猪肌肉及肾脏组织中糖草酯及磺草酮残留量的定量测定方法与流程

本发明涉及猪肌肉及肾脏组织中糖草酯及磺草酮残留量的测定方法，涉及到的基质包括猪肌肉和肾脏组织，采用lc-ms/ms检测方法测定上述两种基质中糖草酯及磺草酮的残留量，该方法属于农药残留量的测定
技术领域：
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背景技术：
：随着农业现代化的快速发展，除草剂种类不断更新，为了达到预期的农作物收获效果，很多作物在种植过程中选择使用多种类，大量的除草剂。糖草酯和磺草酮均为除草剂。该发明中的糖草酯可用来取代草甘膦、草特膦等对环境污染大的有机磷除草剂，广泛应用于玉米、小麦、马铃薯、大豆、等双子叶作物田中，具高效、易降解、不易污染环境等优点；磺草酮是一种三酮类除草剂，具有广谱、低毒等特点，对玉米田阔叶杂草和禾本科杂草均有良好的防除效果。磺草酮及糖草酯影响酪氨酸的分解代谢，作为hppd的抑制剂，磺草酮对人体健康存在着潜在威胁，而长期低水平暴露是其威胁人体健康的主要途径。除草剂的使用会破坏生态环境的平衡，在除去杂草的同时也杀死了害虫天敌，或者导致害虫抗药性增强，造成恶性循环。除此之外，除草剂对人类及使用农药周围的生物链如牲畜也会造成危害，有实验数据证明，农药急性中毒会直接导致死亡，慢性危害会减低人体的免疫力，不当的使用同样会造成环境生态失衡和生物健康的危害。每年全球关于农药使用不当造成人员、猪、牛等牲畜中毒和死亡的报道层出不穷，该种报道越多，越要引起相关部门的重视，无论农药的生产还是使用，最终需要通过实验检测数据进行科学支撑和分析，从而完善相关的法律法规。磺草酮已经列入我国国家强制标准gb2763-2019《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》但没有相关的检测方法，糖草酯同样没有检索到相应的食品中残留量测定方法。技术实现要素：本发明的目的是针对现有技术中存在的上述问题，提供一种猪肌肉及肾脏组织中糖草酯及磺草酮残留量的测定方法，以便快速、灵敏、准确的定量测定猪肌肉和肾脏组织等复杂基质中糖草酯及磺草酮的残留量，为相关部门提供科学的数据参考。为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：猪肌肉及肾脏组织中糖草酯及磺草酮残留量的定量测定方法，包括如下步骤：步骤一：样品的提取，取代表性样品，经组织绞碎机粉碎均匀，装入洁净容器内密封，标明标记。称取试样于离心管中，加入适量水进行浸润，加入酸化乙腈20～25ml，超声提取，加入无水硫酸钠，涡旋，离心处理后取下层清液。步骤二：样品的净化，准确吸取适量步骤一所述下层清液于刻度离心管中，加入净化试剂，涡旋，离心并静置，吸取上清液过微孔滤膜，待lc-ms/ms测定。步骤三：绘制工作曲线，取经检测不含糖草酯及磺草酮的猪肌肉和肾脏组织作为空白试样，在其中加入3～5份不同浓度的糖草酯及磺草酮，按照上述步骤一和步骤二进行提取样品净化液供lc-ms/ms测定；重复三次后将所得峰面积与对应浓度做线性回归，以峰面积为纵坐标，对应浓度为横坐标绘制工作曲线并计算出糖草酯及磺草酮在猪肌肉和肾脏组织的回归方程和相关系数。lc-ms/ms检测方法的液相条件为：色谱柱：eclipsec18，100mm×2.1mm，1.7μm；流速：0.25ml/min；柱温：30℃；进样量：10μl；流动相：a相为乙腈、b相为添加10mmol乙酸铵和0.1％甲酸水溶液。梯度洗脱条件如下：时间(min)流动相a(％)流动相b(％)，体积分数0.0208012080510007100081090lc-ms/ms检测方法的质谱条件为：电喷雾质谱检测；多反应监测(mrm)正离子扫描模式；电喷雾电压4000v；雾化气压力40psi；离子源温度350℃；毛细管电压为120～150v；碰撞能量为15ev；糖草酯的母离子为428.2～429.2，子离子分别为84.6～85.6和298.3～299.3；磺草酮的母离子为328.2～329.2，子离子分别为110.4～111.4和138.3～139.3。步骤四：实际样品测定和结果计算，采集待测定猪肌肉和猪肾脏组织，并将猪肌肉和猪肾脏组织按照步骤一和步骤二进行提取和lc-ms/ms检测，记录色谱图和峰面积，并以步骤三中所得的线性方程分别进行数据处理，计算出采集的猪肌肉和肾脏组织糖草酯及磺草酮的含量。所述步骤一中，提取过程中还需添加甲酸至乙腈中使酸性乙腈的质量浓度为0.8％(甲酸：乙腈＝0.8:100)，以提高提取效率。超声提取时间为6～8min。无水硫酸钠的加入量为2～3g，进行盐析。所述步骤二中，净化过程中加入的净化试剂为850mg无水硫酸镁、100mgpsa和150mgc18三种混合试剂。净化过程中的涡旋时间为1～1.5min。本发明的优点和有益效果：本发明方法准确度高，精确度和灵敏度好，杂质较少，作为猪肌肉和肾脏组织糖草酯及磺草酮残留量的测定方法，对糖草酯及磺草酮在猪体内的代谢分布检测提供了很好的指导意义；同时本发明方法首次建立了猪肌肉和肾脏组织糖草酯及磺草酮残留量的测定方法，将液相色谱的梯度时间及质谱测定条件进行了优化，使得目标化合物的灵敏度提高，采用0.8％甲酸提取，可以提高提取效率，回收率能达到gb/t27404要求。该发明方法具有较高的灵敏度和准确度，前处理操作简便，快速，能为食品安全监管提供科学的数据参考。附图说明：图1为空白猪肾脏组织添加0.005mg/kg质量浓度的磺草酮lc-ms/ms多反应监测色谱图。图2为不含磺草酮的猪肾脏组织空白样品lc-ms/ms多反应监测色谱图。图3为空白猪肌肉组织添加0.005mg/kg质量浓度的糖草酯lc-ms/ms多反应监测色谱图。图4为不含糖草酯的猪肌肉组织空白样品lc-ms/ms多反应监测色谱图。图5为以不含糖草酯的猪肾脏组织空白样品为基质配制的工作曲线。图6为以不含磺草酮的猪肾脏组织空白样品为基质配制的工作曲线。图7为以不含糖草酯的猪肌肉组织空白样品为基质配制的工作曲线。图8为以不含磺草酮的猪肌肉组织空白样品为基质配制的工作曲线。具体实施方式：实施例中使用的仪器与试剂：液相色谱串联质谱仪：安捷伦1290-6460；al204-ic型电子天平：梅特勒-托利多仪器有限公司；promax-2020型水平往复振荡器：德国heidolph公司；xh-d型涡旋混合器：上海汗诺仪器有限公司。试剂：色谱纯级甲醇、乙腈及甲酸；乙酸铵(>98.0％)，氯化钠(>99.5％)。标准物质：氨唑草酮、糖草酯、磺草酮：10mg，纯度>98.0％，德国dr.ehrensorfer公司。实施例1：猪肾脏组织中糖草酯及磺草酮残留量的检测：步骤一：取猪肾脏组织约500g，经组织绞碎机粉碎均匀，装入洁净容器内密封，标明标记。称取试样2g，于50ml离心管中，加入5ml水，加入20ml酸化乙腈，超声6min，加入2g无水硫酸钠，涡旋1min，4500r/min离心5min，离心处理后取下层清液备用。步骤二：准确吸取10ml下层清液于15ml刻度离心管中，加入850mg无水硫酸镁、100mgpsa、150mgc18，涡旋1.0min，5000r/min离心5min，吸取1ml上清液过0.2μm的微孔滤膜，得到样品净化液，待lc-ms/ms测定。步骤三：糖草酯、磺草酮标准工作溶液配制。分别准确称取1mg糖草酯、1mg磺草酮标准物质于10ml容量瓶中，用乙腈定容至刻度得100μg/ml标准储备液；移取1.0ml标准储备液于10ml容量瓶中，用甲醇定容至10ml，即10.0μg/ml标准中间液。称取2g经检测不含糖草酯及磺草酮的猪肾脏组织试样，通过上述步骤一、二方法制备空白基质溶液，用空白基质溶液加入糖草酯、磺草酮标准中间工作液，配制成浓度为0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml系列标准工作溶液。打开lc-ms/ms，待仪器参数达到要求后，平衡基线20min，将上述工作液依次进样，每个溶液平行三次，记录反应监测色谱图，以峰面积为纵坐标，对应浓度为横坐标绘制工作曲线，以峰面积与对应浓度进行线性回归分析，得到猪肾组织中糖草酯回归方程y＝18121071.5x-16545.3，变异系数为0.9991；磺草酮回归方程y＝9888822.1x-7266.2，变异系数为0.9993。见图5～图6。色谱条件为：色谱柱：eclipsec18，100mm×2.1mm，1.7μm；流速：0.25ml/min；柱温：30℃；进样量：10μl；流动相：乙腈(a)和添加10mmol乙酸铵和0.1％甲酸水溶液(b)。梯度洗脱条件如下：时间(min)流动相a(％)流动相b(％)，体积分数0.0208012080510007100081090lc-ms/ms检测方法的质谱条件为：电喷雾质谱检测；多反应监测(mrm)正离子扫描模式；电喷雾电压4000v；雾化气压力40psi；离子源温度350℃；毛细管电压为120～150v；碰撞能量为15ev；糖草酯的母离子为428.2～429.2，子离子分别为84.6～85.6和298.3～299.3；磺草酮的母离子为328.2～329.2，子离子分别为110.4～111.4和138.3～139.3。步骤四：实际样品测定和结果计算，喂食添加糖草酯及磺草酮的玉米饲料给猪后，采集猪肾脏组织，并将猪肾脏组织按照步骤一和步骤二进行提取和lc-ms/ms检测，检出的色谱峰的保留时间与标准样品相一致；样品中目标化合物的两对离子相对丰度与浓度相当标准溶液的相对丰度偏差不超过30％，同时满足上述两个条件，记录色谱图和峰面积，并以步骤三中所得的线性方程分别进行数据处理，计算出采集的猪肾脏组织中糖草酯及磺草酮的含量。在不含糖草酯、磺草酮的猪肾组织中添加0.005、0.01、0.02mg/kg3个浓度水平的3种标准溶液，见图1～图2。按照上述前处理方法进行处理，每个添加水平进行6次平行实验，计算得到猪肾脏组织中糖草酯回收率范围为82.3％～105.7％，变异系数为2.3％～8.1％；磺草酮回收率范围为76.7％～103.9％，变异系数为1.9％～6.4％。实施例2：猪肌肉组织中糖草酯及磺草酮残留量的检测：步骤一：取猪肌肉组织约500g，经组织绞碎机粉碎均匀，装入洁净容器内密封，标明标记。称取试样2g，于50ml离心管中，加入5ml水，加入25ml酸化乙腈，超声8min，加入3g无水硫酸钠，涡旋1min，4500r/min离心5min，离心处理后取下层清液备用。步骤二：准确吸取10ml下层清液于15ml刻度离心管中，加入850mg无水硫酸镁、100mgpsa、150mgc18，涡旋1.5min，5000r/min离心5min，吸取1ml上清液过0.2μm的微孔滤膜，得到样品净化液，待lc-ms/ms测定。步骤三：糖草酯、磺草酮标准工作溶液配制。准确称取1mg糖草酯、1mg磺草酮标准物质于10ml容量瓶中，用乙腈定容至刻度得100μg/ml标准储备液；移取1.0ml标准储备液于10ml容量瓶中，用甲醇定容至10ml，即10.0μg/ml标准中间液。称取2g经检测不含糖草酯及磺草酮的空白猪肌肉组织试样，通过上述步骤一、二方法制备空白基质溶液，用空白基质溶液加入糖草酯、磺草酮标准中间工作液，配制成浓度为0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml系列标准工作溶液。打开lc-ms/ms，待仪器参数达到要求后，平衡基线20min，将上述工作液依次进样，每个溶液平行三次，记录反应监测色谱图，以峰面积为纵坐标，对应浓度为横坐标绘制工作曲线，以峰面积与对应浓度进行线性回归分析，得到猪肉组织中糖草酯回归方程y＝3332310.7x-3824.8，变异系数为0.9993；磺草酮回归方程y＝8460608.6x-19285.5，变异系数为0.9995。见图7～图8。色谱条件为：色谱柱：eclipsec18，100mm×2.1mm，1.7μm；流速：0.25ml/min；柱温：30℃；进样量：10μl；流动相：乙腈(a)和添加10mmol乙酸铵和0.1％甲酸水溶液(b)。梯度洗脱条件如下：时间(min)流动相a(％)流动相b(％)，体积分数0.0208012080510007100081090lc-ms/ms检测方法的质谱条件为：电喷雾质谱检测；多反应监测(mrm)正离子扫描模式；电喷雾电压4000v；雾化气压力40psi；离子源温度350℃；毛细管电压为120～150v；碰撞能量为15ev；糖草酯的母离子为428.2～429.2，子离子分别为84.6～85.6和298.3～299.3；磺草酮的母离子为328.2～329.2，子离子分别为110.4～111.4和138.3～139.3。步骤四：实际样品测定和结果计算，喂食添加糖草酯及磺草酮的玉米饲料给猪后，采集猪肌肉组织，并将猪肌肉组织按照步骤一和步骤二进行提取和lc-ms/ms检测，检出的色谱峰的保留时间与标准样品相一致；样品中目标化合物的两对离子相对丰度与浓度相当标准溶液的相对丰度偏差不超过30％，同时满足上述两个条件，记录色谱图和峰面积，并以步骤三中所得的线性方程分别进行数据处理，计算出采集的猪肌肉组织中糖草酯及磺草酮的含量。在不含糖草酯、磺草酮的猪肌肉组织中添加0.005、0.01、0.02mg/kg3个浓度水平的3种标准溶液，见图3～图4。按照上述前处理方法进行处理，每个添加水平进行6次平行实验，计算得到猪肌肉组织中糖草酯回收率范围为80.6％～106.3％，变异系数为2.5％～6.1％；磺草酮回收率范围为78.2％～102.5％，变异系数为3.2％～7.2％。将不同浓度的糖草酯、磺草酮基质标准工作溶液进行lc-ms/ms测定，以3倍信噪比作为检出限的标准，2种目标物的检出限分别为糖草酯：0.00082mg/kg、磺草酮：0.00088mg/kg。本发明方法准确度高，精确度和灵敏度好，杂质较少，作为猪肌肉和肾脏组织糖草酯及磺草酮残留量的测定方法，对糖草酯及磺草酮在猪体内的代谢分布检测提供了很好的指导意义；同时本发明方法首次建立了猪肌肉和肾脏组织糖草酯及磺草酮残留量的测定方法，将液相色谱的梯度时间及质谱测定条件进行了优化，使得目标化合物的灵敏度提高，采用0.8％甲酸提取，可以提高提取效率，回收率能达到要求。该发明方法具有较高的灵敏度和准确度，前处理操作简便，快速，能为食品安全监管提供科学的数据参考。以上显示和描述了本发明的基本原理，主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围有所附的权利要求书及其等效物界定。当前第1页12