一种新型MTT细胞活力检测试剂盒及其应用的制作方法

一种新型mtt细胞活力检测试剂盒及其应用
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种mtt检测试剂盒及其应用。


背景技术：

2.mtt法是一种检测细胞存活和生长的方法，其检测原理为活细胞中的琥珀酸脱氢酶与mtt进行反应生成结晶紫甲瓒，用dmso溶解后可在一定波长下进行检测，从而间接反映活细胞数量。该方法已广泛用于大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。
3.一般的mtt检测试剂盒利用dmso溶解甲瓒，dmso不仅对人体有害，而且在低温条件下dmso易结冰，从而会影响甲瓒的溶解进而影响检测结果；且溶解甲瓒需去除原培养液，在去除培养液的过程中，可能会把结晶去掉，也会导致结果不稳定；最重要的是一般的mtt检测试剂盒无法充分将类器官中的琥珀酸脱氢酶释放出来，会造成结果不准确，重复性差等问题。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明旨在提供一种mtt检测试剂盒及其应用以解决上述问题。本发明的技术方案为：
5.第一个方面，本发明提供一种mtt检测试剂盒，包括试剂一和试剂二；所述试剂一包括以下终浓度的组分：mtt 5
‑
10mg/ml，分散酶ii 0.5
‑
1.5u/ml，纤维素酶0.05
‑
0.2mg/ml，溶剂为pbs；所述试剂二包括以下终浓度的组分：sds0.05
‑
0.5g/ml，异丁醇2
‑
10vt％，hcl 0.02
‑
0.2mol/l，溶剂为无菌水。
6.进一步地，所述试剂一的制备及保存方法为：按照组分的终浓度配料，将分散酶ii、mtt粉末、纤维素酶溶于pbs中，0.22μm滤膜过滤，于
‑
20℃避光保存。
7.进一步地，所述试剂二的制备及保存方法为：按照组分的终浓度配料，将sds、异丁醇、盐酸、无菌水混合均匀至得到溶液，室温保存。
8.第二个方面，本发明提供上述mtt检测试剂盒在类器官药敏活力检测中的应用。
9.第三个方面，本发明提供一种类器官药敏活力检测方法，包括：
10.(1)接种48h后将类器官培养板取出，加入待测药物后，于5％co2、37℃继续培养72
‑
96h；
11.(2)在类器官培养板中加入试剂一继续培养2
‑
4h；
12.(3)在孔板中加入试剂二继续培养4～6h，于570nm进行药敏活力检测。
13.本发明提供了一种新的mtt检测试剂盒及药敏检测方法，与传统mtt检测方法相比，具有以下几个优点：。
14.1、本方法可以不需要用dmso溶解和去除上清，操作难度更小，安全性更高。
15.2、本方法不受温度限制，甲瓒的溶解效果优于一般的mtt药敏检测方法，更适用于类器官的药敏活力检测。
16.3、本方法在药敏实验的准确性和重复性方面优于一般的mtt药敏检测方法。
附图说明
17.图1为本发明实施例6的人肺癌类器官细胞活力随恩曲替尼药物浓度变化的曲线图。
18.图2为本发明实施例7的人肠癌类器官细胞活力随瑞戈非尼药物浓度变化的曲线图。
19.图3为本发明实施例8的人乳腺癌类器官细胞活力随依维莫司药物浓度变化的曲线图。
20.图4为本发明实施例9的人子宫内膜癌类器官细胞活力随byl
‑
719药物浓度变化的曲线图。
21.图5为本发明实施例10的人卵巢癌类器官细胞活力随依托泊苷药物浓度变化的曲线图。
22.图6为本发明对比例1的人肺癌类器官细胞活力随恩曲替尼药物浓度变化的曲线图。
23.图7为本发明对比例2的人肠癌类器官细胞活力随瑞戈非尼药物浓度变化的曲线图。
24.图8为本发明对比例3的人乳腺癌类器官细胞活力随依维莫司药物浓度变化的曲线图。
25.图9为本发明对比例4的人子宫内膜癌类器官细胞活力随byl
‑
719药物浓度变化的曲线图。
26.图10为本发明对比例5的人卵巢癌类器官细胞活力随依托泊苷药物浓度变化的曲线图。
27.图11为本发明对比例6的人乳腺癌类器官细胞活力随依维莫司药物浓度变化的曲线图。
28.图12为本发明对比例7的人子宫内膜癌类器官细胞活力随byl
‑
719药物浓度变化的曲线图。
29.图13为本发明对比例8的人卵巢癌类器官细胞活力随奥拉帕利药物浓度变化的曲线图。
具体实施方式
30.本发明具体实施例采用的传统mtt检测试剂盒购自碧云天生物技术有限公司，货号为st1537
‑
1g
31.在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
32.下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
33.实施例1
34.本实施例提供一种mtt检测试剂盒，包括试剂一和试剂二；所述试剂一包括以下终浓度的组分：mtt 5mg/ml，分散酶ii 0.5u/ml，纤维素酶0.05mg/ml，溶剂为pbs；所述试剂二包括以下终浓度的组分：sds 0.1g/mol，异丁醇5vt％，hcl 0.1mol/l，溶剂为无菌水。所述试剂一的制备及保存方法为：按照组分的终浓度配料，将分散酶ii、mtt粉末、纤维素酶溶于pbs中，0.22μm滤膜过滤，于
‑
20℃避光保存。所述试剂二的制备及保存方法为：按照组分的终浓度配料，将sds、异丁醇、浓盐酸、无菌水混合均匀至得到溶液，室温保存。
35.实施例2
36.本实施例提供一种mtt检测试剂盒，包括试剂一和试剂二；所述试剂一包括以下终浓度的组分：mtt 6mg/ml，分散酶ii 0.8u/ml，纤维素酶0.08mg/ml，溶剂为pbs；所述试剂二包括以下终浓度的组分：sds 0.3g/mol，异丁醇2.5vt％，hcl 0.15mol/l，溶剂为无菌水。所述试剂一和所述试剂二的制备及保存方法同实施例1。
37.实施例3
38.本实施例提供一种mtt检测试剂盒，包括试剂一和试剂二；所述试剂一包括以下终浓度的组分：mtt 7mg/ml，分散酶ii 1.0u/ml，纤维素酶0.10mg/ml，溶剂为pbs；所述试剂二包括以下终浓度的组分：sds 0.08g/ml，异丁醇8vt％，hcl 0.06mol/l，溶剂为无菌水。所述试剂一和所述试剂二的制备及保存方法同实施例1。
39.实施例4
40.本实施例提供一种mtt检测试剂盒，包括试剂一和试剂二；所述试剂一包括以下终浓度的组分：mtt8mg/ml，分散酶ii 1.2u/ml，纤维素酶0.15mg/ml，溶剂为pbs；所述试剂二包括以下终浓度的组分：sds 0.1g/mol，异丁醇3vt％，hcl 0.2mol/l，溶剂为无菌水。所述试剂一和所述试剂二的制备及保存方法同实施例1。
41.实施例5
42.本实施例提供一种mtt检测试剂盒，包括试剂一和试剂二；所述试剂一包括以下终浓度的组分：mtt 10mg/ml，分散酶ii 1.5u/ml，纤维素酶0.2mg/ml，溶剂为pbs；所述试剂二包括以下终浓度的组分：sds 0.4g/mol，异丁醇2.5vt％，hcl 0.1mol/l，溶剂为无菌水。所述试剂一和所述试剂二的制备及保存方法同实施例1。
43.实施例6
44.本实施例提供一种人肺癌类器官的药敏活力检测方法，是采用实施例1的mtt检测试剂盒进行，药物为恩曲替尼，该检测方法包括以下步骤：
45.(1)以3000cell/孔将消化后的类器官接种至96孔板中，48h后将类器官培养板取出，加入待测药物后(6浓度，2复孔)，于5％co2、37℃继续培养72h；
46.(2)在类器官培养板中加入试剂一继续培养3h；
47.(3)继续在孔板中加入试剂二培养4h，待结晶溶解后于570nm测定吸光度。
48.(4)该实验平行进行3次。
49.检测结果如表1所示：
50.表1 实施例6的人肺癌类器官药敏活力检测结果
[0051][0052]
图1提供了本实施例人肺癌类器官细胞活力随恩曲替尼药物浓度变化的曲线，表明：该试剂盒在该类器官实验上的重复性、准确性以及稳定性较好。
[0053]
实施例7
[0054]
本实施例提供一种人肠癌类器官的药敏活力检测方法，是采用实施例2的mtt检测试剂盒进行，药物为瑞戈非尼，检测方法以及步骤同实施例6，结果如表2所示：
[0055]
表2 实施例7的人肠癌类器官药敏活力检测结果
[0056][0057]
图2提供了本实施例人肠癌类器官细胞活力随瑞戈非尼药物浓度变化的曲线，表明：该试剂盒在该类器官实验上的重复性、准确性以及稳定性较好。
[0058]
实施例8
[0059]
本实施例提供一种人乳腺癌类器官的药敏活力检测方法，是采用实施例3的mtt检测试剂盒进行，药物为依维莫司，检测方法以及步骤同实施例6，结果如表3所示：
[0060]
表3 实施例8的人乳腺癌类器官药敏活力检测结果
[0061][0062]
图3提供了本实施例人乳腺癌类器官细胞活力随依维莫司药物浓度变化的曲线，表明：该试剂盒在该类器官实验上的重复性、准确性以及稳定性较好。
[0063]
实施例9
[0064]
本实施例提供一种人子宫内膜癌类器官的药敏活力检测方法，是采用实施例4的mtt检测试剂盒进行，药物为byl
‑
719，检测方法以及步骤同实施例6，结果如表4所示：
[0065]
表4 实施例9的人子宫内膜癌类器官药敏活力检测结果
[0066][0067][0068]
图4提供了本实施例人子宫内膜癌类器官细胞活力随byl
‑
719药物浓度变化的曲线，表明：该试剂盒在该类器官实验上的重复性、准确性以及稳定性较好。
[0069]
实施例10
[0070]
本实施例提供一种人卵巢癌类器官的药敏活力检测方法，是采用实施例5的mtt检测试剂盒进行，药物为依托泊苷，检测方法以及步骤同实施例6，结果如表5所示：
[0071]
表5 实施例10的人卵巢癌类器官药敏活力检测结果
[0072][0073]
图5提供了本实施例人卵巢癌类器官细胞活力随依托泊苷药物浓度变化的曲线，表明：该试剂盒在该类器官实验上的重复性、准确性以及稳定性较好。
[0074]
对比例1
[0075]
本对比例提供一种人肺癌类器官的药敏活力检测方法，是采用传统的mtt检测试剂盒进行，药物为恩曲替尼，该检测方法包括以下步骤：
[0076]
(1)以3000cell/孔将消化后的类器官接种至96孔板中，48h后将类器官培养板取出，加入待测药物后(6浓度，2复孔)，于5％co2、37℃继续培养72h；
[0077]
(2)在类器官培养板中加入mtt试剂继续培养3h；
[0078]
(3)将类器官培养板取出，去除上清后，加入dmso溶液，于摇床上震荡至结晶紫全部溶解(约10
‑
20min)，于570nm测定吸光度。
[0079]
(4)实验平行进行3次，结果如表6所示：
[0080]
表6 对比例1的人肺癌类器官药敏活力检测结果
[0081][0082][0083]
图6提供了本对比例人肺癌类器官细胞活力随恩曲替尼药物浓度变化的曲线，表明：该试剂盒在该类器官实验上的重复性、准确性以及稳定性较差。
[0084]
对比例2
[0085]
本对比例提供一种人肠癌类器官的药敏活力检测方法，是采用传统的mtt检测试剂盒进行，药物为瑞戈非尼，该检测方法包括步骤同对比例1，结果如表7所示：
[0086]
表7 对比例2的人肠癌类器官药敏活力检测结果
[0087][0088]
图7提供了本对比例人肠癌类器官细胞活力随瑞戈非尼药物浓度变化的曲线，表明：该试剂盒在该类器官实验上的重复性、准确性以及稳定性较差。
[0089]
对比例3
[0090]
本对比例提供一种人乳腺癌类器官的药敏活力检测方法，是采用传统的mtt检测试剂盒进行，药物为依维莫司，该检测方法包括步骤同对比例1，结果如表8所示：
[0091]
表8 对比例3的人乳腺癌类器官药敏活力检测结果
[0092][0093]
图8提供了本对比例人乳腺癌类器官细胞活力随依维莫司药物浓度变化的曲线，表明：该试剂盒在该类器官实验上的重复性、准确性以及稳定性较差。
[0094]
对比例4
[0095]
本对比例提供一种人子宫内膜癌类器官的药敏活力检测方法，是采用传统的mtt检测试剂盒进行，药物为byl
‑
719，该检测方法包括步骤同对比例1，结果如表9所示：
[0096]
表9 对比例4的人子宫内膜癌类器官药敏活力检测结果
[0097][0098]
图9提供了本对比例人子宫内膜癌类器官细胞活力随byl
‑
719药物浓度变化的曲线，表明：该试剂盒在该类器官实验上的重复性、准确性以及稳定性较差。
[0099]
对比例5
[0100]
本对比例提供一种人卵巢癌类器官的药敏活力检测方法，是采用传统的mtt检测试剂盒进行，药物为依托泊苷，该检测方法包括步骤同对比例1，结果如表10所示：
[0101]
表10 对比例5的人卵巢癌类器官药敏活力检测结果
[0102][0103]
图10提供了本对比例人卵巢癌类器官细胞活力随依托泊苷药物浓度变化的曲线，表明：该试剂盒在该类器官实验上的重复性、准确性以及稳定性较差。
[0104]
对比例6
[0105]
本对比例提供一种人乳腺癌类器官的药敏活力检测方法，采用的mtt检测试剂盒与实施例3相近，区别在于：将分散酶ii替换成分散酶v，其具体成分包括试剂一和试剂二；所述试剂一包括以下终浓度的组分：mtt 7mg/ml，分散酶v1.0u/ml，纤维素酶0.10mg/ml，溶剂为pbs；所述试剂二包括以下终浓度的组分：sds 0.1g/mol，异丁醇5vt％，hcl 0.1mol/l，溶剂为无菌水。所述试剂一和所述试剂二的制备及保存方法同实施例1。
[0106]
所采用的药物为依维莫司，检测方法以及步骤同实施例6，结果如表11所示：
[0107]
表11 对比例6的人乳腺癌类器官药敏活力检测结果
[0108][0109]
图11供了本对比例人乳腺癌类器官细胞活力随依维莫司药物浓度变化的曲线，表明：该试剂盒在该类器官实验上的重复性、准确性以及稳定性较差。
[0110]
对比例7
[0111]
本对比例提供一种mtt检测试剂盒和一种人子宫内膜癌类器官的药敏活力检测方法，采用的mtt检测试剂盒与实施例4相近，区别在于：将纤维素酶替换成木瓜蛋白酶，其具体成分包括试剂一和试剂二；所述试剂一包括以下终浓度的组分：mtt8mg/ml，分散酶ii 1.2u/ml，木瓜蛋白酶0.15mg/ml，溶剂为pbs；所述试剂二包括以下终浓度的组分：sds 0.1g/mol，异丁醇5vt％，hcl0.1mol/l，溶剂为无菌水。所述试剂一和所述试剂二的制备及保存方法同实施例1。
[0112]
所采用的药物为byl
‑
719，检测方法以及步骤同实施例6，结果如表12所示：
[0113]
表12 对比例6的人子宫内膜癌类器官药敏活力检测结果
[0114][0115]
图12供了本对比例人子宫内膜癌类器官细胞活力随byl
‑
719药物浓度变化的曲线，表明：该试剂盒在该类器官实验上的重复性、准确性以及稳定性较差。
[0116]
对比例8
[0117]
本对比例提供一种mtt检测试剂盒和一种人卵巢癌类器官的药敏活力检测方法，采用的mtt检测试剂盒与实施例5相近，区别在于：将异丁醇替换成乙醇，其具体成分包括试剂一和试剂二；所述试剂一包括以下终浓度的组分：mtt10mg/ml，分散酶ii 1.5u/ml，纤维素酶0.2mg/ml，溶剂为pbs；所述试剂二包括以下终浓度的组分：sds 0.1g/mol，乙醇5vt％，hcl 0.1mol/l，溶剂为无菌水。所述试剂一和所述试剂二的制备及保存方法同实施例1。
[0118]
所采用的药物为奥拉帕利，检测方法以及步骤同实施例6，结果如表13所示：
[0119]
表13 对比例6的人卵巢癌类器官药敏活力检测结果
[0120][0121]
图13供了本对比例人卵巢癌类器官细胞活力随奥拉帕利药物浓度变化的曲线，表明：该试剂盒在该类器官实验上的重复性、准确性以及稳定性较差。
[0122]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并
不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。