近似与球心重合后，开始探测；

步骤3，复眼免疫lif检测，所述球形复眼结构在其球面上均匀布置有若干小眼光路结构，所述小眼光路结构连接激发光路结构和荧光光路结构；激发光路结构输出激光通过球形复眼结构上的小眼光路结构照射至待测细胞，通过荧光光路结构测定小眼光路结构的小眼光轴与待测细胞相交点处产生的lif信号反演出待测细胞抗原分子的体分布；

步骤4，lif信号处理，每隔一个固定时间t，重复步骤3，得到一系列随时间变化的lif信号，当完成预设的探测时间次数m后，结束探测；

对应于某一时刻的lif数据，通过分析每个小眼光轴与待测细胞相交点处的荧光的强弱，得到此点的抗原分子的相对数目，计算球形复眼结构上的所有小眼后，得出此时待测细胞抗原分子的体分布；对于m个时刻都采取相同的分析方法，可得到待测细胞抗原分子的体分布随时间的动态变化；可用系统软件将此动态变化通过三维空间动图的方式直观地显示出来。

作为优选，所述步骤1，进一步包括：

依据需测定的抗原分子选择对应的抗体，选择好抗体后，使用荧光剂对其进行荧光标记；将标记的荧光抗体，直接加在一定量的细胞样品上，经一定的温度和时间的染色，用水洗去未参加反应的多余荧光抗体，制备完成样品细胞混悬液。

作为优选，所述步骤2，进一步包括：

流式进样器启动流动液，形成鞘流；样品细胞混悬液从毛细管喷出，与鞘流一起流动，在流动管中间形成单细胞流，流出的待测细胞在流动管出口处，被上电头上电，带上均匀负电荷；

所述球形复眼结构包括上半球复眼罩体和下半球复眼罩体，所述球形复眼结构内设有对称的正电场，进入球形复眼结构内侧后，主控制器发出指令开启平动控制器，平动控制器控制下半球复眼向上运动，直至上半球复眼罩体和下半球复眼罩体拼合构成球形复眼结构，待测细胞运动至其质心近似与球心重合，此时开始检测。

作为优选，所述步骤3，进一步包括：

主控制器开启激光器和阵列驱动电路，激光器发出的激光沿输入光轴传输，经准直镜准直扩束，各个小透镜聚焦进入n根输入光纤，再通过y型接头进入小眼光路结构中的小眼光纤，再经小眼镜组会聚至球心处的待测细胞；

每个小眼光轴与待测细胞相交点处的抗原分子数目不同，抗原分子上面链接的荧光标记的抗体分子在激光的激发下产生荧光，荧光的强弱反应了抗原分子的数目多少；通过测定小眼光轴与待测细胞相交点处产生的lif信号就可反演出待测细胞抗原分子的体分布；

在激光激发下，抗原分子处产生的lif信号，由各小眼镜组信号收集聚焦至端面，然而进入小眼光纤，再通过y型接头进入输出光纤，输出光纤将信号送至光电管阵列，光电二极管将荧光信号转化为电信号；阵列驱动电路将光电管阵列输出的电信号进行放大和模数转换后送至主控制器储存分析。

本发明的技术方案，基于仿生复眼的细胞检测仪器。通过上、下半球复眼罩体拼合的球形复眼结构及内表面电极形成球内均匀电场，当电场力平衡时，可将均匀带电的细胞固定于球心位置，方便对兴趣分子在细胞的体分布进行探测。对每个小眼均采用小眼光路结构、激发光路结构和荧光光路结构构成的lif光路，进行激光激发和免疫荧光接收，可实现对细胞内特定抗原分子空间分布及其变化的动态检测，从而满足对细胞特定生理运动的研究需求。同时所述小眼光路结构是布置在球形复眼结构上，能够实现的对待测细胞在三维空间各个角度上的动态检测。通过以固定时间间隔进行探测，可得到待测细胞抗原分子的体分布随时间的动态变化；可用系统软件将此动态变化通过三维空间动图的方式直观地显示出来。

附图说明

图1为本发明的半球空间类复眼体细胞激光诱导荧光探测仪的总结构图。

图2为本发明中微透镜阵列结构图。

图3为本发明中光电管阵列结构图。

图4为本发明中上半球复眼罩体的结构图。

图5为本发明中小眼光路结构的结构图。

图6为本发明中待测细胞与小眼光轴关系图。

图7为本发明中上半球复眼罩体的侧视图。

图8为本发明中的上半球复眼罩体的子午面结构图。

图中标注：1、下半球复眼罩体；2、收集板；3、小眼光纤；4、y型接头；5、输出光纤；6、光电管阵列；7、阵列驱动电路；8、微透镜阵列；9、准直镜；10、激光器；11、输入光轴；12、流式进样器；13、样品口；14、鞘流；15、主控制器；16、单细胞流；17、待测细胞；18、上电头；19、输入光纤；20、小透镜；21、带通滤色片；22、光电二极管；23、安装小孔；24、小眼光轴；25、小眼前透镜；26、小眼后透镜；27、端面；28、抗原分子；29、极点；30、面间夹角；31、子午面；32、球心；33、光轴夹角；34、上半球复眼罩体；35、平动控制器；36、内表面电极；37、毛细管；38、流动管。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步描述。

如图1所示，本发明申请的一种基于半球空间类复眼结构的体细胞激光诱导荧光探测方法，是基于本申请实施例提供的一种半球空间类复眼体细胞lif探测仪实现的。所述的半球空间类复眼体细胞lif探测仪包括激发光路结构、荧光光路结构、流式进样器12和球形复眼结构。所述球形复眼结构包括可靠近拼接的上半球复眼罩体1和下半球复眼罩体34。所述下半球复眼罩体34设有平动控制器35，所述平动控制器35的控制下半球复眼罩体34上下运动靠近或远离上半球复眼罩体1。

如图1、图2所示，所述的激发光路结构包括依次对接的激光器10、准直镜9、微透镜阵列8、输入光纤19，所述的微透镜阵列8包括阵列布置的若干小透镜20，每根输入光纤19的末端和单独的一片小透镜20对接。

如图1、图3所示，所述的荧光光路结构包括输出光纤5、光电管阵列6、阵列驱动电路7，所述光电管阵列6包括带通滤色片21和光电二极管22，所述输出光纤5的末端连接单独的一组带通滤色片21和光电二极管22。

如图4、图5、图6所示，所述上半球复眼罩体1和下半球复眼罩体34布置有小眼光路结构。所述小眼光路结构均匀平布在球形复眼结构的各子午面31上，各小眼光路结构的小眼光轴24均指向球形复眼结构的球心32，各相邻小眼光轴24间的光轴夹角33相等，各相邻子午面31的面间夹角30均相等。

如图5所示，所述小眼光路结构包括小眼光纤3、小眼前透镜25和小眼后透镜26，所述的上半球复眼罩体1和下半球复眼罩体34均设有安装小孔23，所述小眼光纤3沿着小眼光轴24插入安装小孔23，小眼前透镜25设置在安装小孔23的内端的端面，所述小眼后透镜26设置在安装小孔23的中部。

所述输出光纤5和输入光纤19通过y型接头4连接小眼光纤3。

n根输入光纤19按小眼编号顺序排列并安装至微透镜阵列8，与数量同为n的小透镜20匹配；微透镜阵列8垂直于输入光轴11，并以输入光轴11为中心；激光器10用以发射激发lif荧光信号的泵浦激光；准直镜9将激光器10输出的激光扩束准直，覆盖微透镜阵列8；各个小透镜20将准直激光聚焦进各自对应的输入光纤19；n根输出光纤5按小眼编号顺序排列并安装至光电管阵列6，与数量同为n的光电二极管22匹配；每只光电二极管22覆盖带通滤色片21，其通带波长对应由泵浦激光激发荧光标记抗体产生的荧光波段，光电二极管22将荧光信号转化为电信号；阵列驱动电路7用于驱动光电管阵列6工作，并将光电管阵列6输出的电信号进行放大和模数转换后送至主控制器15储存分析。

所述的激发光路结构、荧光光路结构和小眼光路结构构成一个lif光路，使得球形复眼结构上的每个小眼都能够进行激光激发和免疫荧光接收，可实现对细胞内特定抗原分子空间分布及其变化的动态检测，从而满足对细胞特定生理运动的研究需求。同时所述小眼光路结构是布置在球形复眼结构上，能够实现的对待测细胞在三维空间各个角度上的动态检测。

所述的主控制器15用于向激光器10、平动控制器35、流式进样器12、上电头18、激光器10、阵列驱动电路7、收集板2发出控制指令，控制它们的工作，还用于接收阵列驱动电路7的数据进行储存及分析。

如图1、图7、图8所示，所述上半球复眼罩体1和下半球复眼罩体34设有两个极点29，内表面由金属镀膜而成，形成内表面电极36。上半球复眼罩体1和下半球复眼罩体34闭合拼接时，内表面电极36带正电使球形复眼结构内形成对称的内电场。所述的内电场为正。所述流式进样器12的出口位置设有用于给待测细胞带上负电荷的上电头18。所述流式进样器12包括毛细管37和流动管38，在球形复眼结构的另一侧设置收集板2，所述收集板2带正电。

进样时流式进样器启动流动液，沿流动管内四周流动，形成鞘流；样品细胞混悬液从毛细管37喷出，与鞘流14一起流动，在流动管中间形成单细胞流16，流出的待测细胞17在流动管38出口处，被上电头上电，带上均匀负电荷。进入球形复眼结构的内部后，上、下半球复眼罩体拼合，在复眼内部球对称内电场的作用下，带均匀负电荷的待测细胞运动至其质心近似与球心重合，在静电力的作用下近似处于平衡态，此时可开始检测；检测完成后，下半球复眼和上半球复眼分离，在带正电的收集板作用下，待测细胞向收集板靠近，直至贴合上收集板。

本发明申请的一种基于半球空间类复眼结构的体细胞激光诱导荧光探测方法，所述方法包括以下步骤：

步骤1，样品准备，根据需测定的抗原分子(28)选择对应的抗体，使用荧光剂对抗体进行荧光标记，制备完成样品细胞混悬液。

具体的，所述步骤1，进一步包括：

依据需测定的抗原分子(28)选择对应的抗体，选择好抗体后，使用荧光剂对其进行荧光标记；将标记的荧光抗体，直接加在一定量的细胞样品上，经一定的温度和时间的染色，用水洗去未参加反应的多余荧光抗体，制备完成样品细胞混悬液。

步骤2，样品进样，将样品细胞混悬液以单细胞流(16)方式加入球形复眼结构内，并通过上点头使待测细胞(17)带均匀负电荷，所述球形复眼结构内设有对称的正电场，待测细胞(17)运动至其质心近似与球心重合后，开始探测。

具体的，所述步骤2，进一步包括：

流式进样器(12)启动流动液，形成鞘流(14)；样品细胞混悬液从毛细管(37)喷出，与鞘流(14)一起流动，在流动管(38)中间形成单细胞流(16)，流出的待测细胞(17)在流动管(38)出口处，被上电头(18)上电，带上均匀负电荷。

所述球形复眼结构包括上半球复眼罩体(34)和下半球复眼罩体(1)，所述球形复眼结构内设有对称的正电场，进入球形复眼结构内侧后，主控制器(15)发出指令开启平动控制器(35)，平动控制器(35)控制下半球复眼向上运动，直至上半球复眼罩体(34)和下半球复眼罩体(1)拼合构成球形复眼结构，待测细胞(17)运动至其质心近似与球心重合，此时开始检测。

步骤3，复眼免疫lif检测，所述球形复眼结构在其球面上均匀布置有若干小眼光路结构，所述小眼光路结构连接激发光路结构和荧光光路结构；激发光路结构输出激光通过球形复眼结构上的小眼光路结构照射至待测细胞(17)，通过荧光光路结构测定小眼光路结构的小眼光轴(24)与待测细胞(17)相交点处产生的lif信号反演出待测细胞(17)抗原分子(28)的体分布。

具体的，所述步骤3，进一步包括：

主控制器(15)开启激光器(10)和阵列驱动电路(7)，激光器(10)发出的激光沿输入光轴(11)传输，经准直镜(9)准直扩束，各个小透镜(20)聚焦进入n根输入光纤(19)，再通过y型接头(4)进入小眼光路结构中的小眼光纤(3)，再经小眼镜组会聚至球心处的待测细胞(17)；

每个小眼光轴(24)与待测细胞(17)相交点处的抗原分子(28)数目不同，抗原分子(28)上面链接的荧光标记的抗体分子在激光的激发下产生荧光，荧光的强弱反应了抗原分子(28)的数目多少；通过测定小眼光轴(24)与待测细胞(17)相交点处产生的lif信号就可反演出待测细胞(17)抗原分子(28)的体分布；

在激光激发下，抗原分子(28)处产生的lif信号，由各小眼镜组信号收集聚焦至端面，然而进入小眼光纤(3)，再通过y型接头(4)进入输出光纤(5)，输出光纤(5)将信号送至光电管阵列(6)，光电二极管(22)将荧光信号转化为电信号；阵列驱动电路(7)将光电管阵列(6)输出的电信号进行放大和模数转换后送至主控制器(15)储存分析。

步骤4，lif信号处理，每隔一个固定时间t，重复步骤3，得到一系列随时间变化的lif信号，当完成预设的探测时间次数m后，结束探测；

对应于某一时刻的lif数据，通过分析每个小眼光轴(24)与待测细胞(17)相交点处的荧光的强弱，得到此点的抗原分子(28)的相对数目，计算球形复眼结构上的所有小眼后，得出此时待测细胞(17)抗原分子(28)的体分布；对于m个时刻都采取相同的分析方法，可得到待测细胞(17)抗原分子(28)的体分布随时间的动态变化；可用系统软件将此动态变化通过三维空间动图的方式直观地显示出来。

本发明的技术方案，基于仿生复眼的细胞检测仪器。通过上、下半球复眼罩体拼合的球形复眼结构及内表面电极形成球内均匀电场，当电场力平衡时，可将均匀带电的细胞固定于球心位置，方便对兴趣分子在细胞的体分布进行探测。对每个小眼均采用小眼光路结构、激发光路结构和荧光光路结构构成的lif光路，进行激光激发和免疫荧光接收，可实现对细胞内特定抗原分子空间分布及其变化的动态检测，从而满足对细胞特定生理运动的研究需求。同时所述小眼光路结构是布置在球形复眼结构上，能够实现的对待测细胞在三维空间各个角度上的动态检测。通过以固定时间间隔进行探测，可得到待测细胞抗原分子的体分布随时间的动态变化；可用系统软件将此动态变化通过三维空间动图的方式直观地显示出来。