一种基于酶抑制法的电化学检测芯片、检测试剂盒及检测系统的制作方法

1.本发明属于电化学检测芯片技术领域，具体涉及一种基于酶抑制法的电化学检测芯片以及包含有该芯片的检测试剂盒及检测系统。


背景技术：

2.通过酶抑制法对目标物进行分析的原理如下：待测目标物对酶产生抑制，影响到酶与相应底物的反应，使得通过底物变化输出的相应信号也受到影响，该输出信号与待测目标物浓度呈反比，从而反推出待测目标物的存在或待测目标物的量。该法广泛应用于有机磷或氨基甲酸酯类农药的检测，也可以用于对食品中防腐剂苯甲酸的测定(见李庆波“基于无机/生物有机纳米杂化膜电极的传感、抑制动力学研究及其应用”扬州大学硕士论文)或对l-半胱氨酸的测定(见analytica chimicaacta 399(1999)287
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293)等。只要发展出了酶抑制体系及相应的酶与底物反应体系，就有可能开拓新的应用场景。这些场景中，二步反应是必须的，其中酶抑制反应是首先进行的反应，之后剩余的酶再与底物发生反应，从而输出信号。
3.以有机磷或氨基甲酸酯类农药的检测为例，酶抑制法的原理脱胎于前述农药的杀虫机理：有机磷和氨基甲酸酯农药能抑制昆虫神经系统中乙酰胆碱酯酶的活性，从而造成神经传导介质乙酰胆碱的积累，影响昆虫正常的神经传导，使其中毒而死，有机磷和氨基甲酸酯类农药对酶的抑制率与其浓度成正相关。基于酶抑制法原理，提取自蔬果样品的提取液与乙酰胆碱酯酶、麦麸酯酶等酶接触，若提取液中没有农药残留或量极少，则酶的活性不被抑制，可以水解相应的底物；反之，若农药残留量比较高，则酶的活性被抑制，底物的被水解量明显降低。通过检测底物水解的量，能够输出可供观测的信号，从而定性农药残留的存在，或者通过计算出抑制率，进而定量推算出样品提取液中农药的残留量。
4.基于上述原理，实践中已采用酶抑制试纸法(速测显色卡)和酶抑制分光光度法来对有机磷农药及氨基甲酸酯类农药进行检测，但前者仅为定性检测，后者仪器体积较大，且定量结果易受到蔬果中色素的干扰。
5.近年来，基于酶抑制原理的电化学检测农药残留物方法受到关注。电化学法输出信号快速，有望成为现场检测的有效手段。同样地，基于酶抑制原理的电化学检测至少需要两步反应：首先需要将含有农药残留物的液体与电极上固定的酶接触，使农药与酶发生第一反应达到一定时间，以对酶产生抑制，再使用适量底物与余留的酶发生第二反应，底物被酶水解可产生电活性物质，基于此可输出可供检测的电信号。农药量越高，酶抑制越多，底物被水解的量越少，输出的电信号越弱。
6.中国专利公开号cn104198559b公开了一种用于有机磷农药检测的电化学生物传感器，在实施例中明确，将固定有乙酰胆碱酯酶的丝网印刷电极置于一定浓度的有机磷农药溶液中抑制15min后，再置于一定浓度的底物-氯化硫代乙酰胆碱溶液中，测定稳态电流，从而计算有机磷的含量。该方法中，酶电极需前后两次置于不同溶液中，因此，在现场检测
时，除了需要准备来自蔬果的样品提取液外，还需要提前准备底物溶液，且两种溶液处于不同容器内，固定有酶的电极依次接触两种溶液方能达成测试目标。
7.中国专利公开号cn101587092a公开了一种快速检测有机磷类农药残留的便携式电化学生物传感器，实施例中披露了另一种液体与酶电极接触的方法：在固定有乙酰胆碱酯酶的丝网印刷电极之上固定反应池，先向反应池中加入10μl对照液或样品提取液，放置15min以上，然后再向反应池中滴加2μl底物溶液，2min后读取响应电流信号。在该方法中。虽然一个酶电极之上的反应池只有一个，分次容纳两种样品，但两种样品仍旧需要分别准备，依次滴加。
8.上述方案中均需要两次滴加相应溶液，操作中存在不便；上述方法所存在的另一个问题是：溶液态的底物不稳定，易于失活，底物溶液必须新鲜配置后使用，否则将导致结果误差，这无疑对该类方法的现场使用性能形成了显著的制约。因此，本领域中仍需要发展操作简单、便携、快速、准确、可定量的检测装置。


技术实现要素：

9.本发明是为解决上述不足进行的，提供了一种基于酶抑制法的外置底物载体片的新型便携式电化学检测芯片，以克服本领域中现存的问题。该芯片将与酶发生第二反应的底物预制在一载体片内，并呈固态形式，预制的有底物的载体片与加样孔先呈分离状态，之后在必要时浸入至加样孔的溶液中释放出底物以进行反应，这种技术方案可以节省底物用量，增强芯片携带和使用时的便捷性，并保证了检测结果的准确性和芯片的时效性。
10.为说明本发明，基于酶抑制法对目标分析物进行电化学检测的两步反应被定义如下：
11.第一反应：目标分析物与酶发生的反应。若待测样品提取液中含有目标分析物，则该第一反应的发生使得酶受到抑制。
12.第二反应：底物与酶发生的反应。在酶催化下使底物发生改变，改变后的产物具有电化学活性，可被采集到相应电信号。该反应须在第一反应进行一定程度之后才开始进行，因此在此处称为第二反应。
13.上述基于酶抑制法的电化学检测方法适用场景不受限制，只要发展出了酶抑制体系及相应的酶与底物反应体系，均可利用该法。如反应体系为背景技术部分提及的有机磷或氨基甲酸酯类农药的底物-酶体系，苯甲酸或l-半胱氨酸的底物-酶体系等。
14.一些实施方案中，当检测有机磷农药或氨基甲酸酯农药时，可用的酶体系包括但不限于乙酰胆碱酯酶体系、丁酰胆碱酯酶体系、酪氨酸酶体系、b类植物酯酶体系等。
15.当固定于工作电极上的酶为乙酰胆碱酯酶时，底物可选自氯化硫代乙酰胆碱，碘化硫代乙酰胆碱；当固定于工作电极上的酶为丁酰胆碱酯酶时，底物可选自氯化硫代丁酰胆碱，碘化硫代丁酰胆碱；当固定于工作电极上的酶为b类植物酯酶，例如麦麸酯酶时，底物为-乙酸萘酯；当固定于工作电极上的酶为酪氨酸酶时，底物可选自邻苯二酚或1,2萘醌-4-磺酸。
16.一个优选的实施方案中，所述的目标分析物为有机磷或氨基甲酸酯类农药；所述的底物为氯化硫代乙酰胆碱；对应的固定于工作电极上的酶为乙酰胆碱酯酶。
17.在一些实施方案中，为了提高反应灵敏度，工作电极上还固定有电子媒介体材料。
电子媒介体能够降低酶催化底物水解产生的产物的氧化电位，提高电极的抗干扰能力和检测的灵敏度。同时，一些电子媒介体在电极表面的氧化非常迅速，能极大地缩短检测时间。例如普鲁士蓝或铁氰化钾。
18.一个优选的实施方案中，所述的目标分析物为有机磷或氨基甲酸酯类农药；所述的底物为氯化硫代乙酰胆碱；对应的固定于工作电极上的酶为乙酰胆碱酯酶；电子媒介体材料为普鲁士蓝。普鲁士蓝可大大降低乙酰胆碱酯酶催化氯化硫代乙酰胆碱水解产生的氯化硫代胆碱的氧化电位，且峰形好，峰电流大，有效提高检测的灵敏度。
19.本发明第一方面，提供了基于酶抑制法的电化学检测芯片，其结构基于上述原理设计而成，具体结构如下，包括：
20.电极芯片(1)，至少包括工作电极(11)和对电极(12)；所述工作电极(11)上至少固定有电化学检测用的酶；
21.外壳机构(2)，包裹在所述电极芯片(1)外并设置有电极引线引出口，上表面与所述工作电极(11)相对应位置处设置有加样孔(221)，以供含有目标分析物的液体样品加入；该加样孔外区域设置预制有固态底物的载体片(3)，以及待酶与加样孔中含有目标分析物的液体样品反应一定时间后，带动所述载体片(3)伸入加样孔内的辅动机构。
22.本发明中，所述电极芯片(1)上还设置有参比电极(13)，三个电极通过丝网印刷工艺制作于基板上形成电极芯片，并且三个电极的引线集合于芯片的前端。
23.载体片(3)与加样孔(221)先呈分离状态，待酶与加样孔中的液体样品进行的第一反应完成一定程度时，再将载体片浸入至加样孔的溶液中，进行第二反应。此时，预制在所述载体片(4)处的固态底物可被溶出，用于与所述的酶进行第二反应以输出电信号。
24.本发明提供的简单实施方案中，预制有固态底物的载体片(4)单独封装，必要时拆开封装袋，将载体片投入加样孔中。此时辅动机构为测样人员的手，操作上或许存在些许不便，但仍旧可以解决相关技术问题。
25.本发明提供的一种优选实施方案中，外壳机构(2)处设置有相连接的外盖(3)，外盖(3)的相应位置固定有预制了固态底物的载体片(4)，当外盖(3)与外壳贴合时，载体片(4)伸入加样孔(221)中。
26.优选的，外壳机构(2)包括可拆卸连接的下盖(21)和上盖(22)。下盖(21)对电极芯片(1)进行封装并设置有电极引线引出口；上盖(22)设置加样孔(221)。
27.辅动机构为以翻折形式安装在上盖(22)上的外盖(3)，其上设置有单独封装的载体片(4)。该载体片(4)位置与加样孔相对应，当外盖(3)翻折与上盖(22)贴合时，载体片(4)被置于加样孔(221)内，与加样孔(221)的位置重合。
28.进一步优选，载体片(4)以凸出形式固定于外盖(3)上，外表面被洁净膜封闭。当需要将载体片(4)贴合到外壳(2)上时，再撕去洁净膜，以便在反应前保持底物区干净。
29.进一步优选，为了实现上下盖间的连接，下盖(21)与上盖(22)通过多个卡扣和卡槽相配合的方式实现安装。具体的，下盖(21)的周边部上均匀设置有多个卡槽，上盖(22)底端对应设置有多个卡扣。
30.为了实现上盖(22)与外盖(23)间的紧密贴合，上盖(22)与外盖(23)上分别设置有相互配合的卡扣。这样可以使芯片在初始使用前保持干净，当卡扣打开时，加样孔(221)暴露，可以用于接受液体样品。
31.本发明提供的另一种优选实施方案中，外壳机构(2)结构不变，包括下盖(21)和上盖(22)，上盖(22)设置加样孔(221)。
32.辅动机构(5)滑动安装在上盖(22)上，靠近加样孔(221)的一端通过柔性连接带(6)连接载体片(4)。该载体片(3)平铺设置在上盖(22)上，位于辅动机构(5)以及加样孔(221)之间。
33.优选的，辅动机构(5)包括设置在壳体上的滑槽(51)以及安装在该滑槽内的滑板(52)，该滑板(52)上表面设置有拨动凸条(521)，下表面设置有滑块(522)。当第一反应完成后，推动滑板(52)在滑槽内移动，载体片(4)被向前推动并下折进入加样孔(221)中。柔性连接带(6)优选为可折活页。
34.本方案中，载体片(4)外表面依旧被洁净膜封闭，当需要将载体片(4)移动到加样孔处时，再撕去洁净膜，以便在反应前保持底物区干净。
35.本优选方案的变形方案中，还可以在外壳上盖中加工一个空腔，将载体片(4)内置于空腔中，由滑动块推动至加样孔中。
36.本发明的底物预制方式如下：采用底物溶液喷涂、注入等方法将底物预制于载体片中，干燥后使用，载体片材料包括聚酯纤维素膜、玻璃纤维素膜等，优选聚酯纤维素膜。
37.酶固定于工作电极的方法可以有多种，包括但不限于涂敷、包埋、沉积等，采用已知方法固定即可，只要不影响酶的反应活性。
38.采用上述芯片检测时，当目标待检物提取液被注入芯片的加样孔，工作电极上的酶先与提取液中的目标待检物结合进行第一反应，间隔一定时间之后，将预制有底物的载体片贴合或推动到加样孔处，该载体片浸入加样孔的液体中，底物溶出，与酶发生第二反应，采集电信号即可获得检测结果。
39.本发明的第二方面，还提供了一种基于酶抑制法的电化学检测试剂盒，包括电化学检测芯片以及进行检测分析所需的缓冲溶液、提取溶液或标准品。该电化学检测芯片如上所述。
40.本发明的第三方面，提供了一种基于酶抑制法的电化学检测系统，包括：上述电化学检测试剂盒以及与其连接的电化学检测设备。
41.本发明的有益效果如下：
42.首先，本发明通过设置预制有底物的载体片，并且将该载体片设置在加样孔外区域上，既满足了基于酶抑制法对目标分析物进行电化学检测的两步反应需求，又克服了需要额外携带、额外加入底物溶液的麻烦，减少了底物使用，延长了预制底物的时效性，增强了检测的一致性和稳定性，检测方法能够更好地满足便捷、快速检测的需求。
43.其次，本发明装置在进行检测时，先通过加样孔滴加待检样品进行第一反应，待第一反应进行一定时间后，通过辅动机构将预制有底物的载体片伸入加样孔内，极大增强了操作的便捷性和稳定性，有利于现场快速检测。试验表明，本发明的电化学芯片检测敌敌畏和呋喃丹样品的检测限与国家标准相比更低，显示了更高的检测灵敏度；对于混合农药也可以得出相当灵敏的检测效果。
44.第三，本发明电化学检测芯片小巧，便于安全携带，易于与电化学检测设备对接联通。
附图说明
45.图1为本发明电化学检测芯片的结构示意图一，其中(a)为整体结构示意图，(b)为电极芯片的结构示意图；
46.图2为本发明电化学检测芯片的上盖以及辅动机构另一种结构示意图，其中(a)为上盖、辅动机构以及载体片的分体结构示意图，(b)为上盖、辅动机构以及载体片的初始组装结构示意图，(c)为载体片被伸入加样孔内时的状态示意图；
47.图3为电化学法检测敌敌畏的标准曲线；
48.图4为电化学法检测呋喃丹的标准曲线；
49.图5为电化学法检测有机磷混标(16种)农药标准品的标准曲线；
50.图6为电化学法检测氨基甲酸酯类混标农药标准品的标准曲线；
51.附图标记
52.1电极芯片；11工作电极；12对电极；13参比电极；21下盖；22上盖；221加样孔；32卡扣扣合凹槽；3外盖；31卡扣；4预制有底物的载体片；5辅动机构；51滑槽；52滑板；521拨动凸条；522滑块；6可折活页
具体实施方式
53.下面结合本发明的附图和实施例对本发明的实施作详细说明，以下实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
54.实施例1、电化学检测芯片结构
55.图1显示为本发明电化学检测芯片的其中一种结构示意图。如图1所示，检测芯片包括电极芯片1和包裹电极芯片的外壳机构2，外壳的一端连接有外盖3。
56.电极芯片1包括工作电极11以及分别位于该工作电极11两侧的对电极12以及参比电极13，三者通过丝网印刷工艺制作于基板上形成电极芯片，三个电极的引线集合于芯片的前端，引线从外壳的前端开口处伸出。工作电极11上固定有电化学检测用的酶。
57.外壳机构2包括可拆卸开的下盖21和上盖22。下盖21对电极芯片1进行封装并设置有电极引线引出口；上盖22对应于工作电极11处设有一个加样孔221，以供含有目标分析物的液体样品加入。
58.外盖3可翻折地安装在上盖22上，相应位置以凸出形式固定有预制了底物的载体片4，当外盖3与外壳贴合时，载体片4伸入加样孔221中。为了实现二者之间的紧密贴合，上盖22靠近前端的位置还设置有一个用于卡扣扣合的凹槽32，对应地，外盖3相应位置设置有一个卡扣31，当两者扣合时，外盖3和上盖22贴合紧密度较高，可以使芯片在初始使用前保持干净，当卡扣打开时，加样孔221暴露，可以用于接受液体样品。
59.本实施例中，载体片优选为聚酯纤维素膜，购自上海杰一生物技术有限公司，型号为ma0280，厚度为0.33mm，取适合大小平置，将100mm的氯化硫代乙酰胆碱pbs缓冲液5μl滴于其上，自然晾干后，固定于外盖3相应位置上。载体片也可以采用玻璃纤维素膜，例如gl0145。经测试，聚酯纤维素膜中的底物溶出更快。
60.采用上述芯片检测时，首先取出芯片，向上扳动外盖解开卡扣，暴露加样孔，当目标待检物提取液被注入芯片的加样孔，工作电极上的酶先与提取液中的目标待检物结合进
行第一反应，间隔一定时间之后，重新扣合卡扣，预制有底物的载体片再次贴合到加样孔处并浸入加样孔的液体中，底物溶出，与酶发生第二反应，采集电信号即可获得检测结果。
61.本发明另一种结构形式的电化学检测芯片，摒弃了外盖的结构设计，将辅动机构设置在上盖上。图2涉及本发明电化学检测芯片的另一种形式的上盖、辅动机构以及载体片的结构示意图。
62.如图2所示，上盖22对应于工作电极11处设有一个加样孔221，以供含有目标分析物的液体样品加入。
63.辅动机构5滑动安装在上盖22上，靠近加样孔221的一端通过可折活页6连接载体片4。该载体片3平铺设置在上盖22上，位于辅动机构5以及加样孔221之间。
64.辅动机构5包括设置在壳体上的滑槽51以及安装在该滑槽内的滑板52，该滑板52上表面设置有拨动凸条521，方便施力，下表面设置有滑块522。当第一反应完成一定程度后，推动滑板52在滑槽内移动，载体片4被向前推动并下折进入加样孔221中完全浸入加样孔的溶液中，便于底物更好溶出。
65.实施例2、丝网印刷电极芯片的制作
66.丝网印刷电极的工作电极和对电极为碳电极，参比电极为ag/agcl电极，采用常规的丝网印刷技术制作即可。例如，可以采用以下制作步骤：
67.(1)定制孔径合适的网板，清洗干净，倒入适量的银浆到网框中，将pet基底摆放在定位好的机台上，放下网框，控制印板与承印物的距离在5-8mm之间。调节回墨刀的高度，与网板水平为宜，调节刮刀的高度，刮刀与网板整体保持在15～20
°
角。在机器上设置好印刷参数，放置pet基底，回墨刀把银浆铺平印刷导线及触点，从网板的镂空图文部分的丝网孔中漏印到pet基底上，刮刀刮过后丝网回弹与pet基底分离。抬起网框，从机台上取出pet基底；
68.(2)银浆干燥以后，更换网板，在工作电极和对电极区域套印一层碳浆
69.(3)碳浆干燥后，更换网板，在参比电极区域套印氯化银浆；
70.(4)更换网板，在网框上加绝缘油墨，对齐网板，在pet基底上印刷一层绝缘油墨，120℃下烘烤15min，完成整个电极的印刷。
71.实施例3在工作电极上固定普鲁士蓝和乙酰胆碱酯酶
72.为了进一步增强电信号，在固定乙酰胆碱酯酶前，工作电极上可先固定一层电子媒介体材料-普鲁士蓝或铁氰化钾。普鲁士蓝可大大降低乙酰胆碱酯酶催化氯化硫代乙酰胆碱水解产生的氯化硫代胆碱的氧化电位，且峰形好，峰电流大，可有效提高检测的灵敏度。
73.普鲁士蓝通过电沉积的方法沉积于丝网印刷工作电极表面，具体方法如下：工作电极表面滴加电沉积溶液，通过时间电流曲线i-t电沉积普鲁士蓝，沉积完后甩掉电沉积溶液，即可在工作电极表面形成普鲁士蓝膜，之后在hcl和kcl的混合溶液中通过循环伏安法进一步活化。活化好的电极用纯净水轻轻冲洗一次，在100℃的烘箱中烘烤1h即可。其中，电沉积液的配方为(1.5ml体系):20mm的fecl3.6h2o取150μl，20mm的k3[fe(cn)6]取150μl，0.1m的hcl取750μl，0.3m的kcl取250μl，再加纯净水200μl。其中活化溶液的配置为：0.1m kcl溶液和10mm hcl溶液等比例混合。
[0074]
固定乙酰胆碱酯酶的方法如下：
[0075]
将0.2％的nafion117、0.1mg/ml的羧基化多壁碳纳米管、8mg/ml的乙酰胆碱酯酶按照1：1：3的体积比混合后，取混合溶液5μl滴加于工作电极表面，在25℃，55％-65％的湿度范围内干燥。固定好酶的电极芯片置于4℃保存。
[0076]
nafion117购自sigma公司；乙酰胆碱酯酶购自sigma公司或采用常规方法制备；多壁碳纳米管购自深圳市纳米港有限公司。羧基化多壁碳纳米管自行制作，制作方法为：多壁碳纳米管放入浓盐酸溶液中浸泡2天，抽滤，之后用0.1m的naoh洗涤多次，再用超纯水洗涤多次，干燥后，取1g多壁碳纳米管，溶于90ml浓硫酸，超声分散，再加入30ml浓硝酸，60-80度油浴10h。4000rpm离心10min-20min，弃上清液。在沉淀物中加入浓硫酸和双氧水混合液(浓硫酸：双氧水＝4：1)，70℃反应30min。4000rpm转速下离心10min，弃上清液，再用超纯水清洗数次，干燥即可。采用羧基化多壁碳纳米管一方面可有效负载酶，增加酶固定量，从而提升酶催化性能，另一方面为酶分子提供三维空间，可更好地维持其生物功能，还有助于增强导电性能。
[0077]
实施例4农药标准品检测
[0078]
取上述图1所示的检测芯片，平置，丝网印刷电极的电极引线触点与电化学检测装置相应触点联通，电化学检测装置采用辰华电化学工作站(型号chi660e)。打开外盖，暴露加样孔，向加样孔中滴加空白溶液(pbs缓冲溶液)50μl，联通电化学检测装置，加样后600s时，扣合外盖，使预置了底物的载体片与样品溶液接触，立即进行时间-电流曲线测试，测试电位：0.1v，测试时间：30s，记录下第30s时对应的电流值i0。其中，pbs缓冲溶液为ph 7.4磷酸盐缓冲溶液。
[0079]
配置不同浓度的农药标准品pbs缓冲溶液，向上述图1所示的检测芯片的加样孔中分别滴加不同浓度的农药标准品溶液50μl，联通电化学检测装置，加样后600s时，扣合外盖，使预置了底物的载体片与样品溶液接触，立即进行时间-电流曲线测试，测试电位：0.1v，测试时间：30s，记录下第30s时对应的电流值ii。
[0080]
农药的抑制率ir＝(i
0-ii)/i0。
[0081]
本试验测试了以下标准品：敌敌畏、呋喃丹、有机磷混标(16种)农药、氨基甲酸酯类混标农药。均购自河南省万佳标准物质研发中心有限公司。
[0082]
检测敌敌畏时，浓度分别为：0.1ng/ml，0.3ng/ml，1ng/ml，3ng/ml，10ng/ml，30ng/ml，测出对应的电流信号，计算ir，标准曲线如图3所示，可得拟合方程为：
[0083][0084]
可检出0.1ng/ml浓度的敌敌畏。若以50％抑制率计算检出限，则检出限为1.12ng/ml，比照国家标准“蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的快速检测”(gb/t5009.199—2003)中所列的方法，换算为重量比，为0.0056mg/kg，仅是上述国标的酶抑制率(分光光度法)对敌敌畏的检出限(0.1mg/kg)的约1/18，检测灵敏度更高。
[0085]
检测呋喃丹时，浓度分别为：0.1ng/ml，0.3ng/ml，1ng/ml，3ng/ml，10ng/ml，30ng/ml，100ng/ml，测出对应的电流信号，计算ir，标准曲线如图4所示，可得拟合方程为：
[0086]
[0087]
可检出0.1ng/ml浓度的呋喃丹。若以50％抑制率计算检出限，则检出限为1.45ng/ml，比照国家标准“蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的快速检测”(gb/t5009.199—2003)中所列的方法，换算为重量比，为0.0072mg/kg。是上述国标的酶抑制率(分光光度法)对呋喃丹的检出限(0.05mg/kg)的1/7，检测灵敏度更高。
[0088]
检测有机磷混标(16种)农药标准品时，浓度分别为：0.3ng/ml，1ng/ml，3ng/ml，10ng/ml，测出对应的电流信号，计算ir，标准曲线如图5所示，可得拟合方程为：
[0089][0090]
可检出0.3ng/ml浓度的16种有机磷混标农药。若以50％抑制率计算检出限，则检出限为1.116ng/ml，比照国家标准“蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的快速检测”(gb/t 5009.199—2003)中所列的方法，换算为重量比，为0.0056mg/kg。
[0091]
检测氨基甲酸酯类混标农药标准品时，浓度分别为：0.1ng/ml，0.3ng/ml，1ng/ml，3ng/ml，10ng/ml，30ng/ml，100ng/ml，测出对应的电流信号，计算ir，标准曲线如图6所示，可得拟合方程为：
[0092][0093]
可检出0.1ng/ml浓度的氨基甲酸酯类混标。若以50％抑制率计算检出限，则检出限为6.74ng/ml，比照国家标准“蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的快速检测”(gb/t 5009.199—2003)中所列的方法，换算为重量比，为0.0337mg/kg。
[0094]
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本技术权利要求所限定的范围内。