基于羟基化共价有机骨架材料分离富集糖皮质激素的方法

本发明属于环境有机污染物检测领域，具体涉及一种基于羟基化共价有机骨架材料分离富集糖皮质激素的方法，更具体为采用羟基化共价有机骨架材料(tapb-dhta-cof)为固相萃取柱填料，结合液相色谱-串联质谱技术测定水中泼尼松、泼尼松龙、氢化可的松、倍他米松、氟米松、曲安奈德。

背景技术：

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

糖皮质激素，又称“肾上腺皮质激素”，是在临床上使用较为广泛的抗炎和免疫抑制剂，在养殖业中主要用于促进动物生长、提高蛋白转化率。随着密集式、工业化养殖模式的发展，糖皮质激素在水产、畜牧业中的需求量不断加大，高频率和过剂量的使用甚至滥用，导致糖皮质激素在环境水体中蓄积，呈“持久性”污染状。水质监测是做好水资源管理与保护的基础，为了准确反映水体污染程度，开展糖皮质激素的检测研究具有重要的现实意义。

糖皮质激素检测方法包括酶联免疫法、液相色谱法、气相色谱-质谱法和液相色谱-串联质谱法等。其中，酶联免疫法容易出现交叉反应及假阳性；液相色谱法抗干扰能力差，且灵敏度不高；气相色谱-质谱法需要进行耗时长的衍生化处理。液相色谱-串联质谱法则不需要衍生化，且多反应监测模式可提供更低的检出限和更好的选择性。环境水体基质复杂，糖皮质激素的残留量多处于痕量甚至超痕量水平，为了得到可靠、灵敏的监测数据，除了需要高灵敏的检测技术，还需要高效的样品前处理技术对糖皮质激素进行分离和富集。

固相萃取具有操作简单、浓缩因子高、吸附剂可循环使用，有机溶剂消耗少等诸多优点，被广泛用于水样中的有机化合物前处理。吸附填料是决定固相萃取效率的关键。

但是发明人研究发现，常规吸附填料对糖皮质激素的吸附效率有限，虽然现有技术公开部分共价有机框架材料进行吸附和检测雌激素，但是吸附效果、检测限、定量限效果均不理想。固相萃取-液相色谱-串联质谱检测方法对于萃取柱的种类、固相萃取-液相色谱-串联质谱三者的协调配合都具有较高的要求。

技术实现要素：

为了解决现有技术存在的常规吸附填料对糖皮质激素的吸附效率有限，检测限、定量限效果均不理想的问题，本发明提出一种基于羟基化共价有机骨架材料分离富集糖皮质激素的方法，将含有丰富羟基位点的共价有机骨架材料作为固相萃取柱填料，利用其与糖皮质激素之间潜在的π-π作用、氢键等多种作用力，实现糖皮质激素的高效分离富集。同时结合高效液相色谱质谱联用仪，实现了对糖皮质激素的高灵敏检测。

具体地，本发明是通过如下所述的技术方案实现的：

本发明第一方面，提供一种羟基化共价有机骨架材料作为糖皮质激素富集材料的应用。

本发明第二方面，提供一种基于羟基化共价有机骨架材料分离富集糖皮质激素的方法，包括采用羟基化共价有机骨架材料对样品中的糖皮质激素进行分离并富集。

本发明一个或多个实施例具有以下有益效果：

1)首次发现羟基化共价有机骨架材料作为固相萃取柱填料对糖皮质激素具有较好的分离富集效果，重复使用性能好，经5次循环使用后，回收率仍然保持在85％以上。

2)通过对固相萃取及液质检测条件的优化，对糖皮质激素的检测限可以达到ng/l级别，灵敏度高、线性范围宽且实用性强。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为本发明实施例1羟基化共价有机框架材料的扫描电镜图。

图2为本发明实施例2上样溶液ph(a)、离子强度(b)、洗脱剂种类(c)及体积(d)对固相萃取效率的影响；

图3为本发明实施例3六种糖皮质激素的mrm色谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

为了解决现有技术存在的常规吸附填料对糖皮质激素的吸附效率有限，检测限、定量限效果均不理想的问题，本发明提出采用羟基化共价有机骨架材料(tapb-dhta-cof)为固相萃取柱填料，结合液相色谱-串联质谱技术测定水体中六种糖皮质激素即泼尼松、泼尼松龙、氢化可的松、倍他米松、氟米松、曲安奈德。本发明提出的检测方法灵敏度高、线性范围宽且实用性强。

具体地，本发明是通过如下所述的技术方案实现的：

本发明第一方面，提供一种羟基化共价有机骨架材料作为糖皮质激素富集材料的应用。

实验发现，所述羟基化共价有机骨架材料对泼尼松、泼尼松龙、氢化可的松、倍他米松、氟米松和曲安奈德这六种糖皮质激素具有较好的吸附或富集作用。

共价有机骨架材料种类繁多，其结构和性能与制备方法息息相关，在本发明中，所述羟基化共价有机骨架材料的制备方法为以1,3,5-三(4-氨基苯基)苯(tapb)和2,5-二羟基对苯二甲醛(dhta)为单体，加入催化剂和溶剂，采用室温溶剂法合成羟基化共价有机骨架材料。

所述催化剂为醋酸，溶剂为乙腈。

优选地，所述1,3,5-三(4-氨基苯基)苯和2,5-二羟基对苯二甲醛的摩尔比为2:2-5，优选为2:3。

优选地，所述1,3,5-三(4-氨基苯基)苯在溶剂中的浓度为4mmol/l，所述催化剂浓度为12mol/l，所述溶剂与催化剂的体积比为10:1。

溶剂是为反应提供一定的反应场所，催化剂用于催化反应，原料、溶剂和催化剂的用量和浓度决定产物的结构和性能，在本发明中，选用上述参数可以制备出对糖皮质激素吸附率高，重复使用性能好的羟基化共价有机骨架材料。

优选地，先加入溶剂，超声后，再加入催化剂，室温静置72h。静置是为了让产物进行结晶生长，形成完善的结构。

优选地，反应结束后还包括离心，洗涤，干燥的步骤。

本发明首次发现特定的羟基化共价有机骨架材料作为固相萃取小柱填料与糖皮质激素具有较好的匹配效果，增加糖皮质激素的吸附效果，重复使用性能好，萃取柱经5次循环使用后，回收率仍然保持85％以上。

本发明第二方面，提供一种基于羟基化共价有机骨架材料分离富集糖皮质激素的方法，包括采用羟基化共价有机骨架材料对样品中的糖皮质激素进行分离并富集。

所述方法包括对待测样品前处理、固相萃取富集及液相色谱串联质谱法进行检测的步骤；

其中，所述固相萃取采用所述羟基化共价有机骨架材料对样品中的糖皮质激素进行分离并富集。

固相萃取通过固相萃取柱进行，所述羟基化共价有机骨架材料作为固相萃取柱填料。

所述固相萃取柱的制备方法包括：称取上述羟基化共价有机骨架材料装填到针筒型固相萃取空柱管内，柱管两端由筛板封住，得到固相萃取柱。

所述固相萃取小柱分别通过甲醇和水进行活化。

优选地，所述甲醇和水等体积；

优选地，所述固相萃取柱预先采用3.0ml甲醇和3.0ml水活化；

优选地，所述固相萃取的上样溶液的ph及离子强度无需调节。

优选地，所述固相萃取的上样速度为1～5ml/min，优选为3ml/min。

优选地，所述固相萃取的洗脱剂为甲醇、乙腈或丙酮的一种或几种。

优选地，所述固相萃取洗脱剂体积为2.0～8.0毫升。

优选地，所述液相色谱分离流动相为0.1％甲酸水溶液和甲醇；流动相流速0.3ml/min；梯度洗脱程序为0～4.0min，50～90％甲醇，4.0～4.1min，90～50％甲醇和4.1～7.0min，50％甲醇；进样体积10μl。

所述质谱检测条件为：电喷雾离子源，正离子模式；离子源温度400℃，加速电压5500v。

通过羟基化共价有机骨架材料可以对样品中的雌激素具有良好的选择吸附性，经富集后的样品具有良好的纯度，通过液-质检测能够获取干净的检测背景，提高检测精确度。通过对固相萃取及液-质检测条件的优化，实现良好的检测灵敏度，检测限可以达到ng/l级别，灵敏度高、线性范围宽且实用性强。

基于羟基与糖皮质激素的含氧基团等之间强烈的氢键作用，我们采用羟基功能化的有机单体2,5-二羟基对苯二甲醛(dhta)作为构筑基元，并采用"bottom-up"的构建策略，制备出羟基化共价有机骨架材料，从而实现了羟基化共价有机骨架材料在糖皮质激素检测中的首次应用。实验结果表明，羟基化共价有机骨架材料在痕量糖皮质激素的样品前处理过程中呈现出较高的分离富集效率，而且可以很好的重复再利用。

下面结合具体的实施例，对本发明做进一步的详细说明，应该指出，所述具体实施例是对本发明的解释而不是限定。

实施例1羟基化共价有机骨架材料固相萃取柱的制备

称取1,3,5-三(4-氨基苯基)苯(0.2mmol)和2,5-二羟基对苯二甲醛(0.3mmol)置于单口烧瓶中，加入50ml乙腈，超声5分钟，加入5ml12mol/l醋酸，搅拌均匀，室温静置72小时。离心，洗涤，干燥得到粉末状固体。该羟基化cof呈球形且粒径均匀，其扫描电镜图见图1。

称取50mg羟基化cof转移至6ml针筒型固相萃取空管内，柱管两端由筛板封住，防止填料外漏，筛板压实得到固相萃取柱。

实施例2基于羟基化cof固相萃取柱的前处理条件优化：

本实施例考察水样ph、离子强度、洗脱剂种类及体积等参数对自制固相萃取柱分离富集糖皮质激素的影响。具体操作为将水样ph分别调整为3.0、5.0、7.0、9.0或11.0，水样中氯化钠的浓度分别设置为0、0.1、0.2、0.4或0.8mol/l，洗脱剂分别为甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯或正己烷，洗脱剂的体积分别设置为2.0、4.0、6.0或8.0ml。

相关优化结果见图2，在选取的考察范围内，水样ph、离子强度和洗脱剂体积对糖皮质激素回收率无明显影响，采用甲醇、乙腈或丙酮为洗脱剂，可确保糖皮质激素被高效解吸。

实施例3水样糖皮质激素残留量的固相萃取-液相色谱-串联质谱分析流程：

羟基化cof固相萃取柱预先采用3.0ml甲醇和3.0ml水活化。采集的水样放置于棕色玻璃瓶中，用玻璃纤维滤膜过滤后加载至自制的羟基化cof固相萃取柱，上样速率为3.0ml/min。完成上样后，用6.0ml甲醇洗脱。洗脱液氮吹至干，用1.0ml甲醇-水(50:50，v/v)复溶。复溶液过滤转移至进样瓶，进样至液相色谱-串联质谱检测。

其中，液相色谱柱为watersxbridgebehc18(100mm×2.1mm×2.5μm)；流动相为0.1％甲酸水溶液和甲醇，流速0.3ml/min，梯度洗脱程序为0～4.0min,50～90％甲醇，4.0～4.1min,90～50％甲醇和4.1～7.0min,50％甲醇；进样体积10μl。

质谱检测条件：电喷雾离子源，正离子模式；离子源温度400℃，加速电压5500v，气帘气35psi，雾化气45psi，辅助气50psi。以正离子多重反应监测模式(mrm)进行检测，以外标法定量分析糖皮质激素，多反应监测模式参数见表1。

色谱检测结果如图3所示，可以看出，七分钟内六种糖皮质激素从c18柱上完全洗脱下来，峰形良好。

表1.六种糖皮质激素mrm模式检测的相关参数

实施例4羟基化cof固相萃取柱的重复使用性能

使用过的羟基化cof固相萃取柱加入3.0ml甲醇液封。将第1次洗脱使用后的固相萃取柱用10ml甲醇再生，再生完毕后，依次采用3.0ml甲醇和3.0ml水活化，上样固定浓度的糖皮质激素溶液，对比回收率，结果见表2。萃取柱经5次循环使用后，回收率仍然保持85％以上。

表2.羟基化固相萃取柱循环使用回收率数据

实施例5测定六种糖皮质激素的工作曲线相关参数

配制浓度为0.5、1.0、5.0、10、25、50、75和100μg/l标准溶液，分别取1.0ml稀释至100ml作为上样溶液，在优化的固相萃取条件下，进行分离富集，并由液相色谱-串联质谱分析。采用权重为1/x²的加权线性拟合，确定线性范围和相关系数，以信噪比为3和10时相应的浓度来确定方法检出限和定量限。

表3.六种糖皮质激素的线性范围、相关系数和方法检出限、定量限

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。