一种特异性检测体系的食品中四环素检测方法

本发明涉及食品安全检测技术领域，特别是涉及一种基于核壳型上转换纳米材料食品中四环素检测方法。

背景技术：

四环素是光谱抗生素，能够抑制细菌的蛋白质合成，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有抗菌作用，因此被广泛应用于人类治疗，畜牧业和水产养殖。但是由于四环素的不合理使用，使四环素残留于各种食品中，包括牛奶，鱼，肉，蛋和蜂蜜等，对人体健康造成严重损害，例如肝损伤，牙齿泛黄，四环素抗性和肠道菌群失调等。四环素的残留检测仍然是我们面临的主要食品安全问题。

由于四环素的严重危害，目前许多国家都规定了四环素在各种农产品和食品中的最大残留量。例如，中国国家标准gb/t22990-2008规定，牛奶中四环素的含量不得超过5ug/kg。检测四环素的方法有很多，例如：微生物学方法，酶联免疫测定法，液相色谱法和毛细管电泳法等传统检测方法，这些方法检测精度高，准确性强，但是大多前处理操作复杂，检测时间长，需要昂贵的仪器和专业的操作人员，无法满足对四环素含量的快速、高特异性检测要求。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有检测技术中存在的不足，如：检测成本高、时间长、预处理和检测步骤繁琐等，本发明提供了一种基于核壳型上转换纳米材料和羧基化磁性纳米材料的四环素检测方法，通过合成核壳型上转换荧光纳米材料，构建特异性四环素识别探针，消除背景荧光、其他因素干扰的影响，从而实现食品中四环素的低成本、高灵敏和特异性检测。

为实现以上目的，本发明采用的技术方案如下：

一种基于核壳型上转换和磁性纳米材料的特异性检测体系的食品中四环素检测方法，包括以下步骤：

步骤一，通过高温热分解法合成稀土掺杂的上转换内核纳米材料；

将稀土氯化物溶解后，在隔绝氧气条件下与油酸和1-十八稀加热澄清透明后冷却，加入naoh和nh4f后继续高温加热反应，冷却后离心得到沉淀，洗涤沉淀并进行真空冷冻干燥，得到稀土元素掺杂的上转换内核纳米材料；

步骤二，通过高温热分解法合成稀土掺杂的上转换核壳纳米材料；

将上转换外壳所需稀土氯化物溶解后，在隔绝氧气条件下与油酸和1-十八稀加热澄清透明后冷却，加入步骤二中的上转换内核纳米材料，再加入naoh和nh4f后继续高温加热反应，冷却后离心得到沉淀，洗涤沉淀并进行真空冷冻干燥，得到稀土元素掺杂的上转换核壳纳米材料；

步骤三，四环素识别探针的制备；

将步骤二中的上转换核壳纳米材料加入到酸性溶液中，经超声处理后去除表面油酸基团，使eu³⁺暴露出来，用去离子水洗涤后离心，得到四环素识别探针；

步骤四，采用水热法合成表面具有羧基官能团的四氧化三铁磁性纳米材料；

将fecl3、无水醋酸钠加入到乙二醇中溶解，再加入柠檬酸三钠搅拌得到混合溶液，将溶液转移到反应釜中，高温下反应；反应结束后取出反应釜冷却至室温，利用外界磁场分离，弃上清液，得到棕色材料，洗涤后置于烘箱干燥，得到羧基化四氧化三铁磁性纳米材料粉末；

步骤五，特异性检测体系的建立；

将步骤三得到的四环素识别探针与不同浓度的四环素标准溶液孵育后，再加入步骤四中的四氧化三铁磁性纳米材料，得到不同浓度的四环素检测液，经过孵育后，经外界磁场分离后测定上清液中的荧光强度信号特征值f，以四环素浓度对数值c和荧光强度信号特征值f进行线性拟合，建立四环素含量检测的标准曲线；

步骤六，样本中四环素含量的检测；

将食品样本经预处理，提取得到含有食品中四环素的溶液，将所得溶液按照与步骤五过程相同操作加入到特异性检测体系中，经外界磁场分离后，将测定的荧光强度信号特征值，带入步骤五所得的标准曲线，计算出食品中四环素的含量。

进一步，步骤一中，所述稀土元素掺杂的上转换内核纳米材料为掺杂镧系er金属元素的上转换荧光纳米材料。

进一步，步骤二中，所述稀土元素掺杂的上转换核壳纳米材料为掺杂镧系er金属元素和镧系eu金属元素的上转换核壳纳米材料。

进一步，步骤三中，所述酸性溶液为盐酸、硫酸等强酸性溶液，浓度为0.01m-0.1m，超声处理的时间为15-25min。

进一步，步骤三中，去离子水在14000-16000rpm的转速下离心洗涤3-5次。

进一步，步骤四中，所述四氧化三铁磁性纳米材料具有羧基基团，可在20s内经外界磁场快速分离。

进一步，步骤五中，所述不同浓度的四环素检测液的浓度范围为0.2-20000ng/ml，所述的四环素标准溶液和特异性检测体系的体积比为1：10。

进一步，步骤五中，四环素识别探针溶液中，上转换核壳纳米材料的浓度为1-3mg/ml，加入的四氧化三铁磁性纳米材料的浓度为1-3mg/ml，四环素识别探针溶液和磁性纳米溶液的体积比为4：5，检测体系与磁性纳米材料的孵育时间为5-15min。

进一步，步骤五中，所述测定上清液的荧光强度信号特征值：具体是测定980nm激发光激发下，经外界磁场分离后的上清液654nm处的荧光强度值为检测溶液的荧光强度信号特征值。

进一步，步骤六中，所述食品样本的预处理方法为：将食品样品加入到乙腈溶液中，混匀，离心后去除上层脂肪，取上清液用蒸馏水稀释十倍，测定样品中四环素的浓度；所述的牛奶样品和乙腈溶液的体积比为1:1。

与现有检测技术相比，本发明的有益效果如下：

1.本发明公开一种基于核壳型上转换纳米材料和羧基化磁性纳米材料的四环素检测方法，是基于静电吸附和磁分离的化学传感器对食品中的四环素进行检测，具体是通过核壳型上转换纳米材料作为四环素识别探针，然后加入表面带羧基的磁性纳米材料，通过外界磁场分离测定上清荧光强度构建了四环素的特异性检测体系。

2.本发明建立的四环素浓度与荧光强度信号特征值的线性浓度范围为0.2-20000ng/ml，具有较宽的线性检测范围，检测限lod为0.00125ng/ml，可以满足食品中四环素的高灵敏检测，具有很好的通用性，比传统方法的检测精度和灵敏度高。

3.通过合成核壳型上转换荧光纳米材料，构建特异性四环素识别探针，消除背景荧光、其他因素干扰的影响，从而实现食品中四环素的低成本、高灵敏和特异性检测。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明基于上转换荧光检测方法的四环素检测原理图；

其中，a为四环素识别探针的制备流程图；b为四环素特异性体系检测流程图；

图2为实施例1制备的上转换纳米粒子的透射电镜图；

其中，a为上转换荧光纳米粒子内核的透射电镜图；b为核壳型上转换荧光纳米粒子的透射电镜图；

图3为实施例1制备的羧基化磁性纳米颗粒的透射电镜图；

图4为实施例1中不同四环素浓度下检测溶液的荧光信号图；

图5为实施例1中四环素含量检测标准曲线图；

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

本发明中所述的“份”如无特别说明，均按质量份计。

下面结合说明书附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

实施例1牛奶中四环素含量的检测

一种基于核壳型上转换和磁性纳米材料的特异性检测体系的食品中四环素检测方法，包括如下步骤：

步骤一，高温热分解法合成稀土掺杂的上转换内核纳米材料：将recl3·xh2o(1mmol，y/gd：yb：er＝0.48/0.3：0.2：0.02)溶于5ml甲醇，并转移至含有7ml油酸和15ml1-十八碳烯的150ml三口圆底烧瓶中，将溶液在惰性气氛(ar)下连续搅拌加热至160℃30min之后，溶液变得澄清，将其冷却至室温。接下来，nh4f(4mmol)和naoh(2.5mmol)溶于5ml甲醇中，并在剧烈搅拌下逐滴加入到烧瓶中，搅拌40min，然后将溶液加热到70℃30min以确保完全蒸发。最后，将溶液在惰性气氛下加热至300℃维持60min，然后冷却至室温。用乙醇和环己烷(2:1v/v)洗涤，离心，得到白色沉淀。将最终的沉淀物在60℃的真空烘箱中放置过夜，以获得上转换内核纳米颗粒(图2a)。

步骤二，通过高温热分解法合成稀土掺杂的上转换核壳纳米材料：准确称取0.2mmolgdcl3·6h2o和0.3mmoleucl3·6h2o加入含有7mloa和15ml1-十八烯的150ml三颈圆底烧瓶中，在ar气流中恒定搅拌加热至160℃，30min，溶液变澄清，冷却至室温，然后，1mmol上转换内核纳米颗粒溶于10ml的环己烷中，搅拌下加入至上述澄清溶液中。加热至80℃脱环己烷后，加入10ml含4mmolnh4f和2.5mmolnaoh的甲醇溶液，搅拌40min，70℃下搅拌30min挥发甲醇。甲醇蒸发后，在氩气下加热至300℃，猛烈搅拌60min，然后冷却至室温用乙醇和环己烷(2:1v/v)洗涤，离心，得到白色沉淀。将最终的沉淀物在60℃的真空烘箱中放置过夜，以获得上转换核壳纳米材料(图2b)。

步骤三，四环素识别探针的制备：称取10mg上转换核壳纳米材料，加入1ml的0.1m的盐酸溶液，超声处理20min，用去离子水洗涤3次，重新分散在5ml的ph＝7的去离子水中。

步骤三中，上转换核壳纳米材料的超声时间的优化过程如下：准确称取2mg的油酸包裹的上转换核壳纳米材料，然后加入200μl的0.1m的盐酸溶液，分别超声处理5min，10min，15min，20min，25min，30min，用去离子水洗涤3次后，重新分散在2ml的ph＝7的去离子水中，测定溶液的zeta电位值。在5-20min范围内，电位不断增高，20分钟之后，电位又呈下降趋势，所以，选择20min的处理时间为最佳操作条件。

将步骤二中的上转换核壳纳米材料加入到酸性溶液中，经超声处理后去除表面油酸基团，使eu³⁺暴露出来，用去离子水洗涤后离心，得到四环素识别探针；

步骤三中，四环素识别探针复分散溶液的ph优化过程如下：准确称取1mg的上转换核壳纳米材料经超声处理后分散于1ml不同ph的水溶液中(用hcl和naoh调节ph)，测定上转换溶液的电位值。准确称取1mg的磁性纳米材料，溶于1ml不同ph的水溶液中，测定溶液的电位值。在ph＝7.0和8.0时，ucnps和mnps的表面电位差值较大，故静电相互作用力较大。为了进一步确定四环素检测的最佳ph值，我们测定了ph＝7和ph＝8时的荧光强度，ph＝7时，ucnps的荧光强度略高于ph＝8，故我们选择了四环素识别探针复分散于ph＝7的溶液中。

步骤四，采用水热法合成表面具有羧基官能团的四氧化三铁磁性纳米颗粒：取1.08gfecl3(4mmol)，0.185g无水醋酸钠(1.36mmol)加入到20ml乙二醇中溶解，之后加入1.2g柠檬酸三钠，快速搅拌30min。将溶液转移到带聚四氟乙烯内衬的反应釜中，200℃下反应12h。反应结束后取出反应釜冷却至室温，底部黑色物体利用外界磁场分离，弃上清液，利用乙醇和去离子水洗三遍。最后磁场吸附所得固体置于60℃烘箱干燥12h，得到羧基化fe3o4磁性纳米颗粒粉末(图3)。

步骤五，特异性检测体系的建立：取200μl的步骤三得到的2mg/ml的ucnps溶液，加入50μl不同浓度的四环素溶液，得到不同浓度的检测液。具体为：0.2ng/ml，2ng/ml，20ng/ml，200ng/ml，1000ng/ml，2000ng/ml，10000ng/ml，20000ng/ml。再加入步骤四中得到的250μl的2mg/ml的mnps溶液，孵育8分钟，然后通过外加磁场分离，测定上清液中的上转换荧光强度特征值f(图4)，以四环素浓度的对数值为横坐标，荧光强度信号特征值为纵坐标，建立四环素的含量检测的标准曲线(图5)。在最佳优化条件下，四环素浓度在0.2-20000ng/ml内与荧光强度呈现出良好的线性关系，其线性关系为f＝800.53c+7634.1，决定系数r²＝0.9772，检测限为0.00125ng/ml。

步骤五中，mnps溶液的加入体积和孵育时间的优化过程如下：向200μl的ucnps溶液中分别加入50μl，75μl，100μl，125μl，150μl，175μl，200μl，225μl，250μl，275μl，孵育后，经外界磁场分离测定上清液的荧光强度。随着mnps溶液的增多，经外界磁场分离后的上清液的荧光强度逐渐减弱，在225μl之后荧光变化逐渐平缓，并在250μl之后保持稳定，因此，在本实验的后续检测过程中选择250μlmnps溶液作为最佳的体积。200μl的ucnps溶液中加入250μl的mnps，分别孵育0min，2min，4min，6min，8min，10min，12min后，经外界磁场分离测定上清液的荧光强度。200μl2mg/ml的ucnps溶液与250μl的2mg/ml的mnps的孵育时间从0-8min时，荧光强度逐渐降低，在8min时，荧光强度达到最低，分离效果最好，随着时间继续增加，荧光强度略微增强。因此，每200μl的ucnps溶液加入250μl的mnps溶液孵育8min做为检测体系的最优条件，最终经外界磁场分离后，测定上清液的荧光强度。

步骤六，牛奶中四环素含量的检测：取5ml牛奶，加入5ml的乙腈。随后，7000rpm离心10min除去蛋白沉淀和上层脂肪。然后取上清液用蒸馏水稀释十倍，调节ph到7，向处理后的牛奶中加入已知浓度的四环素溶液，然后再加入mnps溶液孵育后测定上清液中的荧光强度，带入步骤五所得标准曲线，计算出牛奶中的四环素含量。

实施例2猪肉中四环素含量的检测

一种基于核壳型上转换和磁性纳米材料的特异性检测体系的食品中四环素检测方法，包括如下步骤：

步骤一，高温热分解法合成稀土掺杂的上转换内核纳米颗粒：将recl3·xh2o(1mmol，y/gd:yb:er＝0.48/0.3:0.2:0.02)溶于5ml甲醇，并转移至含有7ml油酸和15ml1-十八烯的150ml三口圆底烧瓶中，将溶液在惰性气氛(ar)下连续搅拌加热至160℃30min之后，溶液变得澄清，将其冷却至室温。接下来，nh4f(4mmol)和naoh(2.5mmol)溶于10ml甲醇中，并在剧烈搅拌下逐滴加入到烧瓶中，搅拌40min，然后将溶液加热到70℃30min以确保完全蒸发。最后，将溶液在惰性气氛下加热至300℃90min，然后冷却至室温。用乙醇和环己烷(2:1v/v)洗涤，离心，得到白色沉淀。将最终的沉淀物在60℃的真空烘箱中放置过夜，以获得上转换内核纳米颗粒。

步骤二，通过高温热分解法合成稀土掺杂的上转换核壳纳米颗粒：准确称取0.2mmolgdcl3·6h2o和0.3mmoleucl3·6h2o加入含有7mloa和15ml1-十八烯的150ml三口圆底烧瓶中，在ar气流中恒定搅拌加热至160℃，30min，溶液变澄清，冷却至室温，然后，1mmol上转换内核纳米颗粒溶于10ml的环己烷中，搅拌下加入至上述澄清溶液中。加热至80℃脱环己烷后，加入5ml含4mmolnh4f和2.5mmolnaoh的甲醇溶液，搅拌40min，70℃下搅拌30min挥发甲醇。甲醇蒸发后，在氩气下加热至300℃，猛烈搅拌90min，然后冷却至室温用乙醇和环己烷(2:1v/v)洗涤，离心，得到白色沉淀。将最终的沉淀物在60℃的真空烘箱中放置过夜，以获得上转换核壳纳米材料。

步骤三，四环素识别探针的制备：称取20mg上转换核壳纳米材料，加入1ml的0.1m的盐酸溶液，超声处理30min，用去离子水洗涤3次，重新分散在10ml的ph＝7的去离子水中。

步骤四，采用水热法合成表面具有羧基官能团的四氧化三铁磁性纳米颗粒：取1.08gfecl3(4mmol)，0.185g无水醋酸钠(1.36mmol)加入到20ml乙二醇中溶解，之后加入1.2g柠檬酸三钠，快速搅拌30min。将溶液转移到带聚四氟乙烯内衬的反应釜中，200℃下反应24h。反应结束后取出反应釜冷却至室温，底部黑色物体利用外界磁场分离，弃上清液，利用乙醇和去离子水洗三遍。最后磁场吸附所得固体置于60℃烘箱干燥12h，得到羧基化fe3o4磁性纳米颗粒粉末。

步骤五，特异性检测体系的建立：取200μl的步骤三得到的ucnps溶液，加入50μl不同浓度的四环素溶液，得到不同浓度的检测液。具体为：0.2ng/ml，2ng/ml，20ng/ml，200ng/ml，500ng/ml，2000ng/ml，5000ng/ml，10000ng/ml，20000ng/ml。再加入步骤四中得到的250μl的2mg/ml的mnps溶液，孵育10min，然后通过外加磁场分离，测定上清液中的上转换荧光强度特征值f，以四环素浓度的对数值为横坐标，荧光强度信号特征值为纵坐标，建立四环素的含量检测的标准曲线。在最佳优化条件下，四环素浓度在0.2-20000ng/ml内与荧光强度呈现出良好的线性关系，其线性关系为f＝712.6c+6581.7，决定系数r²＝0.9835，检测限为0.0014ng/ml。

步骤六，猪肉中四环素含量的检测：称取5g粉碎后的猪肉，然后加入5ml的乙腈和5ml蒸馏水，7000rpm离心10min。然后取上清液用蒸馏水稀释十倍，调节ph到7，向处理后的猪肉样品溶液中加入已知浓度的四环素溶液，然后再加入mnps溶液孵育后测定上清液中的荧光强度，带入步骤五所得标准曲线，计算出猪肉中的四环素含量。

实施例3蜂蜜中四环素含量的检测

一种基于核壳型上转换和磁性纳米材料的特异性检测体系的食品中四环素检测方法，包括如下步骤：

步骤一，高温热分解法合成稀土掺杂的上转换内核纳米颗粒：将recl3·xh2o(1mmol，y/gd:yb:er＝0.48/0.3:0.2:0.02)溶于10ml甲醇，并转移至含有3ml油酸和7ml1-十八碳烯的150ml三颈圆底烧瓶中，将溶液在惰性气氛(ar)下连续搅拌加热至160℃30min之后，溶液变得澄清，将其冷却至室温。接下来，nh4f(4mmol)和naoh(2.5mmol)溶于10ml甲醇中，并在剧烈搅拌下逐滴加入到烧瓶中，搅拌40min，然后将溶液加热到70℃30min以确保完全蒸发。最后，将溶液在惰性气氛下加热至300℃60min，然后冷却至室温。用乙醇和环己烷(2:1v/v)洗涤，离心，得到白色沉淀。将最终的沉淀物在60℃的真空烘箱中放置过夜，以获得上转换内核纳米颗粒。

步骤二，通过高温热分解法合成稀土掺杂的上转换核壳纳米颗粒：准确称取0.2mmolgdcl3·6h2o和0.3mmoleucl3·6h2o加入含有3mloa和7ml1-十八烯的150ml三口圆底烧瓶中，在ar气流中恒定搅拌加热至160℃，30min，溶液变澄清，冷却至室温，然后，1mmol上转换内核纳米颗粒溶于10ml的环己烷中，搅拌下加入至上述澄清溶液中。加热至80℃脱环己烷后，加入5ml含4mmolnh4f和2.5mmolnaoh的甲醇溶液，搅拌40min，70℃下搅拌30min挥发甲醇。甲醇蒸发后，在氩气下加热至300℃，猛烈搅拌60min，然后冷却至室温用乙醇和环己烷(2:1v/v)洗涤，离心，得到白色沉淀。将最终的沉淀物在60℃的真空烘箱中放置过夜，以获得上转换核壳纳米材料。

步骤三，四环素识别探针的制备：称取10mg上转换核壳纳米材料，加入1ml的0.1m的盐酸溶液，超声处理25min，用去离子水洗涤3次，重新分散在5ml的ph＝7的去离子水中。

步骤五，特异性检测体系的建立：取200μl的步骤三得到的2mg/ml的ucnps溶液，加入50μl不同浓度的四环素溶液，得到不同浓度的检测液。具体为：0.2ng/ml，20ng/ml，200ng/ml，1000ng/ml，2000ng/ml，5000ng/ml，10000ng/ml，20000ng/ml。再加入步骤四中得到的250μl的2mg/ml的mnps溶液，孵育12min，然后通过外加磁场分离，测定上清液中的上转换荧光强度特征值f，以四环素浓度的对数值为横坐标，荧光强度信号特征值为纵坐标，建立四环素的含量检测的标准曲线。在最佳优化条件下，四环素浓度在0.2-20000ng/ml内与荧光强度呈现出良好的线性关系，其线性关系为f＝639.3c+8465.3，决定系数r²＝0.9834，检测限为0.0016ng/ml。

步骤六，蜂蜜中四环素含量的检测：取1g蜂蜜稀释十倍后，称取5ml的蜂蜜水，加入5ml的乙腈，7000rpm离心10min。然后取上清液用蒸馏水稀释十倍，调节ph到7，向处理后的蜂蜜中加入已知浓度的四环素溶液，然后再加入mnps溶液孵育后测定上清液中的荧光强度，带入步骤五所得标准曲线，计算出蜂蜜中的四环素含量。