液相色谱中双重梯度系统及其配套的洗脱程序设置方法与流程

本发明涉及仪器分析领域，特别是涉及一种液相色谱中双重梯度系统及其配套的洗脱程序设置方法。

背景技术：

反相液相色谱适用于中低极性化合物的分离。在分离过程中，化合物受色谱柱键合相的结合力和流动相洗脱力的双重作用。当整个分离过程中，如果化合物的极性较适中，流动相对其的洗脱力强于它与键合相的结合力时，目标物将会被流动相逐渐向前推动，最终被流动相冲洗出色谱柱而出峰。

但是，如果化合物极性非常低(即强保留化合物)，则其与反相键合相的结合力将非常强，普通的反相流动相，如乙腈和甲醇的洗脱能力不足以将这些化合物从键合相中洗脱出来，最终表现则是这些超低极性化合物不出峰。实际样品中所涵盖的化合物极性范围一般较广，特别是用液液萃取法提取的溶解在非极性溶剂里的样品。色谱柱用久了柱效下降的其中一个原因就是这些超低极性化合物与键合相牢牢结合无法被洗脱置换，相当于有效键合位点慢慢变少，柱效肯定就下降了。

技术实现要素：

基于此，为了提高分离柱中宽极性化合物的分离能力，也为了能把分离柱中超低极性化合物清洗出来，本发明提供了一种液相色谱中双重梯度系统及其配套的洗脱程序设置方法。

本发明采取的技术方案如下：

一种液相色谱中双重梯度系统，其特征在于：包括依序连接的液相组合泵、混合器、进样装置、分离柱和检测器；所述液相组合泵可向所述混合器抽送至少三种溶剂作为流动相，所述三种溶剂分别为弱溶剂、强溶剂a和强溶剂b，所述弱溶剂、强溶剂a和强溶剂b对于分离目标物的洗脱能力依序增强；所述液相组合泵通过调节所抽送溶剂之间的比例，形成流动相的第一洗脱梯度和第二洗脱梯度，所述第一洗脱梯度为所述弱溶剂与所述强溶剂a和强溶剂b之和的比例，所述第二洗脱梯度为所述强溶剂a与强溶剂b的比例。

在分析分离过程中，所述液相组合泵抽送的各种溶剂通过混合器进行溶剂混合，再进入进样装置引入样品，然后推送样品进入分离柱进行分离，最后从分离柱中洗脱流出进入检测器得到信号。

本发明的双重梯度系统，利用液相组合泵独立抽送洗脱能力不同的弱溶剂、强溶剂a和强溶剂b(超强洗脱能力的溶剂)，从而在分析分离过程中可以设置双重洗脱梯度，第一洗脱梯度为弱溶剂与强溶剂a+b，第二洗脱梯度为强溶剂a与强溶剂b。

由此，采用本发明的双重梯度系统，配合特定的洗脱程序设置，包括每个溶剂的流速、比例变化及对应时间节点等，能够实现一次进样分析从弱极性到超强极性目标物质的洗脱分离，整个分析过程可以自动化控制，有效对宽极性跨度目标物进行分析检测。

具体来说，在分析初始阶段，先以弱洗脱能力的弱溶剂为主体，强洗脱能力的强溶剂a或a+b占少数比例，把样品中的弱保留化合物洗脱出来，再逐渐提高强溶剂的比例，并慢慢把强洗脱能力的强溶剂a置换成超强洗脱能力的强溶剂b，最终变成了超强洗脱溶剂占绝对大比例，提高了整体流动相的洗脱能力，并把超强保留的化合物洗脱出来。

进一步地，所述液相组合泵为内置梯度比例阀的单个泵；或者，所述液相组合泵由两个泵组成，其中一个泵内置有梯度比例阀；或者，所述液相组合泵由三个泵组成。

进一步地，所述进样装置为自动进样器或定量环。

进一步地，所述分离柱为颗粒填料色谱柱、整体柱、固相萃取柱或薄层色谱板。

进一步地，所述弱溶剂为水，所述强溶剂a为乙腈或甲醇，所述强溶剂b为异丙醇、二氯甲烷、四氢呋喃或正己烷。

本发明还提供上述液相色谱中双重梯度系统的配套的洗脱程序设置方法，该方法是按照第一洗脱梯度和第二洗脱梯度来设置流动相；第一洗脱梯度中弱溶剂的初始比例大于强溶剂a与强溶剂b的初始比例之和，第二洗脱梯度中强溶剂a的初始比例大于强溶剂b的初始比例；然后，第一洗脱梯度中强溶剂a与强溶剂b的比例之和逐渐提高将弱溶剂置换，第二洗脱梯度中强溶剂b的比例逐渐提高最后将强溶剂a置换。进一步地，设置梯度洗脱程序如下：

初始节点：第一洗脱梯度中弱溶剂的初始比例为90％，强溶剂a和强溶剂b的初始比例之和为10％；所述第二洗脱梯度中强溶剂a和强溶剂b的初始比例分别为100％和0；

中间阶段：第一洗脱梯度中弱溶剂的比例逐渐降低至10％，强溶剂a和强溶剂b的比例之和逐渐提高至90％；第二洗脱梯度中强溶剂a的比例逐渐降低至20％，强溶剂b的比例逐渐提高至80％；

最后阶段：第一洗脱梯度中弱溶剂的比例变为0，强溶剂a和强溶剂b的比例之和变为100％，第二洗脱梯度中强溶剂a和强溶剂b的比例分别变为0和100％，即流动相变为强溶剂b。

进一步地，所述中间阶段的持续时间为20分钟。

进一步地，所述最后阶段的持续时间为5分钟。

进一步地，所述液相组合泵抽送溶剂的总流速设置为0.4ml/min。

相对于现有技术，本发明所述液相色谱中双重梯度系统及其配套的洗脱程序设置方法具有以下有益效果：

(1)流动相强度变化范围广，能一次性分析弱保留、强保留和超强保留的化合物，提高峰容量；

(2)超强流动相可以把平时分离柱中与分离柱键合相结合非常牢固的超强保留化合物洗脱出来，起到分离柱清洗和再生的目的，提高分离柱的使用寿命；

(3)对硬件要求低，软件设置简单，大部分商品化色谱系统均可实现，不同填料和键合相的各种色谱柱均适用；

(4)可扩展性强，可应用到任何具有强弱流动相之分的色谱体系。

(5)除可用于分析宽极性化合物的分离，还可以利用该方法对强弱保留的两类物质进行分离，起到在线前处理的作用。

为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。

附图说明

图1为本发明的液相色谱中双重梯度系统所需硬件组合及其流路联接图；附图标记的对应关系为：1-强溶剂a；2-强溶剂b；3-弱溶剂；4-混合器；5-进样装置；6-分离柱；7-检测器。

图2为本发明系统的强弱流动相及其比例、时间节点设置的示意图。

图3为实施例1中未使用双重洗脱梯度的强弱流动相及其比例、时间节点设置的示意图。

图4为实施例1中使用双重洗脱梯度的强弱流动相及其比例、时间节点设置的示意图。

图5为实施例1中未使用双重洗脱梯度的分离色谱图。

图6为实施例1中使用了双重洗脱梯度的分离色谱图。

图7为实施例2中未使用双重洗脱梯度的分离色谱图。

图8为实施例2中使用了双重洗脱梯度的分离色谱图。

图9为实施例3中未使用双重洗脱梯度的分离色谱图。

图10为实施例3中使用了双重洗脱梯度的分离色谱图。

具体实施方式

请参阅图1-2，本发明的液相色谱中双重梯度系统，包括依序连接的液相组合泵、混合器、用于进样的进样装置、分离柱和检测器。

所述液相组合泵可向所述混合器独立抽送至少三种溶剂作为流动相，所述三种溶剂分别为弱溶剂、强溶剂a和强溶剂b，所述弱溶剂、强溶剂a和强溶剂b对于分离目标物的洗脱能力依序增强，即弱溶剂的洗脱能力＜强溶剂a＜强溶剂b。

所述液相组合泵抽送溶剂后通过混合器混合各种溶剂后，依次流经进样装置、分离柱，最后进入检测器中。

如图2所示，所述液相组合泵通过调节所抽送溶剂之间的比例，形成流动相的第一洗脱梯度和第二洗脱梯度，所述第一洗脱梯度为所述弱溶剂与所述强溶剂a和强溶剂b之和的比例(即该洗脱梯度按照<弱溶剂占流动相的比例+强溶剂a与强溶剂b占流动相的比例之和＝100％>来设置)，所述第二洗脱梯度为所述强溶剂a与强溶剂b的比例(即该洗脱梯度按照<强溶剂a占强溶剂a与强溶剂b之和的比例+强溶剂b占强溶剂a与强溶剂b之和的比例＝100％>来设置)。

具体地，所述液相组合泵有多种实现方式，如可以为单个泵，且内置有梯度比例阀，由该梯度比例阀分流抽送三种以上溶剂。或者，所述液相组合泵也可以为两个泵，一个泵直接抽送弱溶剂，另一个泵内置有梯度比例阀，分流抽送强溶剂a和强溶剂b。或者，所述液相组合泵还可以为三个泵，分别抽送弱溶剂、强溶剂a和强溶剂b。

所述进样装置可以为自动进样器或其他样品导入装置，如连接于配置在系统的切换阀内的定量环。

所述分离柱可以为颗粒填料色谱柱、整体柱、固相萃取柱或薄层色谱板等等具有分离功能的材料。

所述弱溶剂为水，所述强溶剂a为乙腈或甲醇，所述强溶剂b为异丙醇、二氯甲烷、四氢呋喃或正己烷等超强溶剂。

所述液相色谱中双重梯度系统的配套的洗脱程序设置方法，是按照第一洗脱梯度和第二洗脱梯度来设置流动相。具体地，第一洗脱梯度中弱溶剂的初始比例大于强溶剂a与强溶剂b的初始比例之和，第二洗脱梯度中强溶剂a的初始比例大于强溶剂b的初始比例；然后，第一洗脱梯度中强溶剂a与强溶剂b的比例之和逐渐提高将弱溶剂置换，第二洗脱梯度中强溶剂b的比例逐渐提高最后将强溶剂a置换。

图2为强弱流动相及其比例、时间节点设置的示意图，图中弱溶剂和两种强溶剂之间的梯度曲线，表示第一洗脱梯度，显示强、弱溶剂的比例在不同时间节点的变化；强溶剂a和强溶剂b之间的曲线，为第二洗脱梯度，显示强溶剂a和强溶剂b(即超强溶剂)的比例在不同时间节点的变化。

具体地，本发明设置梯度洗脱程序如下：

初始节点：第一洗脱梯度中弱溶剂的初始比例为90％，强溶剂a和强溶剂b的初始比例之和为10％；所述第二洗脱梯度中强溶剂a和强溶剂b的初始比例分别为100％和0；

中间阶段：第一洗脱梯度中弱溶剂的比例逐渐降低至10％，强溶剂a和强溶剂b的比例之和逐渐提高至90％；第二洗脱梯度中强溶剂a的比例逐渐降低至20％，强溶剂b的比例逐渐提高至80％；

最后阶段：第一洗脱梯度中弱溶剂的比例变为0，强溶剂a和强溶剂b的比例之和变为100％，第二洗脱梯度中强溶剂a和强溶剂b的比例分别变为0和100％，即流动相变为强溶剂b。

最后阶段之后恢复初始节点的流动相状态，以准备下一次的进样分析。

实施例1

本实施例的双重梯度系统中，所述液相组合泵使用了两个泵，一个泵直接抽送弱溶剂水，另一个泵内置梯度比例阀，分别抽送强溶剂a乙腈和强溶剂b异丙醇，其中异丙醇的洗脱能力远高于乙腈；所述分离柱为岛津的c18柱。

作为对比，本实施例利用所述系统，采取普通模式和双重梯度模式分别对同一组目标物进行分离。所述普通模式未使用双重洗脱梯度，采取的弱洗脱溶剂为水，强溶剂为乙腈；所述双重梯度模式使用双重洗脱梯度，除了采取弱洗脱溶剂水和强溶剂乙腈，还增加了超强洗脱溶剂异丙醇。

未使用双重洗脱梯度的普通模式的梯度洗脱程序如下：如图3所示，所述液相组合泵抽送溶剂的总流速为0.4ml/min，水和乙腈的初始比例分别为90％和10％，20min后水和有机相(乙腈)的比例变为10％和90％并持续5min，25.01min又恢复为初始比例90％和10％直到分析结束。

使用双重洗脱梯度的双重梯度模式的梯度洗脱程序如下：如图4所示，所述液相组合泵抽送溶剂的总流速为0.4ml/min。在初始节点，第一洗脱梯度中水和乙腈(有机相)的初始比例分别为90％和10％，第二洗脱梯度中乙腈和异丙醇的初始比例分别为100％和0。在中间阶段，第一洗脱梯度中，水的比例逐渐降低，并在第20min时降至10％，而乙腈和异丙醇(有机相)的比例之和逐渐提高，并在第20min时提高至90％；第二洗脱梯度中，乙腈的比例逐渐降低，并在第20min时降至20％，而异丙醇的比例逐渐提高，并在第20min时提高至80％。在最后阶段，第20.01min时，第一洗脱梯度中，水的比例变为0，异丙醇(有机相)变为100％，第二洗脱梯度中乙腈和异丙醇的比例分别变为0和100％，即流动相为强溶剂b，此状态维持5min。到第25.01min恢复为初始状态：第一洗脱梯度中水和乙腈(有机相)的初始比例分别为90％和10％，第二洗脱梯度中乙腈和异丙醇的初始比例分别为100％和0。

本实施例1中的分离目标物为19个脂类物质，logp范围介于2.84～26.86，采取普通模式只能洗脱logp范围2.84～11.94共14个目标物，色谱图见图5；而采取了双重梯度模式之后，18个目标物均能洗脱分离，相比普通模式，成功洗脱出了logp＝13.87～20.49四个目标物，色谱图见图6及图中虚线所框选的出峰。

实施例2

本实施例的双重梯度系统中，所述液相组合泵使用了两个泵，一个泵直接抽送弱溶剂水，另一个泵内置梯度比例阀，分别抽送强溶剂a乙腈和强溶剂b异丙醇，其中异丙醇的洗脱能力远高于乙腈；所述分离柱为waters的t3柱。

作为对比，本实施例利用所述系统，采取普通模式和双重梯度模式分别对同一组目标物进行分离。所述普通模式未使用双重洗脱梯度，采取的弱洗脱溶剂为水，强溶剂为乙腈；所述双重梯度模式使用双重洗脱梯度，除了采取弱洗脱溶剂水和强溶剂乙腈，还增加了超强洗脱溶剂异丙醇。

本实施例的普通模式的梯度洗脱程序和条件对应与实施例1的相同，本实施例的双重梯度模式的梯度洗脱程序和条件也对应与实施例1的相同。

本实施例中的分离目标物为19个脂类物质，logp范围介于2.84～26.86，采取普通模式只能洗脱logp范围2.84～10.88共13个目标物，色谱图见图7；而采取了双重梯度模式之后，剔除峰型不好的化合物，有15个化合物能洗脱分离，相比普通模式，成功洗脱出了logp＝11.94～13.87两个化合物，色谱图见图8及图中虚线所框选的出峰。

实施例3

本实施例的双重梯度系统中，所述液相组合泵使用了两个泵，一个泵直接抽送弱溶剂水，另一个泵内置梯度比例阀，分别抽送强溶剂a乙腈和强溶剂b异丙醇，其中异丙醇的洗脱能力远高于乙腈；所述分离柱为岛津的c18柱。

作为对比，本实施例利用所述系统，采取普通模式和双重梯度模式分别对同一组目标物进行分离。所述普通模式未使用双重洗脱梯度，采取的弱洗脱溶剂为水，强溶剂为乙腈；所述双重梯度模式使用双重洗脱梯度，除了采取弱洗脱溶剂水和强溶剂乙腈，还增加了超强洗脱溶剂异丙醇。

本实施例的普通模式的梯度洗脱程序和条件对应与实施例1的相同，本实施例的双重梯度模式的梯度洗脱程序和条件也对应与实施例1的相同。

本实施例中的分离目标物为19个脂类物质，logp范围介于2.84～26.86，采取普通模式只能洗脱logp范围2.84～13.67共15个目标物，色谱图见图9；采取了双重梯度模式之后，所有19个化合物均能洗脱分离，相比普通模式，成功洗脱出了logp＝18.14～26.86四个化合物，色谱图见图10及图中虚线所框选的出峰。

本发明的双重梯度系统及其配套的洗脱程序设置方法，实现了一次进样分析从弱极性到超强极性目标物质的洗脱分离，整个分析过程自动化控制，可有效应用于宽极性跨度目标物的分析检测。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。