五味消毒饮的指纹图谱检测方法与流程

五味消毒饮的指纹图谱检测方法
1.技术领域
2.本发明涉及一种中药的检测方法，具体涉及五味消毒饮的指纹图谱检测方法。


背景技术：

3.五味消毒饮出自《医宗金鉴》，由金银花、蒲公英、天葵子、野菊花、五味消毒饮5味药组成，具有清热解毒，消散疔疮等功效，常用于疔毒等症。现代研究表明，本方主要含有绿原酸、咖啡酸、木犀草苷、蒙花苷等成分，具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、增强机体免疫功能等作用，临床上广泛用于五官科、内科、外科、妇科等火毒湿热所致的感染性疾患。目前，五味消毒饮临床应用以传统汤剂为主，然而，其质量一致性易受煎煮方式及原药材品质的影响。因此，为了确保五味消毒饮后续研发的剂型能保持原方的药效，有必要建立标准煎液的质量控制方法。
4.中药复方制剂成分复杂，检测部分指标性成分并不能充分体现整体质量与药效。中药指纹图谱能全面、系统的反映复方制剂的整体特征，已成为中药质量控制的有效手段。本发明采用hplc法建立五味消毒饮标准煎液的指纹图谱，为五味消毒饮标准煎液的质量评价提供方法及依据。


技术实现要素：

5.发明目的：本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种五味消毒饮的指纹图谱检测方法，该检测方法可以客观、全面、准确的评价五味消毒饮的质量，对控制五味消毒饮的质量和保证临床疗效具有重要意义。
6.技术方案：为了实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种五味消毒饮的指纹图谱检测方法，包括以下步骤：步骤1、供试品溶液的制备：取不同批次的金银花、野菊花、蒲公英、紫花地丁和天葵子，加水浸泡后加热煎煮提取1~3次，过滤，合并药液，减压浓缩，过微孔滤膜，取续滤液，即得；步骤2、混合对照品溶液的制备：精密称取绿原酸、咖啡酸、木犀草苷和蒙花苷对照品适量，加甲醇配制成混合对照品溶液；步骤3、线性关系考察分别精密称取绿原酸和蒙花苷对照品至容量瓶，加甲醇溶解定容至刻度，然后分别取绿原酸对照品储备液用甲醇稀释至五个梯度浓度，取蒙花苷对照品储备液以甲醇稀释至五个梯度浓度，然后分别注入高效液相色谱仪测定峰面积，以标准品溶液的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，计算回归方程：步骤4、精密吸取步骤1的供试品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图；
nm为检测波长。
15.有益效果：1、本发明根据五味消毒饮中所含的活性成分的结构性质特点，通过大量实验筛选出最佳的流动相组成，梯度洗脱程序、流速、检测波长、色谱柱和柱温等分析条件，经多次实验验证表明，本发明提供的五味消毒饮检测方法，可以全面、客观、准确的检测和评价五味消毒饮的质量，为保证临床五味消毒饮疗效具有重要意义。
16.2、本发明提供的五味消毒饮的指纹图谱检测方法，具有方法简便、稳定性好、精密度高、重现性好等优点。
附图说明
17.图1为本发明16批五味消毒饮标准煎液hplc指纹图谱。
18.图2为混合对照品hplc指纹图谱。
具体实施方式
19.下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
20.以下实施例用到的仪器与试剂如下：1、材料1.1 仪器lc
‑
20at高效液相色谱仪（日本岛津公司）；el104电子天平（瑞士梅特勒
‑
托利多仪器有限公司）。
21.1.2 试药五味药材均购于安徽汇中州中药饮片有限公司和安徽金芙蓉中药饮片有限公司。经检验，以上药材水分、灰分、含量、浸出物等均符合2015年版《中国药典》一部中规定。16批次药材信息如下表1。
[0022] 表1 16批五味消毒饮标准煎液药材样品产地及批号
1.3对照品：对照品绿原酸（批号110753
‑
201716，纯度≥99%）和咖啡酸（批号110885
‑
201703，纯度≥99%）购于中国食品药品检定研究院，木犀草苷（批号17030405，纯度≥99%）和蒙花苷（批号15101207，纯度≥99%）购于北京北纳创联生物技术研究院。
[0023]
1.4 试剂：甲醇（色谱纯）和乙腈（色谱纯）购于安徽天地高纯溶剂有限公司，磷酸（分析纯）购于南京化学试剂股份有限公司。水为娃哈哈纯净水。实施例1 一种五味消毒饮的指纹图谱检测方法，包括以下步骤：一种五味消毒饮的指纹图谱检测方法，包括以下步骤：步骤1、供试品溶液的制备：取以上表1的16批次的金银花150 g、野菊花60 g、蒲公英60 g、紫花地丁60 g和天葵子60 g，加4.5 l水，浸泡20 min，加热至沸，沸腾20 min后过滤，药渣加4 l水，加热至沸，沸腾20 min后过滤，合并药液，减压浓缩至含生药1.0 g
·
ml
‑1；量取浓缩液1 ml，加入1 ml水，混匀，用80%甲醇定容至50 ml，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，即得。
[0024]
步骤2、混合对照品溶液的制备：精密称取绿原酸、咖啡酸、木犀草苷、蒙花苷对照品适量，加体积浓度80%甲醇配制成浓度分别为32μg
·
ml
‑1、19.68μg
·
ml
‑1、10.7μg
·
ml
‑1、17.28 μg
·
ml
‑1的对照品溶液；
步骤3、线性关系考察分别精密称取绿原酸对照品10.3mg和蒙花苷对照品1.1mg至25ml容量瓶，加甲醇溶解定容至刻度。绿原酸对照品储备液用甲醇稀释至264、132、66、33、16.5μg
·
ml
‑1，蒙花苷对照品储备液以甲醇稀释至35.2、17.6、8.8、4.4、2.2μg
·
ml
‑1，并分别注入高效液相色谱仪20μl测定峰面积（每个浓度测定三次），以标准品溶液的浓度（μg
·
ml
‑1）为横坐标，峰面积为纵坐标，计算回归方程为：绿原酸y=61125x
‑
22287（r=0.9999），线性范围为：16.5~264μg
·
ml
‑1；蒙花苷y=50264x+4248（r=0.9999），线性范围为：2.2~35.2μg
·
ml
‑1。：步骤4、精密吸取步骤1的供试品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，如图1所示；液相色谱条件为：色谱柱：ymc
‑
pack ods
‑
a柱，规格250
×
4.6 mm，5μm；流动相：a相为乙腈，b相为0.1%磷酸水溶液，洗脱梯度：0~20 min，90%~80%b；20~40 min，80%~75%b；40~52 min，75%~70%b；52~52.01 min，70%~90%b；52.01~60 min，90%b；流速1.0 ml/min；柱温30 ℃；检测波长330 nm；进样量20 μl；步骤5、将步骤4中获得的不同批次的五味消毒饮供试品溶液的指纹图谱导出，将其导入“中药指纹图谱相似度评价系统2012版，生成五味消毒饮特征指纹图谱，步骤6、取步骤2制备得到的混合对照品溶液，注入高效液相色谱仪（色谱条件同步骤4），记录色谱图如图2所示，通过比对各峰与混合对照品色谱峰保留时间，对五味消毒饮特征指纹图谱进行归属，五味消毒饮特征指纹图谱中共有13个共有峰，其中 3、6、9、13号峰分别为绿原酸、咖啡酸、木犀草苷和蒙花苷；在16批五味消毒饮标准煎液指纹图谱中，3号峰（绿原酸）峰面积最大且分离度好，故选用3号峰作为参照峰，计算共有峰的相对保留时间和相对峰面积。
[0025]
采用“中药指纹图谱相似度评价系统（2012版）”，对16批标准煎液的指纹图谱进行相似度分析，相似度结果分别为0.998、0.999、0.999、0.999、0.998、0.998、0.998、0.999、0.999、0.998、0.999、0.999、0.998、0.999、0.996、0.998，均大于0.99，说明样品制备方法及所建立的指纹图谱稳定可靠，能作为五味消毒饮标准煎液质量控制的参考依据。
[0026]
步骤7、根据步骤3建立的绿原酸和蒙花苷对照品回归方程，计算16批次供试品溶液中绿原酸和蒙花苷的含量，结果见表2。
[0027]
表2 样品含量测定结果（n=3）
[0028] 实施例2 指纹图谱检测方法学研究1、稳定性试验取按实施例1方法制备得到的同一供试品溶液，分别于0、2、4、6、8 h进样，按实施例1步骤4的色谱条件进行测定，对各共有峰相对保留时间及相对峰面积进行统计，结果显示相对保留时间和相对峰面积rsd均小于3%，表明供试品溶液在8 h内的稳定性良好。
[0029]
2、精密度试验取按实施例1方法制备得到的同一供试品溶液，连续进样5次，按实施例1步骤4的色谱条件进行测定，对各共有峰相对保留时间及相对峰面积进行统计，结果显示相对保留时间和相对峰面积rsd均小于3%，表明仪器精密度良好。
[0030]
3、重复性试验取按实施例1方法制备5份供试品溶液，按实施例1步骤4的色谱条件进行测定，对各共有峰相对保留时间及相对峰面积进行统计，结果显示相对保留时间和相对峰面积rsd均小于3%，表明该方法的重复性良好。
[0031]
4、加样回收试验绿原酸加样回收试验：按实施例1方法制备9份供试品溶液，每三份一组，取0.25ml标准煎液浓缩液，分别置25ml量瓶中，加入0.25ml水，摇匀，分别加入165μg
·
ml
‑1绿原酸对照品溶液10ml、13ml、15ml，再加入11.5ml的80%甲醇溶液，摇匀，经0.45mm微孔滤膜过滤，取续滤液为供试品溶液，按实施例1步骤4的色谱条件进行测定，结果见表3。
[0032]
蒙花苷加样回收试验：按实施例1方法制备9份供试品溶液，每三份一组，取0.30ml标准煎液浓缩液，分别置50ml量瓶中，加入0.70ml水，摇匀，分别加入44μg
·
ml
‑1蒙花苷对照品溶液4ml、5ml、6ml，再分别加入22ml、24ml、26ml的80%甲醇溶液，摇匀，经0.45mm微孔滤膜过滤，取续滤液为供试品溶液，按实施例1步骤4的色谱条件进行测定，结果见表4。
[0033]
表3 绿原酸加样回收试验结果（n=9）表4 蒙花苷加样回收试验结果（n=9）
试验结果表明，本发明建立的指纹图谱检测方法，稳定性好，精密度高，重复性好，能全面客观评价五味消毒饮的质量，为保证临床疗效具有重要的意义。
[0034]
以上实施例仅为本发明的示例性实施例，不用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域技术人员可以在本发明的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。