一种液相色谱串联质谱法检测血液中褪黑素水平的方法及应用

1.本发明属于临床医学技术领域，具体涉及一种液相色谱串联质谱法检测血液中褪黑素水平的方法以及骨质疏松试剂盒。


背景技术：

2.骨质疏松作为一种全身性的骨代谢疾病，特点是骨量减少和骨微结构的恶化，这两者会导致脆性骨折的风险增加，尤其以髋部和脊柱为主，这在绝经后妇女中较为常见。骨质疏松如果并发脆性骨折则常常需要手术治疗，而治疗及其护理需要大量的人力和财力，术后可能导致瘫痪或死亡，这会给家庭和社会带来沉重的负担，因此早期的诊断至关重要。
3.目前，骨质疏松的诊断主要依靠双能x线(dxa)吸收法测定，但此方式操作复杂，费用高昂，患者易受辐射且椎体骨折和大的骨刺对测量结果影响较大，因此需要研发新的诊断方法。既往研究发现，骨代谢的调节需要体内部分激素的调控，包括甲状旁腺素、降钙素、维生素d、雌激素等，主要作用于肠道、肾脏、骨骼，通过调节成骨与破骨的动态平衡，维持骨骼的健康。其中小剂量的甲状旁腺素可促进成骨。降钙素通过抑制破骨细胞的活性和数量，直接抑制骨质吸收。维生素d可刺激成骨细胞分泌胶原，促进骨生成。而雌激素一方面可以抑制破骨细胞活性，另一方面直接作用于成骨细胞，使骨量增加，维持骨形成与吸收的耦联。上述激素虽然可以调节骨代谢，但对于骨质疏松的诊断缺乏敏感性，与骨密度的关系并不十分明显，也易受到饮食和药物影响，临床应用受到极大限制，无法做到精准的诊断。因此，为有效防治骨质疏松，需要找出新的精准标记物。
4.褪黑素作为人松果体中产生的一种激素，往往参与人体的多种调节，包括血压﹑核心温度﹑睡眠﹑胃肠生理﹑抗炎﹑心血管功能等。值得注意的是，近年来研究发现绝经后妇女体内褪黑素处于较低水平，应用褪黑素可以改善绝经后妇女的骨量降低，动物实验进一步证实褪黑素可以逆转绝经后骨质疏松症的骨量减少。因此，本技术提出褪黑素与骨代谢可能存在密切的联系。在此基础上，深入探索褪黑素调控骨代谢的详细机制，明确血液中褪黑素水平是诊断骨质疏松的敏感性指标，并通过液相色谱串联质谱法检测绝经后妇女体内褪黑素水平，明确褪黑素与骨密度的关系，并确立诊断区间，有助于对骨质疏松做出早期诊断，可以给其家庭和社会减轻沉重的负担。


技术实现要素：

5.针对现有技术的不足，本发明提供了一种液相色谱串联质谱法检测血液中褪黑素水平的方法，本发明基于临床使用效能及人群参考区间设定以及质谱平台使用效能和准确度，溯源方法建立。
6.为实现上述目的，本发明的技术路线如下：
7.一种液相色谱串联质谱法检测血液中褪黑素水平的方法，通过液相色谱串联质谱的方法定量测定血液中褪黑素水平进行，明确骨密度与褪黑素的相关性，确立褪黑素诊断
区间，实现骨质疏松症的预测。
8.适用检测血液为绝经后妇女血液。
9.所述褪黑素诊断区间绝经后骨量正常的妇女体内褪黑素的水平为1.99-148pg/ml，平均24.41pg/ml；绝经后骨量减少的妇女体内褪黑素的水平为0.9-63.9pg/ml，平均13.46pg/ml；绝经后骨质疏松的妇女体内褪黑素的水平在0.9-42.28pg/ml，平均7.06pg/ml。
10.本发明基于上述检测血液中褪黑素水平的方法，提供了一种骨质疏松检测试剂盒，该试剂盒基于竞争法，该试剂盒内含有检测血液褪黑素的试剂。
11.本发明基于褪黑素与骨代谢的密切关系，从细胞以及动物层面全面的探索了不同浓度褪黑素对骨代谢的调控机制，发现褪黑素对成骨细胞增殖具有不同的效应，并存在浓度依赖性。高浓度褪黑素(1mm以上)受mir-590-3p调控通过作用褪黑素受体诱导creb的磷酸化并通过上调septin4﹑septin7引起内质网的过度激活，内质网蛋白stim1发生转运与细胞膜的orai1蛋白发生结合引起细胞内钙超载并通过erk通路引起成骨细胞线粒体途径凋亡。当褪黑素浓度较低时(1mm以下)可通过直接或间接作用成骨细胞的方式诱导其增殖。低浓度褪黑素可直接作用于成骨细胞褪黑素受体，通过激活camks/mek/erk通路，上调成骨细胞周期蛋白cyclin d1和cdk4表达，促进成骨细胞的增殖。
12.本发明优点：
13.1、灵敏度要求高：褪黑素体内含量较低，以皮克(pg)水平存在；上午血清褪黑素水平是下午的5倍(上午9点前平均11.0pg/ml，上午11点后平均2.0pg/ml)。
14.2、特异性/准确性要求高：人体内有很多褪黑素类似物，会干扰检测结果。目前临床上常用的酶免疫测定法被广泛认为是显示交叉反应或非特异性，检测并不敏感准确；需要解决技术项目的复杂干扰问题。
15.3、参考范围：体内褪黑素个体差异大，分泌路径复杂，分泌量受年龄、时间、药物等的影响，对样本采集要求高。-需要研究一种可以常规采样，批量采样的方式提高临床使用便利度。
附图说明
16.图1：血清褪黑素水平与骨密度的关系图；
17.图2：血中骨转换标记物e2水平的变化图；
18.图3：血中骨转换标记物osteo水平的变化图；
19.图4：血中骨转换标记物pth水平的变化图；
20.图5：血中骨转换标记物t-p1np水平的变化图；
21.图6：血中骨转换标记物vitd水平的变化图。
22.图7：血中骨转换标记物β-cross水平的变化图。
具体实施方式
23.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其
他实施例，都属于本发明保护的范围。
24.需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
25.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为本发明的限定。
26.实施例1
27.本实施例提供了一种液相色谱串联质谱法检测血液中褪黑素水平的方法，具体如下：
28.招募338名自愿者，符合年龄(青少年18-19岁，绝经后妇女55-65岁)以及绝经标准后，同时需排除：1.肾功能受损(血浆肌酐》120μmol/l)。2.高钙血症(血浆钙离子》1.32mmol/l)。3.肠道吸收不良。4.肝功能受损。5.吸烟者。6.对钙稳态和骨骼代谢有影响的药物使用者，例如抗吸收药物，骨合成代谢药物以及激素替代疗法，利尿剂，糖皮质激素。7.药物以及酒精滥用者。8.抑郁和焦虑患者。9.糖尿病患者。对于符合要求的参与者给予详细的说明，签署知情同意书，安排双能x线吸收法测定骨密度，根据检查结果对其分类，筛选出50名青年女性(18-19岁)，50名绝经后骨密度正常，50名绝经后骨量减少及50名绝经后骨质疏松的妇女，于清晨6:30空腹抽取受试者血液(15ml)，离心后(4000rpm，10min)收集血清(-80度保存)，通过液相色谱串联质谱的方法(美国sciex 6500qtpap)检测血液中褪黑素的水平。首次明确了青少年女性，骨量正常，骨量减少，骨质疏松的绝经后妇女血液中褪黑素水平成明显降低的趋势。证明褪黑素是诊断骨量减少以及骨质疏松敏感的生化指标。
29.通过收集的血液样本测量每位参与者的白天血清褪黑激素水平。根据生产商的说明，使用液相色谱串联质谱法(sciex 6500qtrap，usa)分析血清样品。根据制造商的说明为该测定法生成标准曲线，并计算褪黑激素水平(以pg/ml为单位)。
30.为了明确绝经后妇女体内褪黑素与骨密度的关系，通过液相色谱串联质谱法分析血清样品，图1表明了在清晨6:00，绝经后骨量正常的妇女体内褪黑素的水平在1.99至148pg/ml(平均24.41pg/ml)，绝经后骨量减少的妇女体内褪黑素的水平在0.9至63.9pg/ml(平均13.46pg/ml)，绝经后骨质疏松的妇女体内褪黑素的水平在0.9至42.28pg/ml(平均7.06pg/ml)，从散点图可以看出褪黑素水平随着骨量的减少呈明显降低的趋势。图1血中褪黑素水平随着骨密度的降低而降低。通过早晨6点收集血液样本并通过液相色谱串联质谱法对血清样品褪黑素含量进行测量，散点图中的每个点表示个体的血液褪黑素水平。结果表明血中褪黑素含量与骨密度存在密切相关。
31.通过收集的血液样本测量每位参与者的白天血清vitd、β-cross、osteo、pth、t-p1np、e2水平。根据生产商的说明，使用化学免疫发光法分析血清样品。根据制造商的说明为该测定法生成标准曲线，并计算血液中vitd、β-cross、osteoc、pth、t-p1np、e2水平(以pg/ml为单位)。
32.为了明确绝经后妇女体内褪黑素与骨转换标记物的关系，通过化学免疫发光法分析血清样品，图2-图7表明了，绝经后骨质疏松妇女体内β-cross、e2及osteo呈明显降低趋势；而pth、vitd及t-p1np在骨质疏松患者体内成明显增高的趋势。
33.图2-图7为血中骨转换标记物水平的变化情况。通过早晨6点收集血液样本并通过化学免疫发光法对血清样品褪黑素含量进行测量，散点图中的每个点表示个体的血液骨转换标记物水平。结果表明血中雌激素水平、tpinp及pth含量与骨密度存在密切相关。
34.本发明全面深入的探索了褪黑素不同浓度对骨代谢不同的调控作用。从增殖，分化及矿化多角度阐明褪黑素调控成骨细胞增殖的浓度依赖性及作为骨质疏松症体内成骨性标记物的作用机制。
35.在此基础上，本技术通过液相色谱串联质谱的方法对正常，骨量减少以及骨质疏松患者血液中褪黑素水平进行精确的定量，明确了骨密度与褪黑素的相关性，确立了褪黑素的诊断区间(绝经后骨量正常的妇女体内褪黑素的水平在1.99至148pg/ml(平均24.41pg/ml)，绝经后骨量减少的妇女体内褪黑素的水平在0.9至63.9pg/ml(平均13.46pg/ml)，绝经后骨质疏松的妇女体内褪黑素的水平在0.9至42.28pg/ml(平均7.06pg/ml))，发现绝经后骨量减少及骨质疏松患者往往由于褪黑素水平的降低而导致骨密度的减少，血清褪黑素水平可作为诊断绝经后妇女骨质疏松的敏感指标，为骨量减少及骨质疏松的诊断开辟的新的方法。
36.实施例2
37.本发明提供了褪黑素存在着一条与肠道菌群相关的间接作用成骨的途径。研究发现绝经后骨质疏松症小鼠和正常小鼠肠道菌群组成、丰度，血清及粪便代谢物水平都具有显著差异。与正常小鼠相比拟杆菌厚壁菌比例显著升高，阿克曼氏菌显著降低。粪便代谢组学鉴定出114种，血清鉴定出24种有差异的代谢产物。上述三种组学关联分析显示，多种胆汁酸变化与一相同菌eggerthellaceae关系密切。口服褪黑素可以逆转上述菌群，代谢物变化，而褪黑素受体拮抗剂处理的模型鼠并未出现预期的完全阻断效果，说明褪黑素治疗骨质疏松存在着一条与肠道菌群相关的间接作用途径。绝经后菌群构成发生变化，可以引起骨组织生物钟节律紊乱，造成绝经后骨质疏松症发生发展。褪黑素作用于后，通过肠道菌群，合成特异性胆汁酸代谢产物，转录调控骨bmal1表达，恢复骨生物钟节律，通过作用于opg-rankl轴，促进骨生长，抑制骨吸收。低浓度褪黑素不仅调节成骨细胞的增殖，同样通过上调runx2及pi3k/akt，bmp/smad信号通路诱导成骨细胞分化成熟与矿化。在动物层面，进一步证实褪黑素通过上调zip-1蛋白促进成骨细胞柠檬酸分泌，加强骨基质形成，最终实现对绝经骨质疏松的骨量恢复。低浓度褪黑素不仅可以调节成骨细胞的增殖与分化，同时可以通过下调mir-882,激活rev-erbα从而抑制破骨细胞分化。而当褪黑素处于极低浓度的水平(10nm以下)，并不能促进成骨细胞的增殖，调控其骨代谢。表明褪黑素只有处于相对较低浓度时，才会促进骨生成。综上，我们从不同层面阐述了褪黑素对骨代谢调节的新机制，基于上述基础，我们猜测褪黑素水平的高低可能是作为诊断骨质疏松敏感的生化指标。