超声辅助闪式提取桂花纯露的提取工艺及活性测定方法

本发明属于日化产品领域，涉及一种桂花纯露，具体涉及一种超声辅助闪式提取桂花纯露的提取工艺及抗氧化，美白活性的测定方法和基础数据。

背景技术：

桂花(osmanthusfragrans)系木犀科常绿灌木或小乔木，中国的十大传统名花之一。桂花花香宜人，浓则远溢，清可绝尘，可食用亦可入药，在中国已有2500多年的药食历史。桂花性温味辛，暖胃止痛，可以化痰散瘀，对食欲不振、抗龋齿，经闭腹痛具有疗效；桂花精油，浸膏，净油在调香和芳香疗法领域备受偏爱。近年来，芳香植物蒸馏的副产物--纯露越来越受到消费者的喜爱；市场上出现各类植物的纯露产品(包括桂花纯露)作为护肤水，并且消炎，美白，去黄气，祛痘，抗衰老等功效宣称层出不穷。其实这些功效得益于纯露中相当复杂的混合物，含有微量的精油和多种水溶性成分。但关于纯露的活性研究多集中在抑菌性，而对其它的功效认知还多来源于古书记载，实践经验甚至是类比推断，因此对纯露的活性和安全性评价研究亟待提出适用的测定方法步骤。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是：如何评价桂花纯露的活性和安全性，以及如何充分利用桂花植物资源，使桂花纯露在提取环节中富集更多的活性成分。

为了解决上述就似乎问题，本发明提供了一种超声辅助闪式提取桂花纯露的提取工艺，其包括如下步骤：

步骤1)：将烘干的桂花放入食盐水浸泡；

步骤2)：将步骤1)得到的泡有桂花的食盐水在闪式提取器上闪式提取；

步骤3)：将步骤2)得到的提取物搅拌均匀后，置于超声波仪中超声；

步骤4)：步骤3)得到的物料静置后放入已灭菌蒸馏装置蒸馏，再添加蒸馏水；以沸腾为标准起点计时，控制蒸馏速率，使用灭菌瓶接取蒸汽冷凝液；

步骤5)：将步骤4)得到的冷凝液放进超净台自然冷却至室温，无菌环境下过滤，得到的纯露密封后冷藏。

优选地，所述步骤2)中闪式提取的设定电压为15v；步骤3)中超声的功率为600w，超声时间不低于30min。

本发明还提供了一种桂花纯露的抗氧化活性测定，将上述超声辅助闪式提取桂花纯露的提取工艺制备的桂花纯露按照二倍稀释法稀释成不同浓度待测；分别进行dpph自由基清除实验、abts自由基清除实验。

优选地，所述的dpph自由基清除清除实验具体为：将每个样品和0.16mm用无水乙醇稀释的dpph溶液在96孔板中混合，并在30℃避光放置；在30分钟后，通过使用酶标仪测量它们于517nm处的吸光度；维生素c用作阳性对照，乙醇用作空白对照，每组实验重复三次，结果取平均值，dpph自由基清除公式如下：

％inhibition＝(1-a1/a0)×100％；

其中，a1为样品和dpph溶液的吸光度，a0为无水乙醇和dpph溶液的吸光度。

优选地，所述的abts自由基清除实验具体为：将7.0mmol/labts水溶液与4.90mmol/l过硫酸钾水溶液按照体积比1:1的比例充分混合，将混合液在暗处室温条件下放置过夜反应，得到含有abts阳离子自由基的深绿色溶液，用无水乙醇稀释，分光光度计测定的吸光度为0.700±0.020nm时可作为工作液；将每个浓度的样品和工作液体积比1：1依次加入96孔板中，在30℃的黑暗中保存；6min后，用酶标仪在734nm处测定吸光度，以维生素c为阳性对照，乙醇为空白对照，abts自由基清除率按以下公式计算：

％inhibition＝(1-b1/b0)×100％

其中，b1为样品和abts工作液的吸光度，b0为无水乙醇和abts工作液的吸光度。

本发明还提供了一种桂花纯露的体外酪氨酸酶活性抑制实验方法，将上述超声辅助闪式提取桂花纯露的提取工艺制备的桂花纯露按照二倍稀释法稀释成不同浓度待测；缓冲溶液pbs的ph为6.8，酪氨酸酶溶液为50u/ml，l-dopa溶液为5mm；首先向a、b、c、d孔中依次加入pbs；在a、b孔中分别加入样品，然后将酪氨酸酶溶液放入a和c中，反应后，最后把l-dopa溶液添加到四孔中连续孵育5分钟后，在475nm下测量吸光度，选择曲酸作为阳性对照；体外酪氨酸酶活性抑制率计算公式如下：

其中，a为既有酪氨酸酶溶液、又有样品的吸光度，b为有样品、但无酪氨酸酶溶液的吸光度，c为有酪氨酸酶溶液、无样品的吸光度，d为没有酪氨酸酶溶液或样品的吸光度。

本发明还提供了一种桂花纯露的细胞毒性及美白活性测定方法，包括桂花纯露的细胞增值检测实验，细胞内酪氨酸酶活性测定实验，细胞内黑色素含量实验；首先将上述超声辅助闪式提取桂花纯露的提取工艺制备的桂花纯露作为样品组设置不同的浓度梯度；再设置阴性对照组、空白对照组和阳性对照组；

所述的细胞增值检测实验具体为：取对数生长期的b16f10细胞，按照4×10³个细胞/孔接种到96孔板中，按照100μl/孔加入含10％cck8的培养基，5％co2，37℃恒温培养箱中培养；酶标仪检测450nm处的吸光度值；相对活力的计算公式如下：

相对活力％＝(样品组od值-空白od值)/(阴性对照组od值均值-空白od值)×100；

所述的细胞内酪氨酸酶活性测定实验具体为：取对数生长期的b16f10细胞，进行细胞计数，调整细胞浓度，按照4×10³个细胞/孔接种到96孔板中，5％co2，37℃恒温培养箱中培养过夜；将各浓度样品及阳性对照曲酸溶液以100μl/孔分别加入，每个处理均设置3个复孔，培养48h；移除培养基，每孔加入质量分数为1％triton-x100水溶液50μl，迅速放入-80℃冰箱内冷冻30min，取出后在水浴37℃下融化，使细胞完全破裂；加入1mg/mll-dopa溶液100μl，37℃水浴40min后，用酶标仪检测480nm下各孔的od值；酪氨酸酶活性的计算公式如下：

酪氨酸酶活性＝(试验孔od－空白孔od)/(对照孔od－空白孔od)×100％

所述的细胞内黑色素含量实验具体为：取对数生长期的b16f10细胞，进行细胞计数，调整细胞浓度，按照4×10³个细胞/孔接种到96孔板中，5％co2，37℃恒温培养箱中培养过夜；将各浓度样品及阳性对照曲酸溶液以100μl/孔分别加入，每个处理均设置3个复孔，培养48h；移除培养基，加入100μl含10％dmso的1mol/lnaoh溶液，80℃水浴1h使黑色素完全溶解，用酶标仪测定波长405nm处各孔的吸光度；黑色素相对含量的计算公式如下：

黑色素相对含量＝(试验孔od－空白孔od)/(对照组od－空白孔od)×100％

优选地，所述的阳性对照组采用10mg/ml曲酸。

该发明经闪式提取器的强大的破碎力，旋片与液体间产生的空化作用，超声波对植物细胞壁破碎作用，将花瓣中更多的活性物质带入溶液中，提高了桂花产品附加值；并且提供桂花纯露的体外和细胞美白实验及抗氧化测定方法与实验数据，证明桂花纯露细胞毒性极低，具有抗氧化活性和美白活性。

附图说明

图1为桂花纯露成分总离子流图；

图2为桂花纯露的抗氧化性；

图3为桂花纯露体外酪氨酸酶活性抑制率；

图4为桂花纯露对细胞增殖的影响；

图5为桂花纯露对细胞酪氨酸酶活性的影响；

图6为桂花纯露对细胞黑色素含量的影响。

具体实施方式

为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。

实施例1

超声辅助闪式蒸馏法提取桂花纯露：

1.实验设备及药品：

3000ml烧杯，5000ml烧瓶，球形冷凝管，clevenger装置，玻璃棒，玻璃珠，无菌瓶，

闪式提取器(jbht-50t，河南智晶生物科技有限公司)，超声波细胞粉碎(scientz-iid，中国宁波新芝生物技术有限公司)，无菌低速滤纸，超净台；电子天平pl203型(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)。

2.桂花纯露提取步骤：

1)将70℃快速烘干的100g桂花花朵放入1000ml食盐水浸泡；

2)将步骤1)的物料先以15v电压闪式提取30s；

3)上下左右搅拌均匀后，将物料置于超声波仪中以600w功率超声3次，每次10分钟。

4)将步骤3)的物料静置11.5h，放入已灭菌蒸馏装置蒸馏，再添加蒸馏水1000ml；以沸腾为标准起点计时，控制蒸馏速率约5.1ml/min，使用灭菌瓶接取3h蒸汽冷凝液。

5)将步骤4)冷凝液，放进超净台自然冷却至室温，无菌环境下低速过滤，取出少量待测，剩余纯露密封后放入5-8℃冰箱冷藏。

实施例2

桂花纯露的抗氧化活性测定：

1.实验设备及药品：

紫外分光光光度计uv-6000型(上海元析仪器有限公司)；酶标仪(multiskanfc，thermofishertechnology有限公司，中国)；96孔板；无水乙醇、1,1-二苯基-2-苦肼基(自由基)(dpph)、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(abts)、过硫酸钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠(上海泰坦科技股份有限公司)。

2.实验步骤：

按照二倍稀释法将纯露稀释为如下样品浓度：

q(纯样品)，0.5q，0.25q，0.125q，0.0625q；

1)dpph自由基清除实验

将每个样品和0.16mmdpph溶液(用无水乙醇稀释)在96孔板中混合，并在30℃避光放置。在30分钟后，通过使用酶标仪测量它们于517nm处的吸光度。维生素c用作阳性对照，乙醇用作空白对照。每组实验重复三次，结果取平均值。

dpph自由基清除公式如下:

％inhibition＝(1-a1/a0)×100％

a1：样品和dpph溶液的吸光度，

a0：无水乙醇和dpph溶液的吸光度。

2)abts自由基清除实验

abts阳离子自由基是abts经过硫酸盐氧化得到。abts水溶液(7.0mm)与适量的过硫酸钾水溶液(4.90mm)按照按体积比1:1的比例充分混合，然后混合液在暗处室温条件下放置过夜反应，得到含有abts阳离子自由基的深绿色溶液。用无水乙醇稀释，分光光度计测定的吸光度为0.700±0.020nm时可作为工作液。将每个浓度的样品和工作液体积比1:1依次加入96孔板中，在30℃的黑暗中保存。6min后，用酶标仪在734nm处测定吸光度。以维生素c为阳性对照，乙醇为空白对照。abts自由基清除率按以下公式计算：

％inhibition＝(1-b1/b0)×100％

b1：样品和abts工作液的吸光度,

b0：无水乙醇和abts工作液的吸光度。

实施例3

桂花纯露的体外酪氨酸酶活性抑制实验

1.实验设备及药品：

紫外分光光光度计uv-6000型(上海元析仪器有限公司)；酶标仪(multiskanfc，thermofishertechnology有限公司，中国)；恒温水浴锅，超声清洗仪，移液枪，容量瓶，96孔板，离心管；酪氨酸酶，来自蘑菇(上海迈瑞尔化学技术有限公司)，曲酸，pbs(ph＝6.8)，l-dopa，无水乙醇(上海泰坦科技股份有限公司)，超纯水。

2.实验步骤：

向a、b、c、d孔中依次加入100μl，150μl，150μl，200μlpbs(ph＝6.8)。在a和b孔中分别加入50μl各样品，然后将50μl酪氨酸酶溶液(50u/ml)放入a和c中，在37℃下反应10分钟。快速将100μll-dopa(5mm)溶液添加到四孔中。将96孔板在37℃下连续孵育5分钟后，在475nm下测量吸光度。选择曲酸作为阳性对照。体外酪氨酸酶活性抑制率计算公式如下：

a为既有酪氨酸酶溶液、又有样品的吸光度，b为有样品、但无酪氨酸酶溶液的吸光度，c为有酪氨酸酶溶液、无样品的吸光度，d为没有酪氨酸酶溶液或样品的吸光度。

实施例4

桂花纯露的细胞增殖实验

1.实验设备及药品：

co2恒温培养箱(北京桑翌实验仪器研究所，型号：wiggenswci-180)；超净工作台(上海笃特科学仪器有限公司，型号：sw-cj-2fd)；离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司，型号：td5)；酶标仪(tecan，型号：spark10m)胎牛血清(biologicalindustries，货号：04-007-1a)；dmem(nahco3，1.5g/l)培养基(赛百慷生物货号：icell-128-0001)；pbs(procell，货号：wh0112201911xp)；dmem培养基：胎血清为9:1的比例进行配制细胞完全培养基，胰酶(biosharp，货号：143188)；cck8(invigentech，货号：iv08-100)；b16f10细胞，购自上海赛百慷生物。

2.实验步骤：

1)首先将分为样品组sample(浓度为16％、4％、1％、0.25％、0.0625％)、阴性对照组、空白对照组和阳性对照(10mg/ml曲酸)共3组。

2)取对数生长期的b16f10细胞，进行细胞计数，调整细胞浓度，按照4×10³个细胞/孔接种到96孔板中，5％co2(培养箱内气体体积中co2控制在5％，下同)，37℃恒温培养箱中培养过夜。

3)将各梯浓度样品及阳性对照曲酸溶液以100μl/孔分别加入，每个处理均设置3个复孔，用pbs清洗各孔三次，按照100μl/孔加入含10％cck8的培养基，5％co2，37℃恒温培养箱中培养2小时。酶标仪检测450nm处的吸光度值。相对活力％＝(样品组od值-空白od值)/(阴性对照组od值均值-空白od值)×100

实施例5

桂花纯露的细胞内酪氨酸酶活性测定实验

1.实验设备及药品：

co2恒温培养箱(北京桑翌实验仪器研究所，型号：wiggenswci-180)；超净工作台(上海笃特科学仪器有限公司，型号：sw-cj-2fd)；离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司，型号：td5)；酶标仪(tecan，型号：spark10m)胎牛血清(biologicalindustries，货号：04-007-1a)；dmem(nahco3，1.5g/l)培养基(赛百慷生物货号：icell-128-0001)；dmem培养基：胎血清为9:1的比例进行配制细胞完全培养基，pbs(procell，货号：wh0112201911xp)；胰酶(biosharp，货号：143188)；tritonx-100(solarbio，货号：t8200)

2.实验步骤：

1)首先将分为样品组sample(浓度为16％、8％、4％、2％、1％)、阴性对照组、空白对照组和阳性对照(10mg/ml曲酸)共3组。

2)取对数生长期的b16f10细胞，进行细胞计数，调整细胞浓度，按照4×10³个细胞/孔接种到96孔板中，5％co2，37℃恒温培养箱中培养过夜。将各浓度样品及阳性对照曲酸溶液以100μl/孔分别加入，每个处理均设置3个复孔，培养48h。

3)移除培养基，用pbs清洗各孔两次，每孔加入质量分数为1％triton-x100水溶液50μl，迅速放入-80℃冰箱内迅速冷冻30min，取出后在水浴37℃下融化约30min，使细胞完全破裂。

4)加入1mg/mll-dopa溶液100μl，37℃水浴40min后，用酶标仪检测480nm下各孔的od值。

酪氨酸酶活性＝(试验孔od－空白孔od)/(对照孔od－空白孔od)×100％

实施例6

桂花纯露的细胞内黑色素含量实验

1.实验设备及药品：

同实施例4

2.实验步骤：

1)首先将分为样品组sample(浓度为16％、8％、4％、2％、1％)、阴性对照组、空白对照组和阳性对照(10mg/ml曲酸)共3组。

2)取对数生长期的b16f10细胞，进行细胞计数，调整细胞浓度，按照4×10³个细胞/孔接种到96孔板中，5％co2，37℃恒温培养箱中培养过夜。将各浓度样品及阳性对照曲酸溶液以100μl/孔分别加入，每个处理均设置3个复孔，培养48h。

3)移除培养基。用pbs清洗各孔两次，加入100μl含10％dmso的1mol/lnaoh溶液，80℃水浴1h使黑色素完全溶解，用酶标仪测定波长405nm处各孔的吸光度。

黑色素相对含量＝(试验孔od－空白孔od)/(对照组od－空白孔od)×100％

各实施例具体数据结果如下：

表1桂花纯露主成分及相对含量

表2桂花纯露的抗氧化性

表3桂花纯露体外酪氨酸酶活性抑制率

表4桂花纯露对细胞增殖的影响

表5桂花纯露对细胞酪氨酸酶活性的影响

表6桂花纯露对细胞黑色素含量的影响

综上所述，本发明提出一种超声辅助闪式蒸馏法提取桂花纯露的工艺，得到了香气淡雅果感十足的桂花纯露，同时为证明其功能性和安全性提供了测定方案和数据支撑。