本发明涉及食品加工
技术领域：
：，具体涉及一种测定食品中14种杂环胺含量的方法。
背景技术：
：：杂环芳香胺(haas)是一类致突变化合物，研究表明，长期摄入含haas可显著提高人类患癌风险，haas常由富含蛋白质的食品经美拉德反应后产生。haas生成的组分及其含量水平与食品中前体物、加工烹饪方法(煎炸、吸烟、烘烤或烧烤)、温度和时间密切相关。结果表明，高温和长时间加热导致更多杂环胺产生，包括2-氨基-1-甲基-6-苯基咪唑并[4,5-b]吡啶(phip)、2-氨基-3,4-二甲基咪唑并[4,5-f]喹啉(meiq)、2-氨基-3-甲基咪唑并[4,5-f]喹啉(iq)等，上述杂环胺一般可诱导dna加合物形成，促使基因突变型，诱导癌症发生。据报道，消费者每日摄入haas总量可大致相当于欧盟标准的40％，而热爱烧烤类食品的消费者暴露于haas甚至更高。摄入含haas混合物的食品可能对人类健康构成潜在风险，而开发同步测定多种杂环胺的方法至关重要。技术实现要素：为解决上述技术问题，本发明提供一种测定食品中杂环胺含量的方法，本发明方法可实现同步测定非油炸及油炸食品(包括猪肉、鸡肉、羊肉及其制品的动物蛋白，以及豆腐等植物蛋白)中14种杂环胺的检测方法。本发明通过以下技术方案实现技术目的：一种测定食品中杂环胺含量的方法，包括以下步骤：对食品进行前处理得待检样品；采用液相色谱质谱联用仪对待检样品进行分析检测后进行数据处理得出食品中杂环胺的含量；其中液相色谱质谱联用仪测定条件为：色谱柱：agilentxdbc182.1*150mm，3.5μm；流动相a:0.5％甲酸-5mm甲酸铵水溶液；流动相b:0.5％甲酸-5mm甲酸铵甲醇溶液；洗脱梯度程序：0.01-1.00min：5％b、1.00-1.10min：5％b-60％b、1.10-5.00min：60％-80％b、5.00-6.00min：80％b-95％b、6.00-8.00min：95％b、8.00-8.10min：95％b-5％b、8.10-10.00min：5％b；流速：0.4ml/min；柱温：40℃；进样量：5μl；电离源：电喷雾电离正离子模式；质谱条件：气帘气压力(cur)：35psi；离子喷雾电压：5500v；离子源温度：550℃；雾化气(gas1)50psi；加热气(gas2):55psi。进一步地，所述杂环胺为以下14种杂环胺中的一种或多种：2-氨基二吡啶并[1,2-a：3'，2'-d]咪唑二盐酸盐、2-氨基-1,6-二甲基咪唑并[4，5-b]吡啶、3-氨基-1-甲基-5h-吡啶并[4，3-b]吲哚、2-氨基-9h-吡啶并[2，3-b]吲哚、3-氨基-1,4-二甲基-5h-吡啶并[4,3-b]吲哚醋酸盐、2-氨基-3-甲基-9h-吡啶并[2,3-b]吲哚、2-氨基-3,4,8-三甲基咪唑并[4,5-f喹喔啉、2-氨基-3,4-二甲基咪唑并[4,5-f]喹啉、2-氨基-1-甲基-6-苯基咪唑并[4,5-b]吡啶、2-氨基-3-甲基咪唑并[4,5-fl喹啉、2-氨基-3，8-二甲基咪唑并[4,5-f]喹喔啉、2-氨基-3,7,8-三甲基咪唑并[4,5-fl喹喔啉、哈尔满碱和9h-吡啶[3，4-b]吲哚。进一步地，所述食品包含非油炸食品及杂环胺含量较多的油炸食品。进一步地，所述食品的前处理过程包括以下步骤：提取：食品经研磨粉碎后置于内标储备液中，加入甲醇-盐酸混合溶液混合后超声提取，冷冻离心得上清液；净化：上清液置于经过活化的固相萃取柱中，依次用水、甲醇、甲醇-氨水混合溶液a洗涤后用甲醇-氨水混合溶液b洗脱，收集洗脱液吹干后加入流动相定容，过滤得检测样品；其中溶液a为：甲醇-2％氨水(体积比为25:75)；溶液b为：甲醇-25％氨水(体积比95:5)。进一步地，所述提取过程中：内标储备液为5μg/ml的4,7,8-trimeiqx溶液；食品、内标储备液和甲醇-盐酸混合溶液的质量体积比为1g：10μl：10ml；所述甲醇-盐酸混合溶液为体积比为20:80的甲醇和5wt％盐酸的混合溶液；所述超声提取时间10min；所述冷冻离心条件：-4℃、10000r/min下冷冻离心10min；进一步地，所述净化过程中：所述活化包括：将固相萃取柱依次用甲醇、甲醇：5wt％盐酸体积比为20：80的混合溶液活化；所述洗涤和洗脱过程中，控制流速1ml/min，收集洗脱液并在35℃水浴下用氮气吹干，加入初始流动相定容至1ml，过0.22μm膜，得检测样品。与现有技术相比，本发明的有益效果：内标物质4,7,8-trimeiqx于检测样品前分别添加至样品与系列标准工作溶液中，上机浓度均为5ng/ml，同样品一并经过前处理过程，以此校正前处理过程中目标分析化合物的损失。定量过程中，以系列标准工作溶液中目标组分的峰面积对内标物的峰面积之比为纵坐标(y),相应的质量浓度之比为横坐标(x)，建立标准曲线。将样品溶液中待测组分的峰面积与内标物质的峰面积比值代入标准曲线，相对应横坐标x数值乘以样品中内标物质添加浓度即得到样品溶液中待测物质的浓度。本发明方法能够实现同时对食品中14种杂环胺的定性与定量检测，且检出限低于0.02ng/ml，灵敏度良好。本发明样品处理方法所得到的样品能够在最大程度上保留原有样品中杂环胺成分的同时减少其他干扰物质的含量，避免由于其他化合物干扰所导致的杂环胺检测误差。检测过程具体受以下几方面影响：1.提取剂的选择本发明检测的14种杂环胺类化合物及所选内标物质，均在甲醇中有着较强的溶解性，因而选择甲醇作为有机提取剂。食品基质复杂，在食品生产与加工工艺中往往会引入繁多其他化合物，除了目标分析物杂环胺外，常会伴有糖类、蛋白质、脂肪等，生成的杂环胺会被糖类、蛋白质、脂肪等物质包裹，不易分离。盐酸溶液的加入，会与糖类、蛋白质、脂肪等反应，破坏它们的大分子结构，去除了杂质的“保护”作用，使得杂环胺更易游离到提取剂中，可显著提高提取效率。分别采用了1,3,5,10％的盐酸-甲醇溶液处理1.00g食品样品，随着盐酸浓度的增加，在盐酸浓度为5％处理使添标回收率达到峰值。2.固相萃取柱的选择对比agelacleanertpcxspe小柱(60mg/3cc)与watersoasismcxcartridges小柱(60mg/3cc)两种固相萃取柱的净化效果，发现回收率二者无明显差异，但watersmcx小柱的洗脱速度较agelapcx柱更快，且填料更为均匀。对比watersmcx小柱(60mg/3cc)与watersmcx小柱(150mg/6cc)两种规格，用相同的方法操作后发现回收率亦没有较大改变，而柱容量愈大，上样液与填料接触面积愈大，上样与洗脱的时间愈短，且不易发生堵塞。综上，采用mcx柱(150mg/6cc)进行富集、净化。3.上样净化过程洗涤条件的选择由于mcx阳离子固相萃取柱的特性，洗涤顺序采用极性由大至小、由中性条件到碱性条件，以使非待测组分最大限度地被除去。先后用水、甲醇、甲醇-2％氨水(体积比为25:75)混合溶液洗涤，收集并检测每组洗涤液，未检出内标与待分析物质。4.上样净化过程洗脱液的选择针对oasismcx固相萃取柱，分别选取常用的固相萃取柱洗脱剂甲醇、乙腈、甲醇-25％氨水(体积比95:5)、乙腈-25％氨水(体积比95:5)对杂环胺进行洗脱，发现甲醇-25％氨水(体积比95:5)和乙腈-25％氨水(体积比95:5)的洗脱能力较纯甲醇和纯乙腈的洗脱能力更好，而甲醇-25％氨水(体积比95:5)和乙腈-25％氨水(体积比95:5)的洗脱能力相近，考虑到甲醇比乙腈的毒性弱一些，价格也更为低廉，因此本发明选用甲醇-25％氨水(体积比95:5)作为洗脱剂。5.质谱条件在esi+模式下考察14种杂环胺及其内标的响应值，实验选取丰度响应高、特异性好的离子对，对14种杂环胺及其内标进行质谱参数的优化，离子对、锥孔电压、碰撞能等参数优化至最佳。由于待测目标化合物极性差异较大，控制进样体积为5μl，并采用梯度洗脱程序，以便待测物质分离。考察了c8(2.1*150mm，5μm)色谱柱、c18(2.1*150mm，3.5μm)色谱柱、氰基(4.6*150mm，3.5μm)色谱柱对14种目标分析物的分离效果，其中c18色谱柱，填料粒径较小，有更高的柱效，且对目标分析物均有保留、出峰峰形与响应值更佳。因此选用c18(2.1*150mm，3.5μm)色谱柱进行实验分析；考察了流动相中的甲酸体积分数(0.1％、0.3％、0.5％)和甲酸铵浓度(2mmol/l、5mmol/l)对目标物的响应强度的影响，其中加入0.5％体积分数的甲酸，可以促进正离子模式下14种目标待测物的电离，提高了方法的灵敏度。加入5mmol/l的甲酸铵，能调节溶液的离子强度，改善待测物的峰形及响应强度6.内标物质的选择由于同位素内标物质价格较为昂贵，且目标分析物中meiq,meiqx,4,8-dimeiqx和7,8-dimeiqx没有相应的同位素标记。故选择结构和性质与目标分析物质相近，且5ng/ml标准溶液连续进样10次结果稳定性与回收率较好的4,7,8-trimeiqx作为内标物质检测分析。附图说明图1为0.5ng/ml的杂环胺溶剂标准溶液单通道mrm色谱图，其中a-o分别表示为aαc、meaαc、trp-p-1、dmip、glu-p-2、meiq、meiqx、iq、phip、4,8-dimeiqx、7,8-dimeiqx、harman、norharman、trp-p-2和4,7,8-trimeiqx(4,7,8-trimeiqx浓度为5ng/ml)。具体实施方式现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言显而易见。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言显而易见得。本申请说明书和实施例仅为示例性。关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。实施例1对市售的油炸丸子以及其中的肉类原料进行14种杂环胺的测定，具体过程如下：1.仪器液相色谱-质谱联用仪lc-20adxr/triplequad3500：日本岛津公司/美国absciex公司；高速冷冻离心机st16r：美国thermo公司；vortex3涡旋振荡器：德国ika公司；电子天平me802e：美国mettlertoledo公司；电子天平xse105du：美国mettlertoledo公司；milli-q-academic去离子纯水机：法国milliq公司；kq-300de型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；e0301s平行研磨仪：北京微思行科技有限公司；ttl-dc型氮吹仪：北京同泰联科技发展有限公司。2.试剂选用以下15种市售杂环胺标准溶液：2-氨基二吡啶并[1,2-a：3'，2'-d]咪唑二盐酸盐(glu-p-2)、2-氨基-1,6-二甲基咪唑并[4，5-b]吡啶(dmip)、3-氨基-1-甲基-5h-吡啶并[4，3-b]吲哚(trp-p-2)、2-氨基-9h-吡啶并[2，3-b]吲哚(aαc)、3-氨基-1,4-二甲基-5h-吡啶并[4,3-b]吲哚醋酸盐(trp-p-1)、2-氨基-3-甲基-9h-吡啶并[2,3-b]吲哚(meaαc)、2-氨基-3,4,8-三甲基咪唑并[4,5-f喹喔啉(4,8-dimeiqx)、2-氨基-3,4-二甲基咪唑并[4,5-f]喹啉(meiq)、2-氨基-1-甲基-6-苯基咪唑并[4,5-b]吡啶(phip)、2-氨基-3-甲基咪唑并[4,5-fl喹啉(iq)、2-氨基-3，8-二甲基咪唑并[4,5-f]喹喔啉(meiqx)、2-氨基-3,7,8-三甲基咪唑并[4,5-fl喹喔啉(7，8-dilmeiqx)、哈尔满碱(harman)、9h-吡啶[3，4-b]吲哚(norharman)、2-氨基-3,4,7,8-四甲基-3h-咪唑[4，5-]喹喔啉(4,7,8-trimeiqx)；以及oasismcxcartridges6cc/150mg固相萃取小柱：美国waters公司；所有试剂中甲醇、乙腈、甲酸均为色谱纯；其余试剂均为分析纯。3.标准溶液配制以4,7,8-trimeiqx作为内标，其原液10μg/ml取50μl，用甲醇定容至10ml，稀释为5μg/ml的内标储备液并进一步配置成浓度为50ng/ml的内标储备液；移取其余14种标准品原液(1mg/ml)各10μl，用10ml甲醇溶解定容配成浓度为1μg/ml的14种混标储备液；采用逐级稀释的方法将标准液配置成250、200、100、50、25、10、5、1ng/ml系列中间液，分别移取100μl系列中间液、100μl内标储备液，用甲醇定容至1ml配置成浓度为25.0、20.0、10.0、5.0、2.5、1.0、0.5、0.1ng/ml的混标工作液体，内标浓度均为5ng/ml，按照质量浓度由低至高进样，绘制标准曲线。图1为0.5ng/ml的杂环胺溶剂标准溶液单通道mrm色谱图，其中a-o分别表示为aαc、meaαc、trp-p-1、dmip、glu-p-2、meiq、meiqx、iq、phip、4,8-dimeiqx、7,8-dimeiqx、harman、norharman、trp-p-2和4,7,8-trimeiqx(4,7,8-trimeiqx浓度为5ng/ml)。4.样品前处理制样：取适量样品解冻于研磨杯中，置于平行研磨仪底座，使用ⅰ档开始研磨，待样品充分研碎后，收集，冷藏，待前处理检测。提取：取样品解冻，称取约1g(精确到0.01g)于50ml离心管中，加入10μl浓度为5μg/ml内标储备液，再加入甲醇：5％盐酸为20：80(体积比)混合溶液10ml，涡旋振荡充分混合1min后，置入超声清洗机中，在室温下超声提取10min。取出离心管，-4℃下冷冻离心(10000r/min，10min)。净化：将固相萃取柱预先用10ml甲醇、10ml甲醇：5％盐酸为20：80(体积比)混合溶液活化。将上述离心管中的上清液全部转移至萃取柱中，弃去流出液：然后依次用10ml水、10ml甲醇、10ml甲醇：2％氨水为25：75(体积比)混合溶液洗涤，最后用10ml甲醇：25％氨水为95：5(体积比)混合溶液进行洗脱。控制流速约为每3秒一滴(1ml/min)，收集洗脱液并在35℃水浴下用氮气吹干，加入初始流动相定容至1ml，过0.22μm膜，上机分析。5.仪器条件液相条件：色谱柱：agilentxdbc182.1*150mm，3.5μm；流动相a:0.5％甲酸-5mm甲酸铵水溶液；流动相b:0.5％甲酸-5mm甲酸铵甲醇溶液；洗脱梯度程序：0.01-1.00min：5％b、1.00-1.10min：5％b-60％b、1.10-5.00min：60％-80％b、5.00-6.00min：80％b-95％b、6.00-8.00min：95％b、8.00-8.10min：95％b-5％b、8.10-10.00min：5％b；流速：0.4ml/min；柱温：40℃；进样量：5μl；电离源：电喷雾电离正离子模式；质谱条件：气帘气压力(cur)：35psi；离子喷雾电压：5500v；离子源温度：550℃；雾化气(gas1)50psi；加热气(gas2):55psi；检测方式：动态多反应监测(dynamicmultireactionmonitoring，dmrm)模式。5.离子对信息见表1表1杂环胺离子对信息7.数据处理进入mulitiquanttm软件，点击菜单中edit\userintegrationdefault，设定默积分参数，其中主要参数：integrationalgorithm(积分算法)选择mq4，gaussiansmoothwidth(高斯平滑宽度)设为1.0,rthalfwindow设为30.0,noisepercentage40％，baselinesub.window0.30min，peakspliting2points；点击工具栏中的createanewresulttable按钮，在左侧列表内选择待分析样品数据，点击＝＞按钮转移至右侧列表，点击next；在弹出窗口中新建积分定量方法，点击next；在mrm设定窗口中进行内标的设定。点选内标对应的mrm通道左侧的is列选项，将其定义为内标，在对应的目标物mrm通道isname列内选择合适的内标mrm名称，并在对应的mrm通道group列内输入编组名称，将定量离子和定性离子编为同一组，点击next；对每个mrm通道的几份参数分别进行适当的调整，最后点击finish，得到样品结果列表；针对每个样品，在sampletype列内设定正确的样品类型(包括unknown,未知样品、standard,标准样品、qualitycontrol,质控样品、blank,空白样品)在对应的standard和qualitycontrol的actualconcentration列内填入正确的样品浓度。软件将自动对浓度相同的standard,计算平均值并做线性回归计算，并将unknown的峰面积代入回归方程计算calculatedconcentration，同时，软件自动计算standard和qualitycontrol的accuracy准确度以及unknown的离子丰度比；对于各药物的母离子和子离子对，在相同的条件下，如果试样中的离子对色谱峰保留时间与标准工作溶液一致(变化范围在±2.5％之内)；样本中目标化合物的离子对的相对丰度与浓度相当标准溶液的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过30％，则可判断样品中存在该种化学成分；最后根据前处理过程中稀释倍数，计算待测样品中杂环胺的含量。8.线性关系分析将浓度为0.1ng/ml、0.5ng/ml、5.0ng/ml、10.0ng/ml、20.0ng/ml、25.0ng/ml的杂环胺混合标准溶液，按照步骤5中液质联用仪器分析条件进行测定，内标法定量，考察14种杂环胺的线性范围，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制校准曲线，并进行线性回归分析。所得校准曲线线性关系良好，相关系数r值在0.99653-0.99971之间，标准工作液准确度在82.7-130.0之间。具体见表2。表2杂环胺线性考察情况9.精密度分析按照步骤5中液质联用分析条件进行测定，对1.0ng/ml混合标准溶液连续测定6次，考察仪器的精密度。标准品保留时间和峰面积的相对标准偏差分别在0.00％～0.18％和1.01％～3.19％之间，表明仪器精密度良好。具体见表3。表3杂环胺精密度考察10.灵敏度按照步骤5中液质联用分析条件进行测定，仪器检出限(idl)按3倍的峰峰信噪比计算，仪器定量限(iql)按3倍仪器检出限计算。各成分的仪器检出限低于0.0248ng/ml，仪器定量限低于0.0744ng/ml，灵敏度良好。具体见表4。表4杂环胺分析的检出限和定量限11.基质添标回收向空白油炸豆制品样品中加入15种杂环胺混合标准溶液，添加浓度为0.2mg/kg，按照上述检测过程，平行处理3份，考察15种杂环胺添标回收率。具体见表5。表514种杂环胺添标回收率12.试剂样品测定按照上述方法对样品进行处理分析，结果见表6。表6样品检测结果以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12当前第1页12