一种五味祛脂颗粒中三种活性成分含量同时测定的方法

1.本发明涉及一种中药新药(壮药)五味祛脂颗粒中活性成分的检测方法，具体的说是一种同时测定五味祛脂颗粒中三种活性成分的方法，属于医药技术领域。


背景技术：

2.随着人们生活水平的不断提高和社会人口老龄化，高脂血症发病率呈明显上升和年轻化的趋势。高脂血症又是诱发冠心病、动脉硬化、脂肪肝、糖尿病、肥胖症等的重要因素，严重危害人类身体健康。近年来，随着人们生活习惯特别是饮食习惯的改变等多种因素的影响，高脂血症的发病率有明显增高的趋势，而且本病引起的心脑血管疾病等往往发病率高，危害大，病情进展凶险，其死亡率约占人类总死亡率的半数左右。据现代医学疾病监控的数据显示，全世界每天因高脂血症引发的心脑血管疾病死亡人数近4000人之多。我国每年因高脂血症引起的糖尿病、心肌梗死、脑梗死、中风、偏瘫、致残、致死人数呈逐年上升趋势。据统计，我国血脂异常患者已高达1.6亿，35岁以上的人群中有2500万人同时患有高血压和高血脂血症。因此，寻求研发高效低毒的降血脂新药物、新技术是极为重要而紧迫的任务，而祖国传统医药及少数民族医药，特别是广西壮医药在防治ra面具有较大的潜力优势与鲜明特色。
3.壮药“五味祛脂颗粒”是广西中医药大学制药厂与广西中医药大学联合研发的国家中药新药，其处方为壮医药专家庞宇舟教授在挖掘总结壮医治疗高脂血症的传统药物的基础上，按照壮医理论配伍组方的经验方，临床治疗高脂血症效果显著。该产品处方由广西藤茶、决明子、葛根、荷叶、百合等药食同源药材组方，可通调龙路、火路，同时兼以扶正补虚，诸症兼顾，相得益彰，具有清热毒，祛湿毒，利水道的功效，通过调节机体的代谢机能，从而达到多靶点、多环节整体协调降血脂的作用。
4.中成药作为一个整体，强调的是各味药的协同作用。中成药中单一有效成分或指标成分控制，难以真正控制药品质量，而采用多指标多成份的含量测定方法将成为中成药未来质量控制方法的主流。现代研究表明，五味祛脂颗粒中葛根素、二氢杨梅素、杨梅素是其主要活性成分，可作为评价该制剂质量的重要依据。目前，国内已公开五味祛脂颗粒两或多种活性成分含量测定的方法，这些方法检测指标少，有可能导致其它组分不稳定或缺乏，难以全面准确控制药品质量。因此必需建立一种快速、准确、全面分离、检测五味祛脂颗粒中多种活性成分的方法，以便更好地对该产品进行质量监控和用药安全。
5.本发明建立了同时测定五味祛脂颗粒制剂中葛根素、二氢杨梅素、杨梅素三种成分含量的检测方法，实验结果表明，本法建立的hplc同时测定制剂中多个不同指标成分的含量测定方法，简单快速、准确可靠，重复性及稳定性均较好，可作为该制剂的质量控制方法。


技术实现要素：

6.本发明目的在于提供一种同时测定中药(壮药)新药五味祛脂颗粒中葛根素、二氢
杨梅素、杨梅素三种活性成分含量的方法，该方法简单、稳定、重现性好，可用于该药品的质量控制。
7.本发明的目的是这样实现的：利用高效液相色谱检测的方法，同时测定制剂中处方药材主要成分葛根素、二氢杨梅素、杨梅素的含量，具体步骤如下：
8.(1)对照品溶液的制备：取葛根素、二氢杨梅素、杨梅素对照品适量，加甲醇制成浓度为0.023、0.5436、0.2504mg/ml的葛根素、二氢杨梅素、杨梅素混合对照品溶液。
9.(2)供试品溶液的制备：取五味祛脂颗粒(研细，过80目筛)0.2g，精密称定，置于锥形瓶中，精密加入甲醇20ml，称重，超声提取30min，补重，滤过，取续滤液过0.22μm微孔滤膜，即得。
10.(3)色谱条件及样品检测：将混合对照品溶液和供试品溶液分别注入高效液相色谱仪，采用如下色谱条件检测：色谱柱：dimensions c18(250mm
×
4.6mm,5μm)；流动相为乙腈(a)
‑
0.4％磷酸水(b),梯度洗脱:0
‑
15min,15％a
→
26％a；15
‑
25min，26％
→
50％；波长0
‑
9min，250nm；9
‑
25min，285nm；进样量5μl，柱温30℃。记录峰面积计算含量即可。
11.本发明具有以下优点和积极效果：
12.1、本发明所述方法简单、准确、重现性和稳定性好，可为全面评价和控制五味祛脂颗粒质量提供理论基础和科学依据。
13.2、本发明方法采用高效液相色谱法及梯度洗脱检测的方法，实现了同时测定五味祛脂颗粒中3种有效成分的含量，本发明建立的色谱法能够较好的分离、测定五味祛脂颗粒中葛根素、二氢杨梅素、杨梅素有效成分的含量，色谱峰峰形好，分离度较高，在此色谱条件下葛根素、二氢杨梅素、杨梅素的浓度与峰面积呈现良好的线性关系，各种成分回收率均在95％以上。
14.3、本发明方法操作简单、精密度、重现性和稳定性良好，为五味祛脂颗粒有效成分质量控制和药效评价的进一步研究奠定了理论基础和科学依据。
附图说明
15.图1是本发明葛根素、二氢杨梅素、杨梅素混合对照品溶液(a)、供试品溶液(b)、缺藤茶阴性对照(c)、缺葛根阴性对照(d)hplc图
16.附图标记说明：1
‑
葛根素、2
‑
二氢杨梅素、3
‑
杨梅素
17.a
‑
葛根素、二氢杨梅素、杨梅素混合对照品溶液hplc图
18.b
‑
供试品溶液hplc图
19.c
‑
缺藤茶阴性对照hplc图
20.d
‑
缺葛根阴性对照hplc图
具体实施方式
21.以下结合附图和具体实施方式对本发明作以进一步的阐述，以便本领域的技术人员更了解本发明，但并不以此限制本发明。
22.1.仪器与试药
23.1.1仪器
24.高效液相色谱仪(1260infinity ii，美国agilent)；超纯水机(direct
‑
q 5uv，广
西南宁市博美生物科技有限公司)；超声波清洗器(kq
‑
500e，昆山市超声仪器有限公司)
25.1.2试药
26.五味祛脂颗粒(批号：20191201、20191202、20191203、20200101、20200102、20200103)均由广西中医药大学制药厂提供。杨梅素(must
‑
19022504，hplc≥98.31％，成都曼思特生物科技有限公司)；二氢杨梅素(must
‑
19031501，hplc≥99.57％，成都曼思特生物科技有限公司)；葛根素(180301；上海融禾医药科技有限公司)；甲醇(187159，赛默飞世尔科技有限公司，色谱纯)；乙腈(182886，赛默飞世尔科技有限公司，色谱纯)；磷酸(20161202，成都金山化学试剂有限公司)。
27.方法与结果
28.2.1色谱条件
29.色谱柱：dimensions c18(250mm
×
4.6mm,5μm)；流动相为乙腈(a)
‑
0.4％磷酸水(b),梯度洗脱:0
‑
15min,15％a
→
26％a；15
‑
25min，26％
→
50％；波长0
‑
9min，250nm；9
‑
25min，285nm；进样量5μl，柱温30℃。
30.2.2对照品溶液的制备
31.取葛根素、二氢杨梅素、杨梅素对照品适量，加甲醇制成浓度为0.023、0.5436、0.2504mg/ml的葛根素、二氢杨梅素、杨梅素混合对照品溶液。
32.2.3供试品溶液的制备
33.取五味祛脂颗粒(研细，过80目筛)0.2g，精密称定，置于锥形瓶中，精密加入甲醇20ml，称重，超声提取30min，补重，滤过，取续滤液过0.22μm微孔滤膜，即得。
34.取缺藤茶阴性样品0.2g，精密称定，同法，制备缺藤茶阴性对照品溶液。
35.取缺葛根阴性样品0.2g，精密称定，同法，制备缺葛根阴性对照品溶液。
36.2.4专属性考察
37.分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液各5μl，按“2.1”项下色谱条件进样，记录峰面积。结果阴性样品在目标成分色谱峰位置的峰面积与供试品目标成分的峰面积之比<5％，阴性样品对检测无干扰，表明该方法专属性良好。(结果见图1)。
38.2.5标准曲线绘制
39.分别吸取二氢杨梅素对照品溶液2、4、6、8、10、12μl，按“2.1”项下色谱条件操作，记录峰面积。以质量为横坐标(x)，峰面积为纵坐标(y)，进行线性回归。其线性范围、标准曲线和相关系数结果见表1。
40.表1标准曲线
[0041][0042]
2.6稳定性试验
[0043]
取五味祛脂颗粒(批号：20191201)0.2g，精密称定，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别于0、2、4、8、12、24h进样测定，记录峰面积，计算rsd。结果葛根素、二氢杨梅素、杨梅素峰面积的rsd分别为2.297％、0.703％、0.635％，表明供试品溶
液在24h内稳定性良好。
[0044]
2.7精密度试验
[0045]
取混合对照品溶液，按“2.1”色谱条件进样测定，连续进样6次，记录峰面积，计算rsd。结果葛根素、二氢杨梅素、杨梅素峰面积rsd为1.350％、0.121％、0.145％，表明仪器精密度良好。
[0046]
2.8重复性试验
[0047]
取五味祛脂颗粒(批号：20191201)0.2g(6份)，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件操作，记录峰面积，计算每1g五味祛脂颗粒中葛根素、二氢杨梅素、杨梅素的含量，计算rsd。结果葛根素的平均含量为的rsd为3.811％；二氢杨梅素含量的rsd为3.567％；杨梅素含量的rsd为2.253％，表明方法重现性良好。
[0048]
2.9加样回收试验
[0049]
取五味祛脂颗粒(批号：20191201)0.1g(6份)，置具塞锥形瓶中，以葛根素、二氢杨梅素、杨梅素含量分别为0.062、0.2988、0.14mg/ml混合对照品溶液代替甲醇，按“2.3”项下方法制备成供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件操作，记录峰面积，计算加样回收率，计算rsd。葛根素、二氢杨梅素、杨梅素的平均回收率分别为102.7％、101.1％、99.74％，rsd分别为2.56％、2.21％、0.782％，该方法回收率符合要求。
[0050]
表2加样回收试验结果(n＝6)
[0051][0052]
2.10样品测定
[0053]
精密称取六批五味祛脂颗粒产品各0.2g，按“2.3”项下方法制备成供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件操作，记录峰面积。结果见表3，6批产品中，葛根素、二氢杨梅素、杨梅素的平均含量分别为1.67、76.43、27.81mg/g。考虑到药材的复杂性，限度按平均值下调20％，暂定五味祛脂颗粒中葛根素、二氢杨梅素、杨梅素含量不得少于1.34、61.14、22.25mg/g。
[0054]
表3 6批产品测定结果(n＝6)
[0055][0056]
综上所述，本方法专属性强，重现性好，准确度高，可作为五味祛脂颗粒中二氢杨梅素含量测定的方法，通过6批产品含量测定结果拟定五味祛脂颗粒中葛根素、二氢杨梅素、杨梅素含量不得少于1.34、61.14、22.25mg/g。