本发明涉及化妆品原料功效评价技术领域，具体涉及一种评价化妆品原料舒缓功效的方法。
背景技术：
目前市面上出现了部分化妆品宣称含有对皮肤具有舒缓功效的原料，而对化妆品舒缓功效的评价方法有：物理化学法、生物化学法、细胞生物学法、三维重组皮肤模型替代法、动物实验法以及人体实验法。
(1)物理化学法是通过检测化妆品的物理性能和特定化学成分含量来评价其效果的便捷方法，目前在化妆品舒缓功效评价方面多为特定功效成分的定性定量检测。神经酰胺，是人体皮肤脂质的重要成分，有保湿、维持角质层结构稳定、损伤修复等功能，其性质和数量影响着皮肤屏障的稳固和部分皮肤病的发生。目前已经有较为系统的皮肤角质层取样法、液相色谱法、电离喷雾质谱法(esi－ms)、大气压化学电离质谱法(apci－ms)、串联质谱法(ms-ms)等分析法。
(2)生物化学法是借助光谱分析、电子显微镜以及其他物理、化学技术手段，对影响功效的特征指标(如自由基)、重要生物分子(如蛋白质等)含量进行测试分析的一种方法。在抗炎抗敏的功效评价中常用的生物化学实验有透明质酸酶抑制实验、自由基清除实验以及红细胞溶血试验。
(3)细胞生物学法是研究细胞结构、功能及其生命规律的一门科学。细胞生物学法通过建立细胞模型，在体外模拟人体生理环境来培养细胞，测量细胞接触受试物前后的变化来验证原料的功效性。皮肤角质粘贴试验是常见的细胞生物学法，通过收集脱落的角质细胞标本，进而了解皮肤屏障重要结构----角化套膜(cornifinedenvelope,ce)的形态和功能。试验有多重测试方法，常用胶带粘贴皮肤收集皮肤鳞屑，通过对ce进行荧光染色判断其成熟度来评估皮肤屏障的受损程度。
(4)三维重组皮肤模型替代法，皮肤模型具有与真人皮肤高度相似的皮肤结构，不仅能用于化妆品的安全性测试，还可以用于配方产品中功效原料的皮肤吸收和作用机制研究，以及分析不同细胞间的相互作用，提供原料或配方产品从安全到功效的全方位整合信息。因此，可以通过检测细胞活力和细胞因子的分泌情况来评价化妆品对刺激后皮肤的修复状态。但由于皮肤模型仍然存在部分不足，如缺乏毛囊、汗腺等皮肤附属组织。皮肤模型与真正的人体皮肤仍然存在较大的差异，所以这种方法具有一定的局限性。
(5)动物实验法，采用小鼠或大鼠作为受试对象，在进行斑贴激发后，由实验者根据动物皮肤的受损情况打分评价样品的抗敏效果。但是小鼠和大鼠的培育时间较长，而且实验操作也较为繁琐困难，实验经费支出较高。
(6)人体实验法包括主观评价法、半主观评价法以及客观评价法。主观评价包括视觉评估和受试者自我评估。视觉评估通常由专家或医生对受试者的皮肤状态如皮肤颜色、皮肤弹性等指标进行定性或分级评测；受试者自我评估多采用问卷调查形式进行，指标包括瘙痒感、刺痛感、烧灼感及紧绷感等，受试者根据问卷对自身皮肤敏感程度进行评分。半主观评价法已经被广泛用于敏感性皮肤的判定，常见的有乳酸刺痛试验和辣椒素试验。乳酸刺痛试验：将将50μl的5％或10％的乳酸水溶液涂抹于鼻唇沟及任意一侧脸颊，分别在0min，2.5min，5min和8min时询问受试者的感觉，采用四分法进行评分(0分为没有刺痛感，1分为轻度刺痛，2分为中度刺痛，3分为重度刺痛)。然后将两次分数相加，总分≥3分者为乳酸刺痛反应阳性。辣椒素试验将直径为0.8cm的两层滤纸放置于一侧鼻唇沟外约1cm处及任意一侧面颊，将含量为0.1％的辣椒素50μl置于滤纸上，询问受试者的感觉(1分为勉强可以觉察，2分轻度可以觉察，3分为中度可以觉察，4分为重度可以觉察，5分为疼痛)。如果受试者的灼痛感觉持续时间＞30s，且程度≥3分者为阳性。客观评价法是通过仪器对受试者使用化妆品前后的皮肤状态参数进行采集、样本分析和统计分析，进而对化妆品进行功效评价的一种方法。其中，皮肤状态参数包括：皮肤水分散失量、皮肤水分含量、皮肤红斑指数、皮肤表面酸碱度以及皮肤油脂分泌量。
综上所述，现有的化妆品舒缓功效评价方法至少存在以下一种的局限性：试验周期长、成本高、无法高效快速的进行大批量的高通量筛选，评价指标的选取及处理主观性较强，评价结果带有主观因素。上述技术的局限性是本领域急需解决的技术问题。
技术实现要素：
为了克服背景技术中提到的至少一种技术缺陷，本发明提供了一种评价化妆品原料舒缓功效的方法。
本发明所要解决的上述技术问题，通过以下技术方案予以实现：
一种评价化妆品原料舒缓功效的方法，其包括以下步骤：
设置空白对照组：以斑马鱼胚胎为受试对象，加入无刺激性的培养液；
设置模型对照组：以斑马鱼胚胎为受试对象，以溶液的方式加入诱导皮肤刺激的化妆品原料；
设置待测样品组：以斑马鱼胚胎为受试对象，以溶液的方式同时加入诱导皮肤刺激的化妆品原料和待测化妆品原料；
各组培养相同的时间后，观察并统计空白对照组、模型对照组和待测样品组中斑马鱼胚胎痉挛翻滚的次数。
本发明通过大量实验研究表明，化妆品原料是否具有舒缓作用与斑马鱼胚胎痉挛翻滚的次数有着对应的关系；基于该研究，本发明通过上述方法根据空白对照组、模型对照组和待测样品组中斑马鱼胚胎痉挛翻滚的次数来评价化妆品原料的舒缓功效；由于，斑马鱼四季皆可产卵，每次的产卵量大一般为200枚/周/对，作为模式动物其进行的是体外受精，体外发育，养殖成本较低且具有极低的实验伦理压力，因此可以进行高通量筛选，对于大批量的化妆品原料舒缓功效的筛选带来更多便利。通过统计每颗胚胎的痉挛翻滚次数进行结果整理分析计算，结果呈现效果清晰有较大说服力；并有较好的展示效果以及准确度。由此可见，采用斑马鱼胚胎的痉挛翻滚次数，进行舒缓功效评价；其试验周期短、成本低、尤其是可以高效快速的进行大批量的高通量筛选，且结果准确可靠。
优选地，所述的斑马鱼胚胎为斑马鱼受精16小时～出壳前的胚胎。
发明人进一步研究发现：本发明方法采用斑马鱼受精16小时～出壳前的胚胎，其痉挛翻滚反应灵敏且稳定，采用斑马鱼受精16小时～出壳前的胚胎来价化妆品原料舒缓功效的方法具有灵敏度高、结果准确，无假阳性出现。
优选地，在显微镜下观察并统计培养相同的时间后空白对照组、模型对照组和待测样品组中斑马鱼胚胎痉挛翻滚的次数。
最优选地，在显微镜下录像并保存视频，根据视频，观察并统计培养相同的时间后空白对照组、模型对照组和待测样品组中斑马鱼胚胎痉挛翻滚的次数。
优选地，所述的培养是指置于恒温恒湿的培养箱中培养；所述的时间为0.5～2h；最优选地，所述的时间为1h。
优选地，观察并统计1min内空白对照组、模型对照组和待测样品组中斑马鱼胚胎痉挛翻滚的次数；最优选地，观察并统计30s内空白对照组、模型对照组和待测样品组中斑马鱼胚胎痉挛翻滚的次数。
优选地，观察并统计空白对照组、模型对照组和待测样品组中斑马鱼胚胎痉挛翻滚的次数后；若待测样品组中斑马鱼胚胎痉挛翻滚的次数明显少于模型组中斑马鱼胚胎痉挛翻滚的次数，且待测样品组中斑马鱼胚胎痉挛翻滚的次数与空白对照组中斑马鱼胚胎痉挛翻滚的次数无明显差异，则说明待测化妆品原料具有舒缓功效；若待测样品组中斑马鱼胚胎痉挛翻滚的次数与模型对照组中斑马鱼胚胎痉挛翻滚的次数无明显差异，则说明待测化妆品原料无舒缓功效或舒缓功效不明显。
优选地，所述诱导皮肤刺激的化妆品原料为十二烷基磺酸钠。
优选地，所述十二烷基磺酸钠的浓度为25～1000μmol/l；最优选地，所述十二烷基磺酸钠的浓度为200μmol/l。
优选地，诱导皮肤刺激的化妆品原料以及待测化妆品原料以溶液的方式经皮给药。
研究表明，诱导皮肤刺激的化妆品原料以及待测化妆品原料以溶液的方式经皮给药，能够是得斑马鱼受精16小时～出壳前的胚胎痉挛翻滚反应灵敏，可以进一步提高本发明评价方法的灵敏度。
有益效果：本发明提供了一种全新的评价化妆品原料舒缓功效的方法；该方法与现有的评价化妆品原料舒缓功效的方法相比，其试验周期短、成本低，可以满足化妆品原料的高通量筛选，实验操作简单，且评价结果客观可靠；该方法不仅可以评价已知的化妆品原料的舒缓功效的效果，也能对宣称舒缓功效的化妆品原料进行评价。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步解释本发明，但实施例对本发明不做任何形式的限定。
如无特别说明，本发明所采用的原料均可从市场上购得或是本领域常用的原料。本发明方法中的最低经皮刺激浓度指能够引起受精16小时～出壳前的斑马鱼胚胎痉挛翻滚的现象明显增加的浓度。本发明方法中的安全浓度指不会致死斑马鱼胚胎的浓度。以下试验中受精16小时～出壳前的斑马鱼胚胎具体为使用ab系野生型斑马鱼的胚胎。
实施例1
(1)设置空白对照组：取受精16小时的斑马鱼胚胎，放入96孔板中，每孔5颗胚胎，每组设置3个复孔，每孔加入200μl的h-buffer溶液，培养1小时；
(2)设置模型对照组：取受精16小时的斑马鱼胚胎，放入96孔板中，每孔5颗胚胎，每组设置3个复孔，以溶液的形式每孔加入200μl的十二烷基磺酸钠，加入浓度为200μmol/l，培养1小时。所加入十二烷基磺酸钠溶液的浓度处于最低经皮刺激浓度以上。
(3)设置待测样品组：取受精16小时的斑马鱼胚胎，放入96孔板中，每孔5颗胚胎，每组设置3个复孔，以溶液的形式每孔加入200μl的甘草酸二钾和十二烷基磺酸钠的混合液，培养1小时。十二烷基磺酸钠的浓度为200μmol/l，甘草酸二钾的浓度处于安全浓度范围内，其中分别测试1000μmol/l、100μmol/l、10μmol/l的甘草酸二钾溶液。
(4)统计分析：取培养1小时后的空白对照组、模型对照组以及待测样品组的斑马鱼胚胎，置于连续变焦体式显微镜下，采用mshotimageanalysissystem软件进行录像并保存视频。观察并统计30s内斑马鱼胚胎痉挛翻滚的次数，统计结果见表1。
实施例2
(1)设置空白对照组：取受精24小时的斑马鱼胚胎，放入96孔板中，每孔5颗胚胎，每组设置3个复孔，每孔加入200μl的h-buffer溶液，培养1小时；
(2)设置模型对照组：取受精24小时的斑马鱼胚胎，放入96孔板中，每孔5颗胚胎，每组设置3个复孔，以溶液的形式每孔加入200μl的十二烷基磺酸钠，加入浓度为200μmol/l，培养1小时；
(3)设置待测样品组：取受精24小时的斑马鱼胚胎，放入96孔板中，每孔5颗胚胎，每组设置3个复孔，以溶液的形式每孔加入200μl的积雪草苷和十二烷基磺酸钠的混合液，培养1小时。十二烷基磺酸钠的浓度为200μmol/l，积雪草苷的浓度处于安全浓度范围内，其中分别测试500μmol/l、50μmol/l、5μmol/l的积雪草苷溶液。
(4)统计分析：取培养1小时后的空白对照组、模型对照组以及待测样品组的斑马鱼胚胎，置于连续变焦体式显微镜下，采用mshotimageanalysissystem软件进行录像并保存视频。观察并统计30s内斑马鱼胚胎痉挛翻滚的次数，统计结果见表2。
实施例3
(1)设置空白对照组：取受精36小时的斑马鱼胚胎，放入96孔板中，每孔5颗胚胎，每组设置3个复孔，每孔加入200μl的h-buffer溶液，培养1小时；
(2)设置模型对照组：取受精36小时的斑马鱼胚胎，放入96孔板中，每孔5颗胚胎，每组设置3个复孔，以溶液的形式每孔加入200μl的十二烷基磺酸钠，加入浓度为200μmol/l，培养1小时；
(3)设置待测样品组：取受精36小时的斑马鱼胚胎，放入96孔板中，每孔5颗胚胎，每组设置3个复孔，以溶液的形式每孔加入200μl的原花青素和十二烷基磺酸钠的混合液，培养1小时。十二烷基磺酸钠的浓度为200μmol/l，原花青素的浓度处于安全浓度范围内，其中分别测试1000μmol/l、100μmol/l、10μmol/l的原花青素溶液。
(4)统计分析：取培养1小时后的空白对照组、模型对照组以及待测样品组的斑马鱼胚胎，置于连续变焦体式显微镜下，采用mshotimageanalysissystem软件进行录像并保存视频。观察并统计30s内斑马鱼胚胎痉挛翻滚的次数，统计结果见表3。
实施例4
(1)设置空白对照组：取受精48小时的斑马鱼胚胎，放入96孔板中，每孔5颗胚胎，每组设置3个复孔，每孔加入200μl的h-buffer溶液，培养1小时；
(2)设置模型对照组：取受精48小时的斑马鱼胚胎，放入96孔板中，每孔5颗胚胎，每组设置3个复孔，以溶液的形式每孔加入200μl的十二烷基磺酸钠，加入浓度为200μmol/l，培养1小时；
(3)设置待测样品组：取受精48小时的斑马鱼胚胎，放入96孔板中，每孔5颗胚胎，每组设置3个复孔，以溶液的形式每孔加入200μl的4-叔丁基环己醇和十二烷基磺酸钠的混合液，培养1小时。其中十二烷基磺酸钠的浓度为200μmol/l；4-叔丁基环己醇的浓度处于安全浓度范围内，分别测试1000μmol/l、100μmol/l、10μmol/l的4-叔丁基环己醇溶液。
(4)统计分析：取培养1小时后的空白对照组、模型对照组以及待测样品组的斑马鱼胚胎，置于连续变焦体式显微镜下，采用mshotimageanalysissystem软件进行录像并保存视频。观察并统计30s内斑马鱼胚胎痉挛翻滚的次数，统计结果见表4。
表1受精16小时的斑马鱼胚胎痉挛翻滚的次数
从表1可以看出，各待测样品组的浓度均处于安全浓度范围内，加入不同浓度甘草酸二钾溶液处理后，受精16小时的斑马鱼胚胎痉挛翻滚的次数均小于模型对照组。基于判断标准：若待测样品组中斑马鱼胚胎痉挛翻滚的次数＜模型组中斑马鱼胚胎痉挛翻滚的次数，且待测样品组中斑马鱼胚胎痉挛翻滚的次数与空白对照组中斑马鱼胚胎痉挛翻滚的次数无明显差异，则说明待测的化妆品舒缓原料具有舒缓功效。这说明，甘草酸二钾具有舒缓功效。此外，在待测样品组(1)中，斑马鱼胚胎痉挛翻滚的次数明显少于模型对照组，舒缓效果最为明显；在待测样品组(2)中，斑马鱼胚胎痉挛翻滚的次数亦少于模型对照组，舒缓效果较为明显；在待测样品组(3)中，斑马鱼胚胎痉挛翻滚的次数与模型对照组的差异不大，舒缓效果不明显。这说明，在安全浓度范围下，甘草酸二钾溶液的浓度越大，对皮肤刺激的舒缓效果越明显。
表2受精24小时的斑马鱼胚胎痉挛翻滚的次数
从表2可以看出，各待测样品组的浓度均处于安全浓度范围内，加入不同浓度的积雪草苷溶液处理后，受精24小时的斑马鱼胚胎痉挛翻滚的次数均小于模型对照组。基于判断标准：若待测样品组中斑马鱼胚胎痉挛翻滚的次数＜模型组中斑马鱼胚胎痉挛翻滚的次数，且待测样品组中斑马鱼胚胎痉挛翻滚的次数与空白对照组中斑马鱼胚胎痉挛翻滚的次数无明显差异，则说明待测的化妆品舒缓原料具有舒缓功效。这说明，积雪草苷具有舒缓功效。此外，在待测样品组(3)中，斑马鱼胚胎痉挛翻滚的次数明显少于模型对照组，舒缓效果最为明显；在待测样品组(2)中，斑马鱼胚胎痉挛翻滚的次数明显少于模型对照组，舒缓效果与待测样品组(1)差异不大；在待测样品组(1)中，斑马鱼胚胎痉挛翻滚的次数亦少于模型对照组，但是其痉挛翻滚的次数明显高于待测样品组(2)和待测样品组(3)，舒缓效果不如待测样品组(2)和待测样品组(3)。这说明，在安全浓度范围下，积雪草苷溶液在低浓度下，对皮肤刺激的舒缓效果更为明显。
表3受精32小时的斑马鱼胚胎痉挛翻滚的次数
从表3可以看出，各待测样品组的浓度均处于安全浓度范围内，加入不同浓度的原花青素溶液处理后，受精32小时的斑马鱼胚胎痉挛翻滚的次数均小于模型对照组。基于判断标准：若待测样品组中斑马鱼胚胎痉挛翻滚的次数＜模型组中斑马鱼胚胎痉挛翻滚的次数，且待测样品组中斑马鱼的胚胎痉挛翻滚的次数与空白对照组中斑马鱼胚胎痉挛翻滚的次数无明显差异，则说明待测的化妆品舒缓原料具有舒缓功效。这说明，原花青素具有舒缓功效。在三组待测样品组中，斑马鱼胚胎痉挛翻滚的次数并没有明显的差异；这说明，在安全浓度范围内，原花青素各浓度的溶液对皮肤刺激具有舒缓功效，但没有明显的差异。
表4受精48小时的斑马鱼胚胎痉挛翻滚的次数
从表4可以看出，各待测样品组的浓度均处于安全浓度范围内，加入不同浓度的4-叔丁基环己醇溶液处理后，受精48小时的斑马鱼胚胎痉挛翻滚的次数均小于模型对照组。基于判断标准：若待测样品组中斑马鱼胚胎痉挛翻滚的次数＜模型组中斑马鱼胚胎痉挛翻滚的次数，且待测样品组中斑马鱼的胚胎痉挛翻滚的次数与空白对照组中斑马鱼胚胎痉挛翻滚的次数无明显差异，则说明待测的化妆品舒缓原料具有舒缓功效。这说明，4-叔丁基环己醇具有舒缓功效。此外，在待测样品组(3)和待测样品组(2)中，斑马鱼胚胎痉挛翻滚的次数明显少于模型对照组，舒缓效果明显；在待测样品组(1)中，斑马鱼胚胎仍有正常的生理活动，但不会出现痉挛翻滚的现象，说明4-叔丁基环己醇在高浓度下具有一定的麻醉作用。因此，4-叔丁基环己醇在低浓度下即可对皮肤有明显的舒缓作用。