制备附着式冷冻样品的装置及方法

1.本发明总体上涉及冷冻透射电子显微镜的冷冻样品制备领域，具体涉及一种制备附着式冷冻样品的装置及方法。


背景技术：

2.近年来，得益于硬件和软件技术的革新，冷冻电子显微镜技术已经成为结构生物学领域不可或缺的技术手段。当前高端冷冻电镜的信息极限分辨率已经达到1埃左右(如titan krios 300kv)，但是大量电镜数据的分辨率徘徊在6埃附近。主要原因是当前的冷冻样品制备技术仍然存在着一系列的瓶颈问题。
3.冷冻样品制备的最终目的，是为冷冻电镜成像提供超薄液膜以及玻璃态水，具体而言，是将载网上的样品溶液薄膜的温度在极短的时间内降低至-160℃以下，使得液体薄膜直接变成玻璃态薄膜。目前普遍采用的冷冻样品制备方法是投入式冷冻方法。该方法的原理是将溶液状态的生物大分子样品，通过移液枪粘附在载网上之后，利用滤纸夹击形成液态薄膜，然后快速投入到液态乙烷之中，使之在短时间内固化，进而在载网表面形成100纳米左右厚度的玻璃态薄膜。
4.使用投入式冷冻方法和设备进行冷冻制样，存在如下几个主要问题：
5.1.容易造成样品颗粒向气液界面堆积。溶液状态的样品从滴入载网到完全冷冻，耗时超过10秒。在这一过程中，由于液态膜有很大的比表面积，极易导致溶液中的生物大分子吸附于气液界面上而发生颗粒的堆积和取向优势的出现、甚至是部分或全部的蛋白质变性，极大地影响成像分辨率和三维模型的准确性。
6.2.容易导致结晶冰的出现。样品冷冻，需要将样品的水溶液迅速降低至136k(-137℃)，从而得到玻璃态的冰层，如果之后玻璃态水升温至160k(-123℃)，就会出现结晶核，导致重结晶现象的出现。而用于冷冻样品的液态乙烷的温度范围在89.8k(-183.3℃)～184.5k(-88.6℃)之间，由于实验过程是在非密闭空间中进行，液态乙烷与外界存在热交换，也就意味着，实验过程容易出现液态乙烷温度不稳定的现象，从而导致结晶冰的出现。
7.3.外力作用影响样品冰层形貌。由上述步骤1可见，样品溶液是侧滴在载网上，由于重力作用，它将形成上薄下厚的状态，而步骤2是滤纸的大力夹击。这一操作会再次对样品产生外力影响，加剧样品冰层厚度的不均一。由于透射电镜对样品冰层厚度有非常苛刻的要求，因此冰层的形貌将严重影响电镜图像的质量。
8.4.样品溶液的极大浪费。样品溶液非常珍贵且稀少，一次冻样实验仅有几十微升的样品溶液，但步骤2的滤纸夹击，将带走大部分的样品溶液，造成大量的样品浪费。
9.5.外界环境的影响。整个冻样过程暴露在空气中进行，因此外界环境(温度、湿度、粉尘等)会对冻样结果产生明显的影响。
10.6.操作复杂，效率非常低下。一次冻样过程(4～5分钟)只能得到一个载网的样品，而且，整个过程需要人工多次干预，稍有不慎就会出现载网破损和重结晶现象。
11.7.设备和耗材造价昂贵。一台vitrobot mark iv冷冻制样仪的售价在60～100万
元人民币，而一把专用镊子的价格在1万元人民币左右。
12.针对上述问题，本发明提出一种制备附着式冷冻样品的装置和方法，可以从根本上改善样品颗粒向气液界面扩散导致的颗粒变性和颗粒取向优势等问题，同时充分保证样品的利用率和玻璃态薄膜厚度的均一性，并大幅度降低样品出现重结晶或者污染的现象。这将为大量中低分辨率样品、特别是重要的大分子复合物样品的高分辨率成像，提供新的方法。


技术实现要素：

13.本技术的目的在于，以附着式快速冷冻方法代替传统的投入式冷冻方法，大幅度提高冷冻样品的质量和整个冻样过程的效率。
14.为实现上述目的，本技术提出一种制备附着式冷冻样品的装置，包括：冻样单元，用于提供样品冷冻操作的环境；冷却单元，用于存储冷却液，并为所述冻样单元提供冷却液；样品处理单元，设置在所述冻样单元内，用于对样品进行雾化处理；样品承载单元，设置在所述冻样单元内，并与所述样品处理单元对应设置，包括用于盛放金属载网的金属基底，以及管道单元，连接所述冻样单元和实施冷却单元，用于将冷却液从所述冷却单元引导至所述冻样单元。
15.在一示例中，还包括真空单元，与所述冻样单元连接，用于给冻样单元提供真空环境。
16.在一示例中，还包括样品保存单元，设置在所述冻样单元内，用于保存玻璃态后的样品。
17.在一示例中，所述样品处理单元包括恒温器件和雾化器，所述恒温器件为所述雾化器提供恒温环境。
18.在一示例中，所述金属基底是高热导率金属基底。
19.在一示例中，所述金属基底是紫铜基底。
20.本技术还提供一种附着式的冷冻方法，包括：样品溶液置于样品处理单元内，金属载网置于金属基底上；通过真空组件，对冻样单元进行真空处理；冷却单元中的冷却液通过管道单元进入冻样单元内，对所述金属基底进行冷冻处理，所述金属载网与所述金属基底连接，利用金属导热性，冷却的金属基底将低温传至金属载网；启动所述样品处理单元内的雾化器，对所述样品溶液进行雾化处理，形成液体微粒；所述液体微粒附着在所述金属载网上进行冷冻，形成玻璃态薄膜。
21.在一示例中，对所述金属载网进行冷冻处理前，启动恒温器件，使得处于所述样品处理单元内的样品溶液在所述金属载网冷冻处理过程中处于恒温状态。
22.在一示例中，所述样品溶液置于所述样品处理单元内的所述雾化器内。
23.在一示例中，还包括将所述玻璃态薄膜连同所述金属载网转移至样品保存单元。
24.与现有技术相比，采用根据本技术实施例的所提供的装置和方法具有以下有益效果：
25.一、创新性地提出了附着式的冻样技术，与目前的投入式冻样方案相比，其冷冻速率呈现数量级的提升，这将从根本上解决样品颗粒在气液界面的堆积效应，提高冷冻样品的质量；
26.二、样品溶液雾化的设计和使用，将进一步提升冷冻的速率并大幅度节省样品溶液的使用量，此外，样品的雾化能够使得溶液中的颗粒取向无序化，确保了冷冻样品不会出现颗粒的优势取向；而样品溶液的微粒化，能同时确保玻璃态薄膜厚度的均一性。
27.三、密闭冻样单元的设计和真空操作方案的应用，降低了样品污染发生的可能性；
28.四、冷冻基底、多孔基底的设计和使用，保证玻璃态薄膜的质量，同时提升样品制备的效率。
29.五、结构简单，造价低廉；基本功能的实现，设备的成本约为目前市面高端冻样仪的1/10左右；如果加入精确控温、控湿，真空检测设备，造价不会超过当前设备的1/5；
附图说明
30.通过结合附图对本技术实施例进行更详细的描述，本技术的上述以及其他目的、特征和优势将变得更加明显。附图用来提供对本技术实施例的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本技术实施例一起用于解释本技术，并不构成对本技术的限制。在附图中，相同的参考标号通常代表相同部件或步骤。
31.图1示出了根据本技术一实施例的制备附着式冷冻样品的装置示意图。
32.图2示出了根据本技术一实施例的制备附着式冷冻样品的装置剖面示意图。
33.图3示出了根据本技术一实施例的制备附着式冷冻样品的示例性方法流程图。
34.图4a示出了rna噬菌体qbeta冷冻样品的tomography数据。
35.图4b示出了标记物所在位置。
36.图4c示出了样品颗粒所在位置。
37.图5示出了十套数据的颗粒分布统计图。
38.图6a示出了铁蛋白样品的单颗粒成像示意图。
39.图6b示出了铁蛋白样品的三维电子密度示意图(分辨率2.5埃)。
40.图6c示出了铁蛋白样品的三维电子密度与模型的匹配示意图。
具体实施方式
41.下面，将参考附图详细地描述根据本技术的示例实施例。显然，所描述的实施例仅仅是本技术的一部分实施例，而不是本技术的全部实施例，应理解，本技术不受这里描述的示例实施例的限制。
42.如背景技术所述，目前冷冻电子显微镜通用的样品采用投入式冷冻方法，这种方法会产生样品颗粒向汽液界面堆积、出现结晶冰、冰层厚度不均、浪费样品等问题。考虑到液体雾化的性质，以及微小液滴在冷冻金属上的极高冷冻速率，可以采用将样品溶液雾化的方法进行样品的冷冻，因此，本技术利用液体雾化的性质和金属的快速冷冻特性，提出一种新的样品冷冻的方法，其发明构思是将样品进行雾化后附着在冷冻金属上进行冷冻，这样既能提高冷冻速率保证玻璃态水的形成，又可以使得颗粒产生取向无序化，避免了样品厚度不均等问题。
43.本技术使用方法的基本原理是使用金属冷冻代替液体冷冻。有研究表明薄膜液体在冷冻的金属表面从常温液体变成玻璃态的速率可达109k/s，因而这个过程是微秒甚至是纳秒级别的。优选地，本技术中可以采用紫铜作为金属基底的材料，因为，同样在-160℃下，
紫铜的比热容是394j/kg
·
℃，导热系数是386.4w/(m.k)，而现有设计中使用的液态乙烷的比热容只有1.4726j/kg
·
℃，导热系数只有0.226w/(m.k)，可见，如果使用超低温的紫铜对薄膜液体进行冷冻，其冷冻速率较现有手段将出现数量级的提升，这将彻底解决当前基底冻样品制备所面临的瓶颈问题。
44.其次，本技术中使用将样品溶液雾化的方法，取代现有的滤纸夹击的方法产生液体薄膜。优选地，可以采用超声波雾化器作为雾化器，例如，选用由电源控制、振动频率为170khz、孔径为1mm的超声波雾化器。由雾化器产生的0.5～2μm的液体微粒直接喷射到液氮温度的金属载网上，实现急速冷冻。这一方法能够有效加速玻璃态薄膜的形成，避免颗粒的取向优势，同时也有助于控制薄膜的厚度，而且还能够保护载网，避免现有设计中经常发生的载网因外力作用发生破损的现象。
45.基于上述原理，申请人设计了制备附着式冷冻样品的装置，下面将结合附图1对本技术的该装置做进一步的阐述。
46.如图1和图2所示，制备附着式冷冻样品的装置100包括冻样单元110、冷却单元120、样品处理单元130、样品承载单元140、管道单元150、真空单元160、以及样品保存单元170。其中，冻样单元110和冷却单元120通过管道单元150连通，真空单元160与冻样单元110连接，样品处理单元120和样品保存单元170设置在冻样单元110内。
47.具体地，连通冻样单元110和冷却单元120的管道单元150包括：管道151以及设置在管道151两端的管道入口152和管道出口153。其中，管道入口152与冷却单元120连接，管道出口153与冻样单元110连接，冷却单元120中的冷却液可以通过管道入口152流经管道151经过管道出口153进入冻样单元110中，以此使得冻样单元110内的样品处理单元120得到快速冷却。
48.在一些示例中，管道单元150可以设置为基板型以起到对冻样单元110和冷却单元120的支撑作用。可以参考附图2所示，管道单元150呈具有一定厚度的平板状，平板一表面上安装有冻样单元110和冷却单元120，平板内部设有液体流通的管道151，管道151壁与平板表面之间的厚度具有一定厚度，从而可以减缓冷却液流经时的散热速度，例如它们之间的厚度可以为3-20cm，优选地，5-15cm。管道151的一端可以贯穿平板壁，此处可配有密封盖154，当需要排除管道内冷却液时，可以通过此端排出。可以在管道151的侧壁和另一端设有开口，从而形成管道入口152和管道出口153，分别与冷却单元120和冻样单元110连通。
49.与管道单元150的管道入口152连接的冷却单元120，用于存储冷却液，其包括：冷却罐121、冷却阀122、冷却盖123、以及冷却架124。其中，冷却架124用于支撑冷却罐121，在一示例中，冷却架124将冷却罐121支撑在管道单元150上方，可以理解的是，冷却罐121的位置不限于管道单元150的上方，例如，还可以根据操作需要或空间布置被支撑在管道单元150的侧面或其他位置。冷却罐121为具有一定厚度的腔体，便于隔离容纳于其内的冷却液与外界的温度交换。冷却罐121一端设有开口并配有冷却盖123，用于冷却液的添加以及隔离密封；冷却罐121还设有另一个开口，其连接有冷却阀122，冷却阀122的另一端与管道单元150连接，冷却阀122可以控制冷却液从冷却单元120向管道单元150的流通。冷却罐121内盛放的冷却液可以但不限于是液氮，任何现有技术中采用的制冷溶液都可以采用。
50.与管道单元150的管道出口153连接的冻样单元110，用于提供样品操作的环境，其包括：腔室111、腔室第一盖112、腔室第二盖113、开关114以及腔室套115。
51.其中，腔室111设置为具有开口的中空腔体，腔体可以是图示的圆柱形，也可以是多边形的柱体，可以理解的是腔体的形状可以根据需要做变换。腔室111的一端设为配有腔室盖的开口，用于样品处理单元130以及样品的取放。腔室盖上可以设有电源开关114，用于方便的控制腔室111内雾化器131以及恒温器件133的启动和关闭。
52.在一些实施例中，可以根据操作方式的不同设有多个腔室盖，例如，参照附图1所示，腔室盖分为腔室第一盖112和腔室第二盖113，腔室第一盖112的直径小于腔室第二盖113的直径，腔室第一盖112叠放在腔室第二盖113上，当需要小范围的进出腔室111内时，可以开合腔室第一盖112，当需要大范围的进出腔室111时，可以开合腔室第二盖113。
53.腔室111的另一端设为底座并安置在管道单元150上，底座可以设有通孔，用于与冷却单元120的管道出口153连通，以便冷却液的流通。底座内侧可以设为阶梯状，从而形成不同直径的凸台，从而便于样品处理单元130的支撑，可以理解的是此处开口的设置不限于阶梯状，可以采用任何常用的支撑方式，例如凹槽、突起、支架等。
54.腔室111内部可以容纳有样品处理单元120、样品承载单元140以及样品保存单元170，用于为样品提供真空以及冷冻的操作环境。
55.在一示例中，可以在腔室盖内部连接有腔室套115，进一步地，腔室套115可以与腔室第二盖113连接，便于开启第二盖时同时将腔室套115拿起。腔室套115呈两端开口的中空腔体，一端与腔室盖连接，另一端与样品处理单元120连接，使得样品处理单元120处于底座上方。
56.处于腔室套115与底座之间的样品处理单元130包括：雾化器131、雾化罩132、以及恒温器件133。
57.雾化器131设置在雾化罩132内，雾化罩外部与腔室套115连接，使得雾化器131位于底座上方，便于之后引导样品雾化沉积在底座上的基底141。
58.雾化罩132的一端设有恒温器件133，恒温器件133与雾化罩132将雾化器131半封裹，从而为处于雾化器131内的样品提供恒温环境，以保证样品液滴在雾化之前温度保持恒定。雾化罩132的另一端形成为罩形的腔体，笼罩在基底141上方，进一步保证雾化后的样品能够沉积在基底141上。
59.雾化罩132下方对应的设置有样品承载单元140，用于盛放金属载网，其包括：基底141和基底柱142。基底141的厚度为1-20mm，优选地，5-15mm，更优选地，5-10mm。基底141设置在底座上，并通过基地柱142压固在底座。在一示例中，基底141为金属材质，优选地，为紫铜材质，利用其热传导特性，使处于超低温的基底141以微秒甚至是纳秒级的速度将样品液态冷却为玻璃态，同时在实验过程中保持低温状态，使得载网不会受外界温度变化的影响而升温。基底141上设有载物孔，用于安置载网。进一步地，基底141可以设有不止一个载物孔，均匀或对称地设置在基底141上，可以根据需要冷却的样品数量，在各个载物孔上分别放置相应数量的载网，这样能够在提升样品冷冻速率的同时提高样品制备的效率。
60.腔室111的底座或靠近底座的内侧壁可以设有凹槽，便于存放样品保存单元170，应当理解的是样品保存单元的存放方式不限于凹槽，也可采用凸台或支架。当样品冷却为玻璃态后，在腔室111内通入液氮至没过凹槽，将其样品连通载网转移至样品保存单元170中，使得整个操作过程都在液氮的保护中。
61.腔室111还可以在侧壁设有开口，用于与真空单元160连接，从而为腔室内提供真
空环境，以降低样品发生污染的可能性。
62.用于给冻样单元110提供真空环境的真空单元160包括：真空阀161以及动力组件162。真空阀161可以控制冻样单元110内的气压，当真空阀161开启，冻样单元110与动力组件162接通，开启动力组件162后开始抽取腔室111内气体，当腔室111内气压为0后，关闭真空阀161及动力组件162，使腔室111内处于真空状态。
63.可以看出，本技术冷冻装置100的设计采用金属基底对样品进行冷冻，明显优于现有设计中采用液态乙烷冷却样品，结合雾化器对样品进行雾化预处理，使得了样品能够在真空环境中迅速冷却成膜，既大幅提高了冷冻速率，又保证了冷冻后样品层厚度的均一性，同时结构精巧，便于规模化生产加工。
64.结合上述原理和装置的描述，下面通过具体实施例对本技术的冷冻方法做进一步的阐述。
65.图3示出了本技术一实施例附着式的冷冻样品制备的示例性方法流程图。如图3所示，该示例性方法可包括如下步骤：
66.s210，样品及载网的准备。
67.本技术中可用于冷冻的样品溶液包括但不限于生物大分子溶液，可以根据样品溶液的不同选取合适的金属载网，如孔径1.2μm，周期1.3μm的quantifoli 200目纯碳支持膜金网，在一些实施例中也可以选取导热性能良好的铜制载网。
68.将选好的铜制载网放置在冻样单元样品处理单元130内的金属基底141上，之后将10ul左右的样品溶液滴入样品处理单元130内的雾化器131上。在一些实施方式中，金属基底141可为高6mm、直径16mm、带8个载物孔的紫铜基底。利用紫铜基底的高比热容和热导率特性使得样品溶液可以在载网表面以微秒甚至是纳秒级别的速率进行冷冻，使得冷冻速率得到数量级的提升，保证玻璃态水的形成。
69.s220，对冻样单元进行真空处理。
70.样品溶液放置好后，关闭冻样单元110的腔室盖使腔室内保持密封状态，打开真空阀161，启动动力组件162，对冻样单元110进行真空抽取，在一些示中，抽取时间为10-80s，优选地，30～60s。当强室内气压降至-0.08mpa后停止抽取。上述将冻样单元110密闭并进行负压处理的操作方案，可以降低样品发生污染的可能性。
71.s230，对金属载网进行冷冻处理。
72.冻样单元110内处于真空状态后，使用冷却技术将金属基底141进行冷却处理。具体地中，开启恒温器件133，使雾化器131上的样品溶液处于恒温环境，保证样品溶液在金属基底冷却过程中不会被冷冻；之后，打开冷却阀122，通过管道单元150将冷却单元120中的液氮导入至冻样单元110内，使得液氮通过底座的通孔没过金属基底141，从而对金属基底141进行冷却处理。由于金属载网置于金属基底141上，借助金属良好的导热性，冷却的金属基底141将低温传至金属载网，金属载网同时得到了冷却，待金属基底141和金属载网的温度降至液氮温度(即液氮不再剧烈沸腾)，停止液氮的加入，这一过程持续30～60s。
73.s240，对样品溶液进行雾化处理。
74.启动雾化器131，将雾化器131上的样品溶液雾化为直径0.5～2μm液体微粒，并将液体微粒直接喷射到已降至液氮温度基底的金属载网上。样品溶液雾化的设计和使用有助于提升玻璃态薄膜形成的速率、避免样品颗粒取向定势的产生，同时有利于控制样品薄膜
的厚度，并且由于省略了现有技术中滤纸夹击的步骤，将大幅度提高样品的利用率，降低载网因外力导致的破损。
75.s250，雾化微粒的快速附着式冷冻。
76.喷射到基底载网上的液体薄膜附着在超低温的金属基底141上，以微秒甚至是纳秒级别的速率实现急速冷冻，从而在载网表面形成玻璃态薄膜(～100nm)，避免了慢速冷导致的结晶冰现象。在一些示例中，玻璃态薄膜形成的速率，从理论上说可以达到》107k/s的速率，甚至是》108k/s。
77.这种方法创新性地提出了附着式的冻样技术，与目前的投入式冻样方案相比，其冷冻速率呈现数量级的提升，这将从根本上解决样品颗粒在气液界面的堆积效应，提高冷冻样品的质量。
78.s260，冻样单元110冷冻样品的液氮保护。
79.等到雾化样品在金属载网上急速冷冻形成玻璃态的薄膜后(5s～10s)，在冻样单元110内再次通入液氮，例如，可以使液氮液面高于载网3～5cm，保证液氮没过样品承载单元140然后在液氮的保护下将金属载网从金属基底141转移到样品保存单元170内，完成冻样操作。
80.基于上述装置和方法，可以实施以下实施例：
81.实施例1
82.步骤一：根据样品溶液颗粒大小选择一种孔径的铜制载网，打开腔室第一盖112，取出样品处理单元120，将铜制载网放置在样品承载单元140的金属基底141上，并用基底柱142将载网及基底141压固住；
83.步骤二：将样品处理单元120放入腔室111内，取出恒温器件133，露出雾化器131，在雾化器131上滴入10微升捕光蛋白的样品溶液，之后放回恒温器件133；
84.步骤三：关闭腔室第一盖112，打开真空阀161，并开启动力组件162，对腔室111进行抽真空30秒，当腔室111内达到真空状态后，关闭真空阀151及动力组件；
85.步骤四：开启腔室盖上的开关114，启动恒温器件133，使得雾化器131上的样品溶液保持在恒温，例如，20℃，保证之后的雾化不受影响；之后，打开冷却阀150，使得冷却罐121内的液氮从管道入口152经管道151由管道出口153穿过腔室111底座的通孔流入腔室111内，使得液氮没过金属基底141，关闭冷却阀150。利用液氮冷冻约30秒，直至金属基底141和铜制载网均具有液氮温度；
86.步骤五：启动雾化器131，使得样品溶液成为液体微粒，由于雾化器131与铜制载网处于同一轴线上，加上雾化罩132的笼罩，雾化后的样品微粒可以直接附着在铜制载网上；
87.步骤六：样品溶液附着在铜制载网上后等待10秒，使得液体微粒在具有液氮温度的铜制载网上急速冷冻，形成玻璃态的薄膜；
88.步骤七：玻璃态样品薄膜形成后，在冻样单元110内再次通入液氮，使之没过铜制载网4cm，然后打开腔室第二盖113，此时，与腔室第二盖113连接的腔室套115以及其连接的样品处理单元120一起被移开，露出处于浸没在液氮中的样品承载单元140，在液氮保护下将铜制载网连同冷冻后的捕光蛋白样品一起从金属基底141转移到腔室111内的样品保存单元170内，完成冻样操作。
89.实施例2
90.为了验证上述装置和方法的实用性，申请人利用上述装置和方法进行了样品冷冻测试(测试样品为rna噬菌体qbeta)：将冷冻样品用于tomography数据的收集，如图a4所示；再利用三维显示软件imod，显示出样品颗粒在玻璃态薄膜的中位置信息，如图4b和图4c所示。其中，图4a是数据收集的整体情况，图4b是样品上的污染物，可以用来标记玻璃态薄膜的表层位置，图4c是样品颗粒在xy平面以及在xz平面的展示图。可以从图中清楚的看到，冻样颗粒分布在玻璃态薄膜的中间位置，没有出现往气液界面聚集的现象。
91.进一步地，利用上述测试方法，我们统计了十套rna噬菌体样品的测试结果，并用图5的表格中的三条曲线分别表示颗粒分布在接触到薄膜上表面位置的百分比、颗粒分布在玻璃态薄膜中间位置的百分比、颗粒分布在接触到薄膜下表面位置的百分比。可以看出，利用本技术的装置和方法获得的玻璃态薄膜，其中的生物大分子颗粒大部分分布在薄膜的中部位置。
92.此外，参照图6a-6c示出的铁蛋白样品的单颗粒成像示意图、三维电子密度示意图以及三维电子密度与模型的匹配示意图，我们还利用铁蛋白样品进行了冷冻制样和后续的数据收集与结构解析，获得了2.5埃的电子密度。可见，使用本技术的装置和方法能够得到理想分辨率的三维电子密度，获得了高质量的冷冻样品。
93.综上可以看出，本技术采用的技术手段具有如下优点：一、创新性地提出了附着式的冻样技术，与目前的投入式冻样方案相比，其冷冻速率呈现数量级的提升，这将从根本上保证玻璃态水薄膜的形成、解决样品颗粒在气液界面的堆积效应并提高冷冻样品的质量；二、样品溶液雾化的设计和使用，将进一步提升冷冻的速率并大幅度节省样品溶液的使用量。此外，样品的雾化能够使得溶液中的颗粒取向无序化，确保了冷冻样品不会出现颗粒的优势取向；三、密闭冻样单元的设计和真空操作方案的应用，降低了样品污染发生的可能性；四、冷冻金属基底、多孔基底的设计和使用，在大幅度提升冷冻速率的同时提高了样品制备的效率。五、结构简单，造价低廉；基本功能的实现，设备的成本约为目前市面高端冻样仪的1/10左右，如果加入精确控温、控湿，真空检测设备，造价不会超过当前设备的1/5。
94.以上所述的具体实施方式，对本技术的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本技术的具体实施方式而已，并不用于限定本技术的保护范围，凡在本技术的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本技术的保护范围之内。