一种同时检测氧化三甲胺和苯乙酰谷氨酰胺的方法及其检测试剂盒和应用

本发明涉及分析检测
技术领域：
：，具体涉及一种同时检测氧化三甲胺和苯乙酰谷氨酰胺的方法及其检测试剂盒和应用。
背景技术：
：：氧化三甲胺(trimethylamine-n-oxide,tmao)和苯乙酰谷氨酰胺(phenylacetylglutamine,pagln)是肠道微生物的代谢产物，tmao是由肠道微生物分解营养素产生的三甲胺在肝脏黄素单加氧酶催化下氧化生成的代谢物，pagln是肠道中未被吸收的苯丙氨酸经微生物代谢成为苯乙酸后在肝脏中代谢生成的产物。目前仅有对血液或尿液中tmao测定的质谱方法(wangz,etal,measurementoftrimethylamine-n-oxidebystableisotopedilutionliquidchromatographytandemmassspectrometry,analbiochem,2014,455:35-40；qiuw,etal,afasterandsimpleruplc-ms/msmethodforthesimultaneousdeterminationoftrimethylaminen-oxide,trimethylamineanddimethylamineindifferenttypesofbiologicalsamples,foodfunct,2019,10,6484-6491)，或者对血液及尿液中pagln测定的质谱方法(laryeamd,etal,simultaneouslc-ms/msdeterminationofphenylbutyrate,phenylacetatebenzoateandtheircorrespondingmetabolitesphenylacetylglutamineandhippurateinbloodandurine.jinheritmetabdis.2010dec；33suppl3:s321-8.)，但尚没有将tmao和pagln同时检测的方法。而这两种指标均为肠道微生物群代谢产物，同时测定具有减少样品用量、经济快捷、减少工作量以及成本等优势。技术实现要素：本发明的目的是提供一种同时检测氧化三甲胺和苯乙酰谷氨酰胺的方法，该方法能够实现氧化三甲胺和苯乙酰谷氨酰的同时有效检测。本发明的另一目的是提供基于该方法的检测试剂盒及其应用。具体地，本发明提供以下技术方案：第一方面，本发明提供一种同时检测氧化三甲胺和苯乙酰谷氨酰胺的方法，其为：将待测样品进行样品前处理，再采用液相色谱串联质谱法进行检测，其中，所述样品前处理包括：将所述待测样品采用沉淀剂进行沉淀处理，获得分离的上清液，所述沉淀剂为含有10-100mm乙酸铵的乙腈和甲醇混合溶液。优选地，所述沉淀剂中，乙腈和甲醇的体积比为(80-90)：(10-20)。进一步优选地，所述沉淀剂中乙酸铵的浓度为10-30mm。本发明针对氧化三甲胺和苯乙酰谷氨酰胺开发同时进行两种物质检测的液相色谱串联质谱检测方法，在研发过程中发现，对于复杂样本(血清、尿液)，氧化三甲胺和苯乙酰谷氨酰胺检测的基质效应较为明显，而采用现有技术中单独检测氧化三甲胺、苯乙酰谷氨酰胺的液相色谱串联质谱法很难在联合检测时同时对两种物质均保证较低的基质效应及良好的峰形。经不断尝试，本发明发现，采用含有一定浓度的乙酸铵的乙腈和甲醇混合溶液对样品进行沉淀处理，能够增加血清、尿液中干扰物质的沉淀效率，同时充分释放其中的三甲胺和苯乙酰谷氨酰胺，显著降低氧化三甲胺和苯乙酰谷氨酰胺同时检测时的基质效应，同时保证两者峰形良好，提高检测的精密度和准确度。优选地，所述沉淀剂的用量为使得沉淀处理体系中，乙酸铵的浓度为10-20mm，甲醇和乙腈的体积百分含量分别为50-60％和5-15％。以上所述的沉淀处理具体为：与沉淀剂混合后振荡处理。以上所述的分离上清液的方法包括但不限于离心(例如：13000rpm离心10min)等。在进行液相色谱分离前，可将所述上清液采用液相色谱分离的起始流动相进行稀释。为满足质谱检测的要求，在样品前处理过程中，在沉淀处理前，将所述待测样品与氧化三甲胺和苯乙酰谷氨酰胺的同位素内标混合。优选地，所述氧化三甲胺的同位素内标的浓度为0.001-0.01μg/ml，所述苯乙酰谷氨酰胺的同位素内标的浓度为0.1-5μg/ml。同位素内标的用量优选为样品体积的0.2-0.6倍。作为本发明的优选实施方式，所述样品前处理包括如下步骤：取20-100μl血清或者5-100倍稀释后的尿液或混合标准溶液，加入10～100μl同位素内标，混合震荡，加入10～200μl沉淀剂，混合震荡，13000rpm离心3～15min，取上清液50～200μl，加入50～400μl起始浓度流动相混合液。对于本发明所述的液相色谱串联质谱检测，其中，液相色谱的流动相包括流动相a和流动相b，所述流动相a为含有0.01-0.1％甲酸和1-10mm甲酸铵的水溶液，所述流动相b为乙腈，或者为含有1-10mm甲酸铵的乙腈或80-99％的乙腈水溶液。本发明发现，采用上述流动相能够同时保证氧化三甲胺和苯乙酰谷氨酰胺具有较好的峰形。优选地，所述流动相a为含有0.04-0.06％甲酸和4-6mm甲酸铵的水溶液，所述流动相b为含有4-6mm甲酸铵的90-99％的乙腈水溶液。优选地，所述流动相按照以下梯度进行梯度洗脱：0-0.5min，流动相a15％，0.5-1.4min，流动相a15-45％，1.4-3.5min，流动相a45％，3.5-4.0min，流动相a45-15％，4.0-5.0min，流动相a15％。本发明发现，采用上述流动相体系和洗脱程序能够显著提高氧化三甲胺和苯乙酰谷氨酰胺的分离效果，并提高检测的精密度。优选地，上述梯度洗脱过程中，流动相的流速为0.3-0.5ml/min。更优选为0.4ml/min。优选地，液相检测的柱温为35-40℃。优选地，进样量为1～10μl。本发明所述的检测方法中，质谱检测条件如下：多离子监测反应模式，正离子模式，电喷雾电离，离子源温度400～600℃，gs1为20～70psi，gs2为20～70psi，监测的离子对信息如下：tmao定量：m/z75.9→58.0，tmao定性：m/z75.9→59.1，tmao-d9：m/z85.1→68.2，pagln定量：m/z265.2→130.2，pagln定性：m/z265.2→84.1，pagln-d5：m/z270.2→147.3。上述质谱检测能够与本发明的液相色谱检测分离条件很好地配合作用，提高检测的精密度。本发明中，所述待测样品可为血液、尿液。本发明的检测方法可用于氧化三甲胺和苯乙酰谷氨酰胺的定性检测或定量检测。在进行定量检测时，利用不同浓度的标准品制作标准曲线，以标准溶液浓度为x轴，标准和内标峰面积的比值为y轴，进行线性回归分析，经“1/x”权重得回归方程。将样品中待测成分与其内标峰面积比代入标准曲线方程，计算样品中氧化三甲胺和苯乙酰谷氨酰胺浓度。本发明发现，采用本发明的检测方法进行检测，标准曲线的相关系数高，能够满足定量检测的要求。第二方面，本发明还提供一种氧化三甲胺和苯乙酰谷氨酰胺液相色谱串联质谱检测用样品前处理沉淀剂，该沉淀剂为含有10-100mm乙酸铵的乙腈和甲醇混合溶液，所述沉淀剂中，乙腈和甲醇的体积比为(80-90)：(10-20)。优选地，所述沉淀剂为含有20-50mm乙酸铵的乙腈和甲醇混合溶液，所述沉淀剂中，乙腈和甲醇的体积比为(80-90)：(10-20)。第三方面，本发明提供一种同时检测氧化三甲胺和苯乙酰谷氨酰胺的试剂盒，该试剂盒包括以下试剂：试剂i：含有10-100mm乙酸铵的乙腈和甲醇混合溶液，乙腈和甲醇的体积比为(80-90)：(10-20)，用于样品前处理；优选地，所述乙酸铵的浓度为20-50mm。试剂ii：含有0.01-0.1％甲酸和1-10mm甲酸铵的水溶液，用于作为液相色谱分离的流动相a；试剂iii：乙腈，或者为含有1-10mm甲酸铵的乙腈或80-99％的乙腈水溶液，用于作为液相色谱分离的流动相b。优选地，所述试剂盒还包括：试剂iv：氧化三甲胺和苯乙酰谷氨酰胺的同位素内标，其中，氧化三甲胺的同位素内标的浓度为0.001-0.01μg/ml，苯乙酰谷氨酰胺的同位素内标的浓度为0.1-5μg/ml；试剂v：氧化三甲胺和苯乙酰谷氨酰胺的标准品溶液。上述试剂盒在进行氧化三甲胺和苯乙酰谷氨酰胺检测时的使用方法如下：将待测样品与试剂iv混合后，再与试剂i混合，分离上清液，进行液相色谱串联质谱检测；液相色谱以试剂ii和试剂iii为流动相进行梯度洗脱，梯度洗脱方法如下：0-0.5min，流动相a15％，0.5-1.4min，流动相a15-45％，1.4-3.5min，流动相a45％，3.5-4.0min，流动相a45-15％，4.0-5.0min，流动相a15％，流动相的流速为0.3-0.5ml/min；质谱检测条件如下：多离子监测反应模式，正离子模式，电喷雾电离，离子源温度400～600℃，gs1为20～70psi，gs2为20～70psi，监测的离子对信息如下：tmao定量：m/z75.9→58.0，tmao定性：m/z75.9→59.1，tmao-d9：m/z85.1→68.2，pagln定量：m/z265.2→130.2，pagln定性：m/z265.2→84.1，pagln-d5：m/z270.2→147.3。第四方面，本发明提供所述沉淀剂或所述试剂盒在氧化三甲胺和苯乙酰谷氨酰胺检测中的应用。本发明的有益效果在于：本发明基于液相色谱串联质谱技术建立了同时测定氧化三甲胺(tmao)和苯乙酰谷氨酰胺(pagln)的方法，该方法留取样本简便，样品处理简单，用样量少，检测速度快，可减少因分别测定需要两次留样、费时、增加成本等问题，易于推广应用。该检测方法具有较高的精密度和较低的基质效应，能够显著提高氧化三甲胺和苯乙酰谷氨酰胺检测的准确性。附图说明图1为本发明实施例1中氧化三甲胺和苯乙酰谷氨酰胺的液相色谱图。图2为本发明实施例2中氧化三甲胺和苯乙酰谷氨酰胺的液相色谱图。图3为本发明对比例1中氧化三甲胺和苯乙酰谷氨酰胺的液相色谱图。图4为本发明实验例3中氧化三甲胺的标准曲线。图5为本发明实验例3中苯乙酰谷氨酰胺的标准曲线。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1本实施例提供一种同时检测氧化三甲胺和苯乙酰谷氨酰胺的方法，该方法采用液相色谱串联质谱法进行检测，具体如下：1、样品前处理取50μl血清或者20倍稀释后的尿液或混合标准溶液至2ml塑料管或玻璃管，加入20μl同位素内标，混合震荡，加入130μl沉淀剂，混合震荡，13000rpm离心10min取上清液100μl，加入200μl流动相起始浓度混合液，等待上机测试，进样体积：2μl。混合标准溶液：将tmao和pagln的标准品溶于蒸馏水配制成母液，将tmao的母液和pagln的母液混合、采用定容瓶准确定容，用乙腈进行一系列稀释使tmao和pagln的浓度为0.02,0.05,0.1,0.2,0.5,1,2,5,10μg/ml。混合同位素内标液：将tmao和pagln两种内标溶于0.1％甲酸乙腈溶液，使tmao-d9浓度0.008μg/ml,pagln-d5浓度为1μg/ml。沉淀剂：含有25mmol/l乙酸铵的乙腈甲醇(v:v＝85:15)溶液。2、液相色谱检测流动相：流动相a：含有0.05％甲酸和5mmol/l的甲酸铵水溶液。流动相b：含有5mmol/l甲酸铵的95％乙腈溶液。洗脱程序：梯度洗脱程序如表1所示。表1液相梯度液相色谱柱：-hiliccolumn(100×2.1mm，kinetex,phenomenex)，柱温40℃。3、质谱检测选择多离子监测反应模式，正离子模式，电喷雾电离，离子源温度550℃，gs1为65psi，gs2为60psi，具体监测的离子对以及碰撞能量(ce)、去簇电压(dp)等条件如表2所示。表2质谱检测条件参数利用上述方法进行血清样本中氧化三甲胺和苯乙酰谷氨酰胺同时检测的色谱图如图1所示。实施例2本实施例提供一种同时检测氧化三甲胺和苯乙酰谷氨酰胺的方法，该方法采用液相色谱串联质谱法进行检测，其与实施例1的区别仅在于沉淀剂中乙酸铵浓度为10mm，该条件下的液相色谱图见图2。对比例1本对比例提供一种同时检测氧化三甲胺和苯乙酰谷氨酰胺的方法，该方法采用液相色谱串联质谱法进行检测，其与实施例1的区别仅在于将流动相b中的乙腈更换为甲醇，该条件下的液相色谱图见图3，可见tmao峰有明显拖尾。实验例1检测的精密性评价采用实施例1的方法进行氧化三甲胺和苯乙酰谷氨酰胺的同时检测，对检测方法的精密性进行评价，具体方法如下：用实施例1的方法测定三份不同血清和稀释尿液中目标代谢物浓度，每份样品测定5次，每次设五个平行管，每次样品制备和测定均在不同工作日完成。计算平均批内及总不精密度(cv)。，评价结果如表3所示，结果表明，本发明的检测方法的精密性良好。表3精密性评价结果实验例2检测的基质效应评价采用实施例1的方法进行氧化三甲胺和苯乙酰谷氨酰胺的同时检测，对检测方法的基质效应进行评价，具体方法如下：取混合人血清样本或稀释尿液样本，经前处理后加入目标分析物的标准品至高、中、低三种浓度，每个浓度样本分3份。将该样本与相同浓度的以纯溶剂为基质的样本一同进样分析，然后比较其各自的响应值。血清样本或稀释尿液样本与溶剂样本响应值的差与溶剂样本响应值的比值即为该过程的基质效应。评价结果如表4所示，结果表明，本发明的检测方法的基质效应较低。表4基质效应评价结果实验例3定量检测的线性相关性分析分别配置浓度为0.02,0.05,0.1,0.2,0.5,1,2,5,10μg/ml的tmao和pagln标准品溶液。采用实施例1的检测方法进行检测，以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，进行线性回归处理，计算回归方程及相关系数。根据测定结果可知，tmao在0.02-10μg/ml范围内，回归方程为y＝0.46506x+0.0050，相关系数r＝0.99834(权重：1/x2)，线性关系良好(图4)。pagln在0.02-10μg/ml范围内，回归方程为y＝21.85087x+0.14627，相关系数r＝0.99866(权重:1/x2)，线性关系良好(图5)。实验例4检测方法的灵敏度评价利用tmao和pagln的标准品溶液检测实施例1的方法对tmao和pagln的检测限(lod)和定量限(loq)。结果如表5所示。表5线性定量限和检测限实验例5检测方法的回收率评价采用分别添加tmao和pagln的标准品的加标供试品溶液进行添加回收试验，共设置六个水平的加标供试品溶液。结果如表6所示。表6回收率虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。当前第1页12当前第1页12