一种简单的半乳甘露聚糖降解产物定量方法

1.本发明属于糖生物工程技术领域，具体涉及一种简单的半乳甘露聚糖降解产物定量方法。


背景技术：

2.半乳甘露聚糖是一种由甘露糖通过β
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1,4
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糖苷键形成主链，半乳糖以α
‑
1,6
‑
糖苷键形成支链的高聚合度杂多糖，是一种存在于田菁种子等植物中的天然植物多糖，可广泛应用于食品、饲料、材料、化工等领域。半乳甘露聚糖是一种水溶性多糖，但天然半乳甘露聚糖水溶液具有高粘度的特性，限制了其开发利用。近年来，随着糖生物工程的兴起，半乳甘露聚糖的降解产物因其出色的免疫增强功能而作为功能性添加剂在食品、饲料上的应用受到了普遍关注。据报道，半乳甘露聚糖更容易结合免疫细胞上的受体来激活免疫反应，如toll样受体4、甘露糖结合凝集素、甘露糖受体等，这些突出的特征构成了以甘露糖为主链的多糖的主要优势。
3.半乳甘露聚糖降解产物主要包括低聚物以及单糖。现阶段，对于半乳甘露聚糖降解产物的定量主要是通过色谱法实现的，首先将半乳甘露聚糖降解产物进行酸水解，使低聚物降解为单糖，然后通过高效液相色谱或离子色谱对单糖进行定量，同时对未酸解的半乳甘露聚糖酶水解液通过色谱法进行定量，最后通过换算得到低聚物和单糖含量。但高效液相色谱和离子色谱价格高昂，一般实验室不配备该仪器，因此需要一种简单、价格低廉、准确的方法。


技术实现要素：

4.针对现有技术中存在的问题，本发明要解决的技术问题在于提供一种简单的半乳甘露聚糖降解产物定量方法，该方法具有准确、价格低廉、易于操作等优点。
5.为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：一种简单的半乳甘露聚糖降解产物定量方法，将半乳甘露聚糖降解产物酸水解为单糖，利用dns法测定单糖含量，以此来对半乳甘露聚糖降解产物进行定量。
6.所述简单的半乳甘露聚糖降解产物定量方法，所述半乳甘露聚糖降解产物是指天然植物中的半乳甘露聚糖经生物方法或化学方法降解获得的降解产物，包括短链半乳甘露聚糖、半乳甘露低聚糖以及单糖。
7.所述简单的半乳甘露聚糖降解产物定量方法，对半乳甘露聚糖降解产物水解液离心，去上清液，利用dns法测定单糖含量，记为c2；同时，半乳甘露聚糖水解液稀释后利用dns法测定单糖含量，记为c1；最终半乳甘露聚糖水解液中低聚物含量采用如下公式计算：。
8.所述简单的半乳甘露聚糖降解产物定量方法，半乳甘露聚糖降解产物采用硫酸或盐酸水解。
9.所述简单的半乳甘露聚糖降解产物定量方法，半乳甘露聚糖降解产物采用质量分
数为8%的硫酸水解。
10.所述简单的半乳甘露聚糖降解产物定量方法，所述半乳甘露聚糖来自田菁种子、瓜尔豆、槐豆或葫芦巴豆。
11.所述简单的半乳甘露聚糖降解产物定量方法，包括以下步骤：（1）半乳甘露聚糖降解产物在121℃条件下酸水解反应1 h；（2）半乳甘露聚产物水解反应结束后，离心，去上清液并用蒸馏水定容，利用dns法测定单糖含量，记为c2；同时，将半乳甘露聚糖水解液稀释后利用dns法测定单糖含量，记为c1；最终得到半乳甘露聚糖水解液中低聚物含量。
12.有益效果：与现有的技术相比，本发明的优点包括：本发明简单的半乳甘露聚糖降解产物的定量方法，首先将半乳甘露聚糖降解产物水解为单糖，利用dns法测定单糖含量，以此来对半乳甘露聚糖降解产物进行定量。该方法具有准确、价格低廉、易于操作等优点；可在工业生产质量控制以及食品、饲料中半乳甘露聚糖降解产物的定量分析中广泛推广应用。
附图说明
13.图1是由半乳糖和甘露糖配成的混合单糖的标准曲线图。
具体实施方式
14.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
15.以下实施例中，dns溶液的配置方法为：称取3,5
‑
二硝基水杨酸（dns）7.5 g、氢氧化钠（naoh）14.0 g，依次充分溶解于1000 ml去离子水中（去离子水提前煮沸10 min，冷却），随后依次加入酒石酸钾钠（c4h4o6kna
·
4h2o）216.0 g、苯酚（c6h5oh）5.5 ml、偏重亚硫酸钠（nas2o5）6.0 g，充分溶解后装于棕色瓶中，置于4
ꢀº
c冰箱中，5 d后方可使用，有效期为30天。
16.dns法的具体操作步骤为：25 ml刻度试管中加入1 ml配制的半乳糖和甘露糖混合溶液，然后加入3.0 ml dns试剂，随后沸水浴中处理7 min，冷却后定容到25 ml，充分摇匀，于540 nm下测定反应混合物的吸光度，并根据吸光度与还原糖的相关关系，计算反应生成的还原糖的浓度。
17.实施例1一种简单的半乳甘露聚糖降解产物定量方法，具体步骤如下：（1）半乳糖和甘露糖混合溶液的配置由于田菁种子半乳甘露聚糖中半乳糖和甘露糖的摩尔比为1:1.6，因此在配置半乳糖和甘露糖的混合溶液时，取0.19g半乳糖和0.31 g甘露糖加入100 ml水中，配置成5 g/l的混合溶液，随后将混合溶液分别稀释成0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5 g/l的溶液，然后利用dns法测定单糖含量。
18.（2）半乳甘露聚糖提取物制备。
19.风干田菁胚乳片机械粉碎，按1:50固液比加入蒸馏水，于50 ℃抽提24 h后，于10000 转/分条件下离心10 min，获得上清液，向上清液中加入无水乙醇得到沉淀，沉淀物
经真空干燥得到半乳甘露聚糖粉状固体。
20.（3）半乳甘露聚糖的选择性酶水解。
21.称取步骤（2）中的半乳甘露聚糖提取物0.5 g于150 ml酶解瓶中，加入蒸馏水、2 ml内切甘露聚糖酶（甘露聚糖酶酶活为3.917 u/ml）、1mol/l柠檬酸缓冲液使反应液体积为50 ml，充分混合均匀，于ph值4.8、50 ℃条件下反应24h，酶水解反应结束后，将酶水解物置于100 ℃下处理10 min，使内切甘露聚糖酶失活，于10000 转/分条件下离心10 min，上清即为含半乳甘露聚糖降解产物的酶解液。
22.（3）半乳甘露聚糖水解液的酸水解取10 ml半乳甘露聚糖酶解液于水解瓶中，加入10 ml 8 % h2so4于121 ℃下反应1 h，反应结束后，使用50% naoh调节水解液ph值，然后离心，去上清液并用蒸馏水定容至30 ml，并利用dns法测定单糖含量，记为c2。同时，取10 ml半乳甘露聚糖水解液稀释3倍后利用dns法测定单糖含量，记为c1。最终半乳甘露聚糖水解液中低聚物含量的计算方法如下：。
23.（4）离子色谱法测定低聚物和单糖含量离子色谱测试条件如下：色谱仪：戴安离子色谱仪ics
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5000，色谱柱：2
×
250 mm dionex aminopac pa10，保护柱：2
×
50 mm dionex aminopac pa10，检测器：电导检测器，流动相：3 mmol氢氧化钠；流速：0.20 ml/min；柱温：30℃；进样体积：10.0 μl，外标法测定。取步骤（3）中酸解前和酸解后的上清液注入离子色谱仪。最终半乳甘露聚糖水解液中低聚物含量的计算方法如下：；其中m1和g1分别表示酸解前上清液中甘露糖和半乳糖浓度，m2和g2分别表示酸解后上清液中甘露糖和半乳糖浓度。
24.首先，利用dns法对半乳糖和甘露糖的混合标准溶液进行测定，得到标准曲线，如图1所示，方程为y=0.505x+0.0763，其中x表示混合单糖的浓度，y为吸光度，r2为0.9905。随后分别利用dns法和离子色谱法对半乳甘露聚糖水解液中半乳甘露聚糖降解产物进行测量，如表1所示（表1中的1、2、3表示同一样品重复进行三次检测的结果），dns法和离子色谱法对水解液中低聚物和单糖的浓度的定量结果相近，表明dns法可以准确定量半乳甘露聚糖降解产物。
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