一种琥珀安神丸的质量控制方法与流程

1.本发明涉及一种中成药琥珀安神丸(水蜜丸)的质量控制方法，属于中药制剂分析与质量控制技术领域。


背景技术：

2.琥珀安神丸(水蜜丸)具有育阴养血、补心安神。用于心血不足、怔仲健志，心悸失眠，虚烦不安的功效，主要成分和含量如下：
[0003][0004]
其制备方法为：以上十八味原料药粉碎成细粉，过筛，混匀。每100g粉末加炼蜜15～20g制成水蜜丸，干燥，即得，所得产品为棕色至棕褐色的水蜜丸，味甘、微酸、辛。
[0005]
原琥珀安神丸为9克/丸的大蜜丸，原标准(ws3‑
b
‑
2621
‑
97)只有五味子、甘草、酸枣仁3味的显微鉴别，尚没有比较全面的质量控制方法反映琥珀安神丸(水蜜丸)的质量状况，因而无法对琥珀安神丸(水蜜丸)的生产过程和产品质量进行有效地控制，不能较好的保证其药物疗效。为增加产品质量可控性、保证产品质量，研究一种简单、全面、专属性好、稳定性好的反映琥珀安神丸(水蜜丸)质量情况的检测方法十分必要。


技术实现要素：

[0006]
本发明的目的在于提供一种琥珀安神丸(水蜜丸)的质量控制方法，该方法专属性强、稳定可靠、重现性好，能够较为全面、准确地分析药物活性组分，有利于对琥珀安神丸(水蜜丸)的生产过程和产品质量进行有效地质量控制，有利于稳定产品的质量，确保临床用药安全性和有效性，保证琥珀安神丸的临床疗效，更好地满足医疗和市场的需要。
[0007]
在研究时，本发明参考《中国药典》2020年版一部及相关制剂项下的薄层鉴别方法，对处方中的当归、五味子、人参、远志、甘草(蜜炙)、地黄、酸枣仁(炒)、麦冬、茯苓、丹参、玄参、桔梗12味原料药进行了薄层鉴别研究，经研究最终建立了3味药材(五味子、甘草、酸枣仁)的显微鉴别和5味药材(当归、五味子、人参、远志、甘草)的薄层(tlc)鉴别方法，具有方法简单、专属性强等优点。
[0008]
高效液相色谱(hplc)具有快速、灵敏、分离效能高等优点，在中药定性和定量分析中，采用hplc法分离特征成分后，用检测器进行检测分析，是全面评价中药组合物质量的有效方法。在上述显微鉴别和薄层鉴别的基础上，本发明同时采用hplc法测定琥珀安神丸(水
蜜丸)中的五味子醇甲的含量，引入五味子醇甲含量作为质量控制指标，更好的控制产品质量，该方法分离效能高、灵敏、准确、专属性好、耐用性强，稳定性好，重现性好，且阴性无干扰，能够有效保证产品质量的稳定性和可控性。
[0009]
本发明详细技术方案如下：
[0010]
一种琥珀安神丸的质量控制方法，所述琥珀安神丸为水蜜丸，该方法以显微鉴别法鉴别琥珀安神丸中的五味子、甘草、酸枣仁；以薄层色谱法鉴别琥珀安神丸中的当归、五味子、人参、远志和甘草；采用hplc法测定琥珀安神丸中五味子醇甲的含量。通过这三个定性和定量指标的有机结合，能够更为全面、准确的反映琥珀安神丸的质量，便于对琥珀安神丸进行有效的质量控制。
[0011]
进一步的，所述显微鉴别法的操作步骤为：将琥珀安神丸与水合氯醛混合制片，所得片剂放在显微镜下，观察片剂中五味子、甘草和酸枣仁的性状。
[0012]
进一步的，显微镜观察时，种皮表皮石细胞，淡黄棕色表面观类多角形，壁较厚，孔沟细密，胞腔内含暗棕色物(五味子)；纤维束周围薄壁细胞含草酸钙方晶，形成晶纤维(甘草)；种皮栅状细胞棕红色，表面观多角形，直径约15μm，壁厚，木化，胞腔小。侧面观，细胞一列，呈长方形，长60～80μm(酸枣仁)。五味子、甘草和酸枣仁均有很突出的显微特征，专属性强，阴性无干扰，能够简便、快捷的对琥珀安神丸的质量情况进行检测。
[0013]
进一步的，以薄层色谱法鉴别琥珀安神丸中当归的步骤为：
[0014]
1)供试品溶液的制备：取琥珀安神丸10g，研细，加乙酸乙酯50ml，超声处理15分钟，过滤取滤液，将滤液挥干溶剂，剩余物加乙酸乙酯lml使其溶解，作为供试品溶液；
[0015]
2)对照品溶液的制备：取当归对照药材0.5g，研细，加乙酸乙酯10ml，超声处理15分钟，过滤取滤液，将滤液挥干溶剂，剩余物加乙酸乙酯lml使其溶解，作为对照品溶液；
[0016]
3)点样、展开：参照中国药典中记载的薄层色谱法(中国药典2020年版通则0502)试验，吸取供试品溶液和对照品溶液各10μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以体积比4:1的正己烷
‑
乙酸乙酯为展开剂进行展开，展开后取出硅胶g薄层板，晾干，在紫外光(365nm)下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
[0017]
进一步的，以薄层色谱法鉴别琥珀安神丸中五味子的步骤为：
[0018]
1)供试品溶液的制备：取琥珀安神丸10g，研细，加三氯甲烷100ml，加热回流30分钟，过滤取滤液，将滤液挥干溶剂，剩余物加三氯甲烷lml使其溶解，作为供试品溶液；
[0019]
2)对照品溶液的制备：取五味子对照药材lg，研细，加三氯甲烷100ml，加热回流30分钟，过滤取滤液，将滤液挥干溶剂，剩余物加三氯甲烷lml使其溶解，作为对照品溶液；
[0020]
3)点样、展开：参照中国药典中记载的薄层色谱法(中国药典2020年版通则0502)试验，吸取供试品溶液和对照品溶液各2μl，分别点于同一硅胶gf
254
薄层板上，以体积比15∶5∶1的沸程30～60℃的石油醚
‑
甲酸乙酯
‑
甲酸的上层溶液为展开剂进行展开，展开后取出硅胶gf
254
薄层板，在紫外光灯(254nm)下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
[0021]
进一步的，以薄层色谱法鉴别琥珀安神丸中人参的步骤为：
[0022]
1)供试品溶液的制备：取琥珀安神丸20g，研细，加三氯甲烷100ml，加热回流1小时，过滤取药渣，将药渣挥干溶剂，加水2ml搅拌湿润，加水饱和正丁醇50ml，超声处理30分钟，吸取上清液加3体积倍量氨试液(将400ml浓氨溶液加水溶解成1000ml制得)，摇匀，放置
分层，取上层液蒸干，剩余物加甲醇lml使其溶解，作为供试品溶液；
[0023]
2)对照品溶液的制备：取人参对照药材0.5g，研细，加三氯甲烷100ml，加热回流1小时，过滤取药渣，将药渣挥干溶剂，加水2ml搅拌湿润，加水饱和正丁醇50ml，超声处理30分钟，吸取上清液加3体积倍量氨试液，摇匀，放置分层，取上层液蒸干，剩余物加甲醇lml使其溶解，作为对照品溶液；
[0024]
3)点样、展开：参照中国药典中记载的薄层色谱法(中国药典2020年版通则0502)试验，吸取供试品溶液和对照品溶液各10μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以体积比15∶40∶22∶10的三氯甲烷
‑
乙酸乙酯
‑
甲醇
‑
水在10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开后将硅胶g薄层板取出，晾干，喷以10wt％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色淸晰，置日光下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
[0025]
进一步的，以薄层色谱法鉴别琥珀安神丸中远志的步骤为：
[0026]
1)供试品溶液的制备：取琥珀安神丸20g，研细，加70wt％甲醇100ml，超声处理30分钟，过滤取滤液，滤液挥干溶剂，剩余物加甲醇2ml使其溶解，作为供试品溶液；
[0027]
2)对照品溶液的制备：取远志对照药材0.5g，研细，加70wt％甲醇100ml，超声处理30分钟，过滤取滤液，滤液挥干溶剂，剩余物加甲醇2ml使其溶解，作为对照品溶液；
[0028]
3)点样、展开：参照中国药典中记载的薄层色谱法(中国药典2020年版通则0502)试验，吸取供试品溶液和对照品溶液各10μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以体积比7∶3∶1的三氯甲烷
‑
甲醇
‑
水的下层溶液为展开剂，展开后取出硅胶g薄层板，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
[0029]
进一步的，以薄层色谱法鉴别琥珀安神丸中甘草的步骤为：
[0030]
1)供试品溶液的制备：取琥珀安神丸20g，研细，加乙醚100ml，加热回流1小时，过滤取药渣，将药渣加甲醇50ml，加热回流1小时，过滤取滤液，将滤液挥干溶剂，剩余物加水40ml使其溶解，然后用正丁醇提取3次，每次20ml，合并正丁醇提取液，用水洗涤3次，弃去水液，然后将正丁醇液蒸干，剩余物加甲醇1ml使其溶解，作为供试品溶液；
[0031]
2)对照品溶液的制备：取甘草对照药材0.5g，研细，加乙醚100ml，加热回流1小时，过滤取药渣，将药渣加甲醇50ml，加热回流1小时，过滤取滤液，将滤液挥干溶剂，剩余物加水40ml使其溶解，然后用正丁醇提取3次，每次20ml，合并正丁醇提取液，用水洗涤3次，弃去水液，然后将正丁醇液蒸干，剩余物加甲醇1ml使其溶解，作为对照品溶液；
[0032]
3)点样、展开：参照中国药典中记载的薄层色谱法(中国药典2020年版通则0502)试验，吸取供试品溶液和对照品溶液各10μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以体积比13∶7∶2三氯甲烷
‑
甲醇
‑
水在10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开后取出硅胶g薄层板，晾干，喷以10wt％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
[0033]
进一步的，hplc法测定五味子醇甲含量的步骤为：
[0034]
1)供试品溶液的制备：取琥珀安神丸适量，研细，混匀，精密称取1.5
‑
2g，置研钵中，加硅藻土4g，研匀，转移至具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取滤液，即为供试品溶液；
[0035]
2)对照品溶液的制备：取五味子醇甲对照品适量，精密称定，加甲醇制成每20μg/ml的溶液，即为对照品溶液；
[0036]
3)hplc色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比55∶45的甲醇
‑
水为流动相；检测波长为250nm；流速为1ml/min；柱温为室温；理论板数按五味子醇甲峰计算不低于6000；
[0037]
4)测定方法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，根据峰面积计算五味子醇甲含量。
[0038]
进一步的，hplc法检测中，超声功率为100w，超声频率为40khz。
[0039]
进一步的，琥珀安神丸中含五味子以五味子醇甲(c
11
h6o3)计，每1g不得少于0.18mg。
[0040]
为了对琥珀安神丸(水蜜丸)质量进行全面检测，有效对其质量进行控制，发明人经过大量试验，对制剂中药材及药材有效成分进行了定性和定量检测，建立了中药琥珀安神丸(水蜜丸)新的质量控制方法。本发明采用显微鉴别法鉴别制剂中五味子、甘草、酸枣仁；以薄层色谱法鉴别制剂中当归、五味子、人参、远志、甘草；同时采用hplc测定制剂中五味子的五味子醇甲含量，从而实现了对琥珀安神丸(水蜜丸)质量的全面评价和控制，为琥珀安神丸(水蜜丸)的真伪鉴别和内在质量检测提供了全面、可靠的依据，保证了产品质量的稳定性及临床用药的安全性、有效性，更好地满足医疗和市场的需要。
附图说明
[0041]
图1琥珀安神丸(水蜜丸)中五味子醇甲的紫外扫描图；
[0042]
图2五味子药材的hplc色谱图；
[0043]
图3不含五味子阴性样品的hplc色谱图；
[0044]
图4琥珀安神丸(水蜜丸)样品的hplc色谱图；
[0045]
图5五味子醇甲对照品的hplc色谱图；
[0046]
图6琥珀安神丸(水蜜丸)的五味子醇甲峰面积与浓度线性关系图；
[0047]
图7琥珀安神丸(水蜜丸)的五味子显微鉴别图；
[0048]
图8琥珀安神丸(水蜜丸)的甘草显微鉴别图；
[0049]
图9为琥珀安神丸(水蜜丸)的酸枣仁显微鉴别图；
[0050]
图10为琥珀安神丸(水蜜丸)的当归tlc色谱；
[0051]
图11为琥珀安神丸(水蜜丸)的五味子tlc色谱图；
[0052]
图12为琥珀安神丸(水蜜丸)的人参tlc色谱图；
[0053]
图13为琥珀安神丸(水蜜丸)的远志tlc色谱；
[0054]
图14为琥珀安神丸(水蜜丸)的甘草tlc色谱图；
[0055]
图15为琥珀安神丸(水蜜丸)的地黄tlc色谱图；
[0056]
图16为琥珀安神丸(水蜜丸)的酸枣仁tlc色谱图；
[0057]
图17为琥珀安神丸(水蜜丸)的麦冬tlc色谱图；
[0058]
图18为琥珀安神丸(水蜜丸)的茯苓tlc色谱图；
[0059]
图19为琥珀安神丸(水蜜丸)的丹参tlc色谱图；
[0060]
图20为琥珀安神丸(水蜜丸)的桔梗tlc色谱图；
[0061]
图21为琥珀安神丸(水蜜丸)的玄参tlc色谱图。
具体实施方式
[0062]
下面通过具体的实施例对本发明进行进一步详细说明，本实施例以本发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
[0063]
实施例1
[0064]
五味子醇甲的hplc方法学研究
[0065]
1、仪器和试剂
[0066]
仪器：ag135型电子分析天平(瑞士mettler)，岛津高效液相色谱仪lc
‑
15c型泵，spd
‑
15c检测器，agilent hc
‑
c
18
(250mm
×
4.6mm，5μm)色谱柱；理论板数按五味子醇甲峰计算应不低于6000。
[0067]
对照品：五味子醇甲(含量测定用，中国食品药品检定研究院，20mg，110857
‑
201815，纯度：99.7％)。
[0068]
供试品：琥珀安神丸(水蜜丸)。
[0069]
2、色谱条件的选择
[0070]
2.1检测波长选择：精密称取五味子醇甲对照品适量，加甲醇制成每1ml含20μg的溶液，照紫外分光光度法(《中国药典》2020年版四部通则0401)，在波长200～400nm的范围内扫描，五味子醇甲在波长222nm、250nm处有最大吸收(图1)，因此选择检测波长为250nm。
[0071]
2.2流动相的确定：参考《中国药典》2020年版一部天王补心丸中五味子醇甲的含量测定方法，确定以甲醇
‑
水(55∶45)为流动相。
[0072]
3、提取方法选择：
[0073]
3.1提取方法选择试验：
[0074]
对照品溶液制备：取五味子醇甲对照品(110857
‑
201815)10.11mg，置50ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，作为对照品贮备液；精密量取对照品贮备液1ml置10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液。
[0075]
供试品溶液制备：取琥珀安神丸(批号：20201101)约2g，研细，共4份，精密称定，置研钵中，加硅藻土4g，研匀，转移至具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20ml，密塞，称定重量，两份超声处理(功率100w，频率40khz)30min，两份回流提取30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0076]
分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪测定，色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比55∶45的甲醇
‑
水为流动相；检测波长为250nm；流速为1ml/min；柱温为室温；理论板数按五味子醇甲峰计算不低于6000。根据峰面积计算五味子醇甲含量，结果见表1。
[0077]
表1不同提取方法的比较
[0078]
提取方法超声提取回流提取含量(mg/g)0.220.22
[0079]
结果：超声处理和回流提取含量基本一致，超声处理方法简便，故提取方法确定为超声处理。
[0080]
3.2提取时间选择试验：
[0081]
对照品溶液制备：精密量取3.1项下对照品贮备液1ml置10ml量瓶中，用甲醇稀释
至刻度，摇匀，即得。
[0082]
供试品溶液制备：取琥珀安神丸(批号：20201101)约2g，研细，共6份，精密称定，置研钵中，加硅藻土4g，研匀，转移至具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20ml，密塞，称定重量，两份超声处理(功率100w，频率40khz)20min，两份超声处理(功率100w，频率40khz)30min，两份超声处理(功率100w，频率40khz)40min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0083]
分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，色谱条件同上，即得，结果见表2。
[0084]
表2五味子醇甲含量测定提取时间选择结果表
[0085]
提取时间(min)203040含量(mg/g)0.200.220.21
[0086]
结果：超声处理20、30和40分钟含量基本一致，为保证五味子醇甲提取完全，故确定超声处理时间为30分钟。
[0087]
3.3提取溶剂选择试验：
[0088]
对照品溶液制备：精密量取3.1项下对照品贮备液1ml置10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
[0089]
供试品溶液制备：取琥珀安神丸(批号：20201101)约2g，研细，共6份，精密称定，置研钵中，加硅藻土4g，研匀，转移至具塞锥形瓶中，两份精密加入乙醇20ml，两份精密加入70％甲醇20ml，两份精密加入甲醇20ml，密塞，称定重量，超声处理(功率100w，频率40khz)30min，放冷，再称定重量，分别用相应溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0090]
分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，色谱条件同上，即得，结果见表3。
[0091]
表3五味子醇甲含量测定提取溶剂选择结果表
[0092]
提取溶剂乙醇70％甲醇甲醇平均含量(mg/g)0.130.160.22
[0093]
结果：用甲醇提取即可提取完全，乙醇、70％甲醇均不能提取完全，因此，选择甲醇作为提取溶剂。
[0094]
3.4溶剂用量选择试验：
[0095]
对照品溶液制备：精密量取3.1项下对照品贮备液1ml置10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
[0096]
供试品溶液制备：取琥珀安神丸(批号：20201101)约2g，研细，共6份，精密称定，置研钵中，加硅藻土4g，研匀，转移至具塞锥形瓶中，两份精密加入甲醇10ml，两份精密加入甲醇20ml，两份精密加入甲醇30ml，密塞，称定重量，超声处理(功率100w，频率40khz)30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0097]
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，色谱条件同上，即得，结果见表4。
[0098]
表4五味子醇甲含量溶剂用量选择结果表
[0099]
溶剂用量(ml)102030
平均含量(mg/g)0.180.210.22
[0100]
结果：提取溶剂为20ml、30ml时含量变化不大，10ml时含量较低，不能充分提取，为便于试验，选择20ml。
[0101]
3.5根据上述筛选，确定的最佳供试品溶液制备方法为：
[0102]
取本品1.5
‑
2g，研细，精密称定，置研钵中，加硅藻土4g，研匀，转移至具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20ml，密塞，称定重量，超声处理(功率100w，频率40khz)30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0103]
4、稳定性试验：
[0104]
对照品溶液制备：取五味子醇甲对照品(110857
‑
201815)9.85mg置50ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液，精密量取对照品贮备液1ml置10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
[0105]
供试品溶液：取琥珀安神丸(批号：20201101)约2g，精密称定，置研钵中，加硅藻土4g，研匀，转移至具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20ml，密塞，称定重量，超声处理(功率100w，频率40khz)30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0106]
精密吸取上述对照品溶液和供试品溶液各10μl，分别于0小时、2小时、4小时、6小时、8小时，12小时时，注入液相色谱仪，色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比55∶45的甲醇
‑
水为流动相；检测波长为250nm；流速为1ml/min；柱温为室温；理论板数按五味子醇甲峰计算不低于6000。结果见表5。
[0107]
表5五味子醇甲含量测定稳定性试验结果表
[0108][0109]
结果：对照品溶液和供试品溶液在12小时内峰面积rsd分别为1.32％和1.68％，证明对照品溶液和供试品溶液在12小时内稳定性良好。
[0110]
5、精密度试验：
[0111]
对照品溶液制备：精密吸取稳定性项下对照品贮备液1ml置10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
[0112]
精密吸取五味子醇甲对照品溶液10μl，注入液相色谱仪，色谱条件同稳定性试验，并记录色谱图。连续进样6次，计算峰面积积分值的rsd，结果见表6。
[0113]
表6五味子醇甲含量测定精密度试验结果表
[0114][0115]
结果表明：对照品rsd为1.32％，证明仪器精密度良好。
[0116]
6、线性关系考察：
[0117]
线性溶液的制备：取五味子醇甲对照品(110857
‑
201815)9.85mg(纯度99.7％)置50ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液，分别精密量取0.2ml、0.6ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml和3.0ml储备液置10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
[0118]
分别精密吸取上述溶液各10μl，注入液相色谱仪，色谱条件同稳定性试验，并记录色谱峰面积，表7所示。
[0119]
表7五味子醇甲对照品线性范围测定结果
[0120][0121]
以峰面积值(a)为纵坐标，以对照品溶液浓度(c)为横坐标，进行线性回归，得线性回归方程为：a＝19680c+6974.3，r＝0.99905(图6)。结果表明：五味子醇甲在3.9282～58.9227μg/ml范围内与峰面积的线性关系良好。
[0122]
7、重复性试验：
[0123]
对照品溶液制备：取“稳定性”项下对照品贮备液，精密量取1ml置10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
[0124]
供试品溶液制备：取琥珀安神丸(批号：20201101)约2g，按“稳定性”项下供试品溶液制备方法制备，即得，同法配制6份。
[0125]
分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，色谱条件同上，即得。结果见表8。
[0126]
表8五味子醇甲含量测定重复性试验结果表
[0127][0128]
结果表明：本试验方法的重复性良好。
[0129]
8、加样回收率试验：
[0130]
供试品溶液制备：取同一批已知含量的琥珀安神丸(批号：20201101，含量：0.22mg/g)约1g，精密称定，共6份，置研钵中，加入硅藻土2g，研匀，分别精密加入五味子醇甲对照品溶液(196.409μg/ml)1ml，精密加入甲醇19ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟(功率100w，频率40khz)，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。结果见表9。
[0131]
计算公式：回收率(％)＝(测得量－样品含量)/对照品加入量
×
100％
[0132]
表9五味子醇甲含量测定加样回收率试验结果表
[0133][0134]
结果表明：试验方法的回收率良好。
[0135]
9、专属性：
[0136]
供试品溶液制备：取琥珀安神丸(批号：20201101)约2g，精密称定，按“稳定性”项下供试品溶液制备方法处理，即得。
[0137]
对照品溶液制备：精密吸取稳定性项下对照品贮备液1ml置10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
[0138]
五味子药材溶液制备：取五味子药材0.1g，精密称定，按“稳定性”项下供试品溶液制备方法制备，即得。
[0139]
阴性供试品溶液制备：取去除五味子水蜜丸作为阴性样品，取约2g，精密称定，按“稳定性”项下供试品溶液制备方法制备，即得。
[0140]
分别精密吸取五味子药材溶液、阴性供试品溶液、供试品溶液、对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，色谱条件如上所述，并记录色谱图。
[0141]
结果：五味子醇甲可有效检出，且除去五味子的阴性供试品无干扰(图2
‑
图5)。
[0142]
10、样品含量测定：取3批琥珀安神丸(水蜜丸)样品，按上述方法测定五味子醇甲含量，测定结果见表10。
[0143]
表10琥珀安神丸样品中五味子醇甲含量测定结果表
[0144][0145][0146]
本品3批样品以高效液相法五味子醇甲的平均含量为0.22mg/g。
[0147]
根据上述试验结果，考虑药材来源，以及制剂生产、贮藏等因素，故暂定本品每克含五味子以五味子醇甲(c
11
h6o3)计，不得少于0.18mg。
[0148]
实施例2琥珀安神丸(水蜜丸)中五味子、甘草、酸枣仁显微鉴别
[0149]
取琥珀安神丸(水蜜丸)适量，以水合氯醛制片，置显微镜下观察制剂中各药物的性状，其中五味子、甘草、酸枣仁在显微镜下的形状较为突出。
[0150]
1)五味子显微镜下形状：种皮表皮石细胞，淡黄棕色表面观类多角形，壁较厚，孔沟细密，胞腔内含暗棕色物，如图7所示。
[0151]
2)甘草显微镜下形状：纤维束周围薄壁细胞含草酸钙方晶，形成晶纤维，如图8所示。
[0152]
3)酸枣仁显微镜下形状：种皮栅状细胞棕红色，表面观多角形，直径约15μm，壁厚，木化，胞腔小。侧面观，细胞一列，呈长方形，长60～80μm，如图9所示。
[0153]
结果：图7～9为琥珀安神丸(水蜜丸)中五味子、甘草、酸枣仁显微鉴别图，结果表明显微鉴别方法简便，专属性强，阴性无干扰，显微特征突出，可以作为琥珀安神丸(水蜜丸)中的质量控制指标。
[0154]
实施例3琥珀安神丸(水蜜丸)中当归鉴别
[0155]
1)供试品溶液的制备：取琥珀安神丸(水蜜丸)10g，研细，加乙酸乙酯50ml，超声处理15分钟，滤过，滤液挥干，残渣加乙酸乙酯lml使溶解，作为供试品溶液。
[0156]
2)阴性供试品溶液的制备：将琥珀安神丸中的当归去掉，作为阴性供试品。取阴性供试品10g，按照上述方法制成阴性供试品溶液。
[0157]
3)对照品溶液的制备：取当归对照药材0.5g，研细，加乙酸乙酯10ml，超声处理15分钟，滤过，滤液挥干，残渣加乙酸乙酯lml使溶解，作为对照品溶液。
[0158]
4)点样、展开：照薄层色谱法(中国药典2020年版通则0502)试验，吸取上述3种溶液各10μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以正己烷
‑
乙酸乙酯(体积比4∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，在紫外光(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，在阴性供试品色谱相应的位置上，不显示相同颜色的荧光斑点(图10)，专属性强。
[0159]
实施例4琥珀安神丸(水蜜丸)中五味子鉴别
[0160]
1)供试品溶液的制备：取琥珀安神丸(水蜜丸)10g，研细，加三氯甲烷100ml，加热回流30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加三氯甲烷lml使溶解，作为供试品溶液；
[0161]
2)阴性供试品溶液的制备：将琥珀安神丸中的五味子去掉，作为阴性供试品。取阴性供试品10g，按照上述方法制成阴性供试品溶液。
[0162]
3)对照品溶液的制备：取五味子对照药材lg，研细，加三氯甲烷100ml，加热回流30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加三氯甲烷lml使溶解，作为对照品溶液；
[0163]
4)点样、展开：照薄层色谱法(中国药典2020年版通则0502)试验，吸取上述3种溶液各2μl，分别点于同一硅胶gf
254
薄层板上，以石油醚(沸程30～60℃)
‑
甲酸乙酯
‑
甲酸(体积比15∶5∶1)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，在阴性供试品色谱相应的位置上，不显示相同颜色的荧光斑点(图11)，专属性强。
[0164]
实施例5琥珀安神丸(水蜜丸)中人参鉴别
[0165]
1)供试品溶液的制备：取琥珀安神丸(水蜜丸)20g，研细，加三氯甲烷100ml，加热回流1小时，弃去三氯甲烷液，药渣挥干溶剂，加水2ml搅拌湿润，加水饱和正丁醇50ml，超声处理30分钟，吸取上清液加3倍量氨试液，摇匀，放置分层，取上层液蒸干，残渣加甲醇lml使溶解，作为供试品溶液；
[0166]
2)阴性供试品溶液的制备：将琥珀安神丸中的人参去掉，作为阴性供试品。取阴性供试品20g，按照上述方法制成阴性供试品溶液。
[0167]
3)对照品溶液的制备：另取人参对照药材0.5g，研细，加三氯甲烷100ml，加热回流1小时，弃去三氯甲烷液，药渣挥干溶剂，加水2ml搅拌湿润，加水饱和正丁醇50ml，超声处理30分钟，吸取上清液加3倍量氨试液，摇匀，放置分层，取上层液蒸干，残渣加甲醇lml使溶解，作为对照品溶液；
[0168]
4)点样、展开：照薄层色谱法(中国药典2020年版通则0502)试验，吸取上述3种溶液各10μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以三氯甲烷
‑
乙酸乙酯
‑
甲醇
‑
水(体积比15∶40∶22∶10)在10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10wt％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色淸晰，置日光下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，在阴性供试品色谱相应的位置上，不显示相同颜色的斑点(图12)，专属性强。
[0169]
实施例6琥珀安神丸(水蜜丸)中远志鉴别
[0170]
1)供试品溶液的制备：取琥珀安神丸(水蜜丸)20g，研细，加70wt％甲醇100ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；
[0171]
2)阴性供试品溶液的制备：将琥珀安神丸中的远志去掉，作为阴性供试品。取阴性供试品20g，按照上述方法制成阴性供试品溶液。
[0172]
3)对照品溶液的制备：另取远志对照药材0.5g，研细，加70wt％甲醇100ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为对照品溶液；
[0173]
4)点样、展开：照薄层色谱法(中国药典2020年版通则0502)试验，吸取上述3种溶液各10μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以三氯甲烷
‑
甲醇
‑
水(体积比7∶3∶1)的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，在阴性供试品色谱相应的位置上，不显示相同颜色的荧光斑点(图13)，专属性强。
[0174]
实施例7琥珀安神丸(水蜜丸)中甘草鉴别
[0175]
1)供试品溶液的制备：取琥珀安神丸(水蜜丸)20g，研细，加乙醚100ml，加热回流1小时，滤过，弃去醚液，药渣加甲醇50ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水40ml使溶解，用正丁醇提取3次，每次20ml，合并正丁醇液，用水洗涤3次，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。
[0176]
2)阴性供试品溶液的制备：将琥珀安神丸中的甘草去掉，作为阴性供试品。取阴性供试品20g，按照上述方法制成阴性供试品溶液。
[0177]
3)对照品溶液的制备：取甘草对照药材0.5g，研细，加乙醚100ml，加热回流1小时，滤过，弃去醚液，药渣加甲醇50ml，加热回流1小时，滤过，滤液蒸干，残渣加水40ml使溶解，用正丁醇提取3次，每次20ml，合并正丁醇液，用水洗涤3次，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为对照品溶液。
[0178]
4)点样、展开：照薄层色谱法(中国药典2020年版通则0502)试验，吸取上述3种溶液各10μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以三氯甲烷
‑
甲醇
‑
水(体积比13∶7∶2)在10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10wt％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，在阴性供试品色谱相应的位置上，不显示相同颜色的斑点(图14)，专属性强。
[0179]
实施例8琥珀安神丸(水蜜丸)中地黄鉴别
[0180]
参考《中国药典》2020年版一部地黄药材中鉴别项(3)，以中国食品药品检定研究院提供的地黄对照药材(121225
‑
201003)作为对照，以去除地黄一味原料药的水蜜丸作为阴性供试品。取琥珀安神丸(水蜜丸)7g，剪碎，加80wt％甲醇60ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水5ml使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次10ml，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取缺地黄的阴性供试品7g，同法制成阴性供试品溶液。再取地黄对照药材，同法制成对照药材溶液。
[0181]
照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取上述三种溶液5μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以乙酸乙酯
‑
甲醇
‑
甲酸(体积比16∶0.5∶2)为展开剂，展开，取出，晾干，用0.1wt％的2，2
‑
二苯基
‑1‑
苦肼基无水乙醇溶液浸板，晾干。结果在供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，但除去地黄的阴性对照有干扰(图15)，专属性不强，不宜将此项列入质量控制标准中。
[0182]
实施例9琥珀安神丸(水蜜丸)中酸枣仁鉴别
[0183]
参考《中国药典》2020年版一部“酸枣仁”药材鉴别(3)，以中国食品药品检定研究院提供的酸枣仁对照药材(121225
‑
201003)作为对照，以去除酸枣仁一味原料药的水蜜丸作为阴性供试品。取琥珀安神丸(水蜜丸)30g，剪碎，加石油醚(沸程60
‑
90℃)100ml，加热回流2小时，滤过，弃去石油醚液，药渣挥干，加甲醇60ml，加热回流1小时。滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取缺酸枣仁的阴性供试品30g，同法制成阴性供试品溶液。再取酸枣仁对照药材0.5g，同法制成对照药材溶液。
[0184]
吸取上述三种溶液各10μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以水饱和的正丁醇为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1wt％香草醛硫酸溶液，置紫外光灯(365nm)下检视。结果在与对照药材色谱相应的位置上，未显相同颜色的斑点(图16)，这说明酸枣仁薄层色谱鉴别专属性不强，不宜将此项列入质量控制标准中。
[0185]
实施例10琥珀安神丸(水蜜丸)中麦冬鉴别
[0186]
参考《中国药典》2020年版一部“麦冬”药材鉴别，以中国食品药品检定研究院提供的麦冬对照药材(121225
‑
201003)作为对照，以去除麦冬一味原料药的水蜜丸作为阴性供试品。取琥珀安神丸(水蜜丸)30g，剪碎，加三氯甲烷
‑
甲醇(体积比7∶3)混合溶液100ml，浸泡3小时，超声处理30分钟，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加三氯甲烷0.5ml使溶解，作为供试品溶液。另取缺麦冬的阴性供试品30g，同法制成阴性供试品溶液。再取麦冬对照药材2g，同法制成对照药材溶液。
[0187]
吸取上述三种溶液各10μl，分别点于同一硅胶gf
254
薄层板上，以甲苯
‑
甲醇
‑
冰醋酸(体积比80∶5∶0.1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视。结果在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，但除去麦冬的阴性对照有干扰(图17)，专属性不强，故不宜将此项列入质量控制标准中。
[0188]
实施例11琥珀安神丸(水蜜丸)中茯苓鉴别
[0189]
参考《中国药典》2020年版一部“茯苓”药材鉴别(3)，以中国食品药品检定研究院提供的茯苓对照药材(121225
‑
201003)作为对照，以去除茯苓一味原料药的水蜜丸作为阴性供试品。取琥珀安神丸(水蜜丸)30g，剪碎，加乙醚100ml，超声处理10分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取缺茯苓的阴性供试品30g，同法制成阴性供试品溶液，再取茯苓对照药材0.5g，同法制成对照药材溶液。
[0190]
吸取上述三种溶液各10μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以甲苯
‑
乙酸乙酯
‑
甲酸(体积比20∶5∶0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2wt％香草醛硫酸溶液
‑
乙醇(体积比4∶1)混合溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。结果在与对照药材色谱相应的位置，未显相同颜色的斑点(图18)，故不宜将此项列入质量控制标准中。
[0191]
实施例12琥珀安神丸(水蜜丸)中丹参鉴别
[0192]
参考《中国药典》2020年版一部“丹参”药材鉴别，以中国食品药品检定研究院提供的丹参对照药材(121225
‑
201003)作为对照，以去除丹参一味原料药的水蜜丸作为阴性供试品。取琥珀安神丸(水蜜丸)30g，剪碎，加乙醚60ml，超声处理15分钟，滤过，滤液挥干，残渣加乙酸乙酯lml使溶解，作为供试品溶液。另取缺丹参的阴性供试品30g，同法制成阴性供试品溶液。再取丹参对照药材0.5g，同法制成对照药材溶液。
[0193]
吸取上述三种溶液各10μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以正己烷
‑
乙酸乙酯(体积比4∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。结果供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，但除去丹参的阴性对照有干扰(图19)，专属性不强，故不宜将此项列入质量控制标准中。
[0194]
实施例13琥珀安神丸(水蜜丸)中桔梗鉴别
[0195]
参考《中国药典》2020年版一部“桔梗”药材鉴别(3)，以中国食品药品检定研究院提供的桔梗对照药材(121225
‑
201003)作为对照，以去除桔梗一味原料药的水蜜丸作为阴性供试品。取琥珀安神丸(水蜜丸)30g，加7wt％硫酸乙醇
‑
水(体积比1∶3)混合溶液100ml，加热回流3小时，放冷，用三氯甲烷振摇提取2次，每次20ml，合并三氯甲烷液，加水洗涤2次，每次30ml，弃去洗液，三氯甲烷液用无水硫酸钠脱水，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取缺桔梗的阴性供试品30g，同法制成阴性供试品溶液。再取桔梗对照药材1g，同法制成对照药材溶液。
[0196]
吸取上述三种溶液各10μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以三氯甲烷
‑
乙醚(体积比2∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10wt％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。结果供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置，未显相同颜色的斑点(图20)，方法不可行，故不宜将此项列入质量控制标准中。
[0197]
实施例14琥珀安神丸(水蜜丸)中玄参鉴别
[0198]
参考《中国药典》2020年版一部“玄参”药材鉴别(2)，以中国食品药品检定研究院提供的玄参对照药材(121225
‑
201003)作为对照，以去除玄参一味原料药的水蜜丸作为阴性供试品。取琥珀安神丸(水蜜丸)30g，加甲醇100ml，浸泡1小时，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加水25ml使溶解，用水饱和正丁醇振摇提取2次，每次30ml，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液，另取缺玄参的阴性供试品30g，同法制成阴性供试品溶液。再取玄参对照药材1g，同法制成对照药材溶液。
[0199]
吸取上述三种溶液各10μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以三氯甲烷
‑
甲醇
‑
水(体积比12∶4∶1)的下层溶液为展开剂，置用展开剂预饱和15分钟的展开缸内，展开，取出，晾干，喷以5wt％香草醛硫酸溶液，热风吹至斑点显色清晰。结果在与对照药材色谱相应的位置，未显相同颜色的斑点(图21)，方法不可行，故不宜将此项列入质量控制标准中。
[0200]
以上所述仅为本发明的优选实施例，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理及构思的前提下，还可以做出若干修饰和改进，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。