一种用于氧化乐果检测的电化学发光适配体传感器构建的方法

本发明属于电化学分析检测领域，构建了一种用于蔬菜样品中氧化乐果检测的电化学发光适配体传感器。

背景技术：

有机磷农药(opps)是指在农业生产中广泛使用的含磷有机化合物农药，主要用作杀虫剂，少数用作除草剂、杀菌剂和植物生长调节剂。在控制农业病虫害和提高农产品质量产量方面发挥了积极作用。氧化乐果(omt)是有机磷农药的一种，因其广谱、高效、快速、价格低廉等优点，而被世界各国农民广泛应用。长期大量滥用氧化乐果，使得农药残留问题日益严重。有机磷农药的残留不仅污染生态环境，在农产品中的残留更是对人类健康和生命安全造成不同程度的危害。其毒性是基于对人体内乙酰胆碱酯酶的抑制，而乙酰胆碱酯酶对哺乳动物中枢神经系统的功能至关重要。大量摄入opps会出现一系列神经中毒症状，严重者会出现呼吸麻痹，甚至死亡。长期接触或通过饮食摄入低剂量的opps，会出现脏器损伤、致畸、致癌、致突变等。

现已有的检测omt的方法包括气相色谱-质谱联用法、酶抑制法以及高效液相色谱-质谱联用法等研究方法，虽然这些方法能够满足灵敏度与特异性检测的要求，但是在实际应用方面存在一定的局限性。例如，色谱法能够用于定性、定量检测，且检测结果相对准确、可靠，灵敏度高，重现性好，但是所用仪器设备昂贵，操作复杂，需要专业的技术人员，因而不适合大批量样品的处理和分析以及现场的快速检测。电化学发光(electrochemilurninescence，ecl)是通过电极表面施加电压或电流产生高效的电子转移，生成反应产物的激发态，由激发态返回基态时产生的发光现象。作为将化学发光现象和电化学技术相结合的一种新型分析检测手段，ecl耦合了两者的优点(如高灵敏度、低背景干扰、低检出限、良好的选择性和重现性等)，因此，被广泛的用在食品质量和安全、临床治疗、环境监测等领域。

技术实现要素：

本发明提供一种的电化学发光适配体传感器构建的方法，制备了一种富含缺陷的碲化钼/2-甲基咪唑锌盐(mote2/zif-8)电化学发光活性材料，以用来建立ecl传感平台，将其应用于农产品中氧化乐果omt的检测。本发明基于适配体特异性识别的特点，构建了一种快速、灵敏检测omt的ecl适配体传感器，建立omt浓度与ecl响应值之间的对应关系，实现简单、灵敏、快速检测omt的目的。因此，所制备的传感器可被用于检测蔬菜样品中的omt含量。

所采用的方案概括为：

采用室温合成法，将mote2颗粒引入zif-8，同时引起zif-8的配体缺失而导致缺陷。

以制备的富含缺陷的mote2/zif-8作为电化学发光活性材料，创建超灵敏的电化学发光传感平台。利用富含缺陷的mote2/zif-8纳米复合的催化性能和良好导电性等性质，对检测系统起到一个信号放大的作用，增加了检测的灵敏度。当溶液中加入目标物omt，mote2/zif-8纳米复合物受到电压的激发，产生高效的电子转移，生成反应产物的激发态，由激发态返回基态时产生的发光，omt适配体由于具有较大的阻抗，从而使得其ecl响应强度降低，加入omt与适配体结合之后引起适配体的有效脱离，使ecl信号得到恢复。建立ecl响应值与omt浓度之间的关系，以达到对大豆和菠菜样品中的omt含量快速、灵敏、有选择性的检测的目的。

本发明是通过如下具体技术方案实现的：

一种用于氧化乐果检测的电化学发光适配体传感器构建的方法，包括如下步骤：

步骤1、mote2量子点的制备：

将块状mote2经过液氮冷冻后，立即转入共溶剂中，在冰水裕的条件下进行超声破碎，离心后得到mote2量子点；

步骤2、mote2/zif-8的制备：

将制备的mote2量子点分散液与二甲基咪唑甲醇溶液充分混合，再加入硝酸锌甲醇溶液，在室温下静置反应，反应完毕，充分洗涤后真空离心干燥得到mote2/zif-8固体；

步骤3、玻碳电极gce的打磨清洗；

步骤4、用于检测检测氧化乐果ecl传感器的构建：

将复合物mote2/zif-8分散在萘酚naphthol磷酸盐缓冲液(pbs)中，得到naphthol/mote2/zif-8分散液，将所述分散液滴涂于打磨好的玻碳电极gce上；得到naphthol/mote2/zif-8修饰的gce电极，即naphthol/mote2/zif-8/gce；晾干后将omt适配体滴加在电极上，反应一段时间后，用pbs淋洗，最终得到适配体修饰的材料电极，即aptamer/naphthol/mote2/zif-8/gce，即得到了用于omt检测的ecl适配体传感器。步骤1中，mote2量子点制备步骤：是通过典型的冷冻破碎方法制备mote2量子点，60mg块状mote2置于在含有液氮的离心管中，静置冷冻若干小时，紧接着20ml叔丁醇/水作为共溶剂被加入上述溶液中形成混合溶液，立即转入细胞粉碎机中超声，最后将分散液用离心机13000rmp离心15-30分钟得到mote2分散液。

其中，作为共溶剂中，叔丁醇和水的体积比为1：1。

步骤2中，mote2量子点分散液、二甲基咪唑甲醇溶液和硝酸锌甲醇溶液的体积比为1：10：10，其中，mote2量子点分散液的浓度为1-10mg/l，二甲基咪唑甲醇溶液的浓度为10mm，硝酸锌甲醇溶液的浓度为10mm。

混合方式为超声混匀；室温下静置反应的时间为2-4小时，洗涤使用甲醇，真空干燥为60℃过夜干燥。

步骤3中，玻碳电极gce的打磨清洗步骤为：首先将φ＝3.0mm的玻碳电极gce，分别用1.0,0.3和0.05μm的al2o3抛光粉在抛光布上打磨成镜面，然后依次在超纯水、乙醇和超纯水中超声清洗,室温条件下用氮气吹干。

步骤4中，mote2/zif-8和萘酚naphthol磷酸盐缓冲液用量比例为2mg：1ml；其中，萘酚的质量百分浓度为0.5％；

分散液的滴涂量为6.0μl；

omt适配体的滴加量为6μl，其中，omtaptamer溶液的浓度为3×10^-6mol/l。

为了比较，分别使用类似步骤获得naphthol/mote2/gce和naphthol/zif-8/gce。

将本发明制备的ecl适配体传感器被成功构建并应用于大豆和菠菜样品中的omt的分析检测。

本发明的有益效果为：

(1)本发明制备mote2/zif-8纳米复合物作为ecl活性材料来构建ecl传感器，纳米复合物的ecl信号相对于单体大大增强。这可能是因为，通过mote2纳米颗粒的掺杂使zif-8产生了更多的缺陷，显著提高了其催化性能，提高了电子传输，降低了激发电压。

(2)本发明凭借mote2/zif-8优异的ecl性能以及特异性的aptamer，构建了omt适配体传感器。该传感器表现出更宽的线性范围(10^-10-10^-5g/l)和更低的检测限(3.33×10^-11g/l)。

(3)此外，构建的ecl适配体传感器用以检测大豆和菠菜样品中的omt，获得了令人满意的结果。这项工作不仅展示了富含缺陷型mote2/zif-8在ecl相关应用中的潜在吸引力，而且还为食品检测、生物医学和环境监测等领域构建了一种新颖ecl传感平台。

(4)与传统检测方法相比，本发明中所提出的omt的ecl检测方法具有操作更简便灵活，仪器设备更简单，试剂用量少，检测成本低廉等特点。

附图说明

图1为zif-8(a)和mote2/zif-8(b)的sem表征图；

图2为mote2/zif-8的光电子能谱图和高分辨光电子能谱图；

图3为适配体传感过程示意图(a)，适配体传感过程ecl信号变化图(b)和适配体传感过程阻抗信号变化图(c)

图4为(a)所构建的ecl适配体传感器检测不同浓度omt的光电流响应图，(b)相应的omt的检测线性曲线，(c)所构建的适配体ecl传感器28个循环周期下稳定性以及(d)omt适配体传感器选择性图

具体实施方式

以下结合实例对本发明进行详细描述，但本发明不局限于这些实施例。

实施例1：

(1)mote2量子点的制备

称取60mg所购买的块状mote2置于40ml的离心管中，静置浸入液氮中冷冻2小时。量取10ml叔丁醇、10ml水混合作为共溶剂。将离心管取出立即加入上述共溶剂中形成混合溶液。立即转入细胞粉碎机中超声2小时。最后将分散液用离心机离心15分钟，转速为13000rmp，收集上清液，得到mote2分散液。

(2)mote2/zif-8的制备

配取10mm的2-甲基咪唑(hmeim)的甲醇溶液，加入1ml1-10mg/lmote2分散液，超声混匀0.5小时，得到溶液a。然后配取10mm硝酸锌(zn(no3)2)甲醇溶液b,取10mla与10mlb充分混合后在室温下静置2小时。用甲醇10000rmp离心洗涤2-3次。然后60℃真空干燥过夜。

zif-8(a)和mote2/zif-8(b)的sem表征图(图1)和mote2/zif-8的光电子能谱图和高分辨光电子能谱图(图2)表明了mote2/zif-8的成功制备。

(3)修饰电极的制备步骤

首先将玻碳电极(gce,φ＝3.0mm)分别用1.0,0.3和0.05μm的抛光粉(al2o3)在抛光布上打磨成镜面。然后依次在超纯水、乙醇和超纯水中超声清洗,室温条件下用氮气吹干。

称取2mg的mote2/zif-8纳米功能材料超声分散在1ml的0.5％nafion/水溶液中,得到2.0mg/ml的mote2/zif-8纳米功能材料的萘酚分散液(naphthol/mote2/zif-8)。移取6.0μl该分散液滴涂在预先处理好的gce电极表面,于室温下晾干,得到naphthol/mote2/zif-8修饰的gce电极(naphthol/mote2/zif-8/gce)。

为了比较，分别使用类似步骤获得naphthol/mote2/gce和naphthol/zif-8/gce。

(4)ecl传感器的构建步骤

在naphthol/mote2/zif-8/gce电极上滴凃6μlomt的aptamer溶液(3×10^-6mol/l)。omt的适配体序列号为：5'-aagcttttttgactgactgcagcgattcttgatcgccacggtctggaaaaagag-3'。将制备的适配体修饰的naphthol/mote2/zif-8/gce置于4℃冰箱中反应12h，并用0.1mol/lpbs冲洗以除去过量未吸附的aptamer，得到aptamer/naphthol/mote2/zif-8/gce。

此后，将20μl浓度为10^-10,10^-9,10^-8,10^-7,10^-6,10^-5g/lomt分别滴到aptamer/naphthol/mote2/zif-8/gce电极上，并在37℃恒温孵育箱中孵育一段时间。

图3是适配体传感过程示意与表征图，证明了ecl适配体传感器的构建过程与成功构建。ecl实验在mpi-a型电化学发光检测仪上进行,光电倍增管的高压设置为600v,电压范围为-2.0～0v,测试体系为含有50mm的k2s2o8的pbs缓冲溶液(ph＝8)，最后ecl适配体传感器被成功构建并应用于大豆和菠菜样品中的omt的分析检测。

图4为(a)所构建的ecl适配体传感器检测不同浓度omt的光电流响应图，(b)相应的omt的检测线性曲线，在10^-10～10^-5g/l的浓度区间内，ecl信号值与omt浓度log值之间呈现良好的线性关系，检出限可达3.33×10^-11g/l。图(c)所构建的适配体ecl传感器28个循环周期下稳定性以及(d)omt适配体传感器选择性图表明选择性良好。

实施例2：

(1)mote2量子点的制备

称取40mg所购买的块状mote2置于40ml的离心管中，静置浸入液氮中冷冻2小时。量取10ml叔丁醇、10ml水混合作为共溶剂。将离心管取出立即加入上述共溶剂中形成混合溶液。立即转入细胞粉碎机中超声2小时。最后将分散液用离心机离心15分钟，转速为13000rmp，收集上清液，得到mote2分散液。

(2)mote2/zif-8的制备

配取10mm的2-甲基咪唑(hmeim)的甲醇溶液，加入1ml1-10mg/lmote2分散液，超声混匀0.5小时，得到溶液a。然后配取10mm硝酸锌(zn(no3)2)甲醇溶液,取10mla与10mlb充分混合后在室温下静置2小时。用甲醇10000rmp离心洗涤2-3次。然后60℃真空干燥过夜。

步骤(3)、(4)同实施例1的步骤(3)、(4)。

实施例3：

(1)mote2量子点的制备

称取40mg所购买的块状mote2置于40ml的离心管中，静置浸入液氮中冷冻2小时。量取10ml叔丁醇、10ml水混合作为共溶剂。将离心管取出立即加入上述共溶剂中形成混合溶液。立即转入细胞粉碎机中超声2小时。最后将分散液用离心机离心15分钟，转速为13000rmp，收集上清液，得到mote2分散液。

(2)mote2/zif-8的制备

配取20mm的2-甲基咪唑(hmeim)的甲醇溶液，加入1ml1-10mg/lmote2分散液，超声混匀0.5小时，得到溶液a。然后配取10mm硝酸锌(zn(no3)2)甲醇溶液,取10mla与10mlb充分混合后在室温下静置2小时。用甲醇10000rmp离心洗涤2-3次。然后60℃真空干燥过夜。

步骤(3)、(4)同实施例1的步骤(3)、(4)。