提升登革感染重症个体预测准确性的分群方法与流程

1.本发明有关一种医学检测方法，特别是有关于一种利用检测离体生物样本的登革病毒非结构性蛋白1(non-structural protein 1，ns1)及内源性抗ns1抗体以提高登革热重症个体预测准确性的分群方法。


背景技术：

2.登革热是传播快且病程短的疾病，每年全球约有3亿9千万受登革病毒感染。在过去20年来，已发生数次登革热地区性流行；除了流行于中国台湾的台南市、中国台湾的高雄市、中国台湾的屏东县，在非主要疫区的中国台湾的新北市、中国台湾的台中市，也陆续爆发本土登革热群聚性感染，显示登革热有本土化的趋势，其威胁范围扩及全境，登革热俨然已成为重要的新兴感染症与公共卫生难题。
3.登革患者的临床症状差异很大，由类似常见感冒的发烧，到致命性登革休克症候群或登革出血热均有可能。若能早期诊断登革热重症，即可以提供时效性的病情监控管理；然而，目前现有的检验技术尚无法满足可预估登革热严重度的临床需求。近年的新研究更发现ns1是一个重要的病毒毒素，已知会造成与登革重症期间的血浆渗漏，凝血功能失调与血小板过低等重要致病作用。另外，抗ns1抗体更在动物实验被证实具有治疗登革感染造成的出血病变的效果。
4.先前研究已发现，在登革感染患者的血清样本中病毒毒素ns1会与凝血酶或凝血酶原形成复合物，延长活化部份凝血活酶时间而引发出血重症。因此，现行检验流程针对疑似登革感染的个案会进行第一次采检(简称为一采)并进行登革病毒的ns1抗原快筛。若一采快筛结果为阴性，则再进行第二次采检(简称为二采)并进行登革病毒特异性的real-time pcr、rt-pcr、igm/igg等检验，其中igm/igg检验是指二采血清的抗登革病毒igm或igg抗体阳转(seroconversion)或igg抗体增加至少四倍判断为阳性。
5.然而，现行检验流程对于登革热轻症患者检验结果的伪阴性偏高，易造成误判。有鉴于此，亟需提供一种提升登革感染重症预测准确性的分群方法，以改善习知登革热患者检测结果伪阴性偏高的问题。


技术实现要素：

6.因此，本发明的一态样是提供一种提升登革感染重症预测准确性的分群方法，其同时检测及交叉比对离体生物样本是否含有登革病毒的非结构性蛋白1(non-structural protein 1，ns1)及内源性抗ns1抗体，借此有效降低检测结果的伪阴率，并提高登革热重症患者的分群准确性。
7.根据本发明的上述态样，提出一种提升登革感染重症预测准确性的分群方法。在一实施例中，此分群方法包括提供离体生物样本，对离体生物样本进行至少一检测步骤，以获得第一检测结果及第二检测结果，以及交叉比对该第一检测结果及该第二检测结果，以获得一分群结果。
8.在上述实施例中，离体生物样本尚未被诊断为或被鉴别诊断为登革病毒感染或登革病毒疑似感染。
9.在上述实施例中，第一检测结果是对应于登革病毒的非结构性蛋白1(non-structural protein 1，ns1)及/或ns1复合物，而第二检测结果是对应于内源性抗ns1抗体。
10.在上述实施例中，当第一检测结果及该第二检测结果的至少一者为阳性，则判断离体生物样本对应的个体归类于登革感染重症群。
11.在上述实施例中，离体生物样本包含血液、尿液、唾液、组织液及/或淋巴液。
12.在上述实施例中，第一检测结果是利用一抗体检测ns1及/或ns1复合物，此抗体为一外源性抗ns1抗体，且ns1复合物包含前述的ns1-凝血酶或ns1-凝血酶原。
13.在上述实施例中，登革病毒的血清型可包含第一型、第二型、第三型及第四型。
14.在上述实施例中，内源性抗ns1抗体为人类化抗体，内源性抗ns1抗体包含第一抗体及第二抗体，第一抗体可例如专一性辨识该ns1的第109个至第122个氨基酸残基，且第二抗体可例如专一性辨识该ns1的第114个至第119个氨基酸残基。在一例示中，内源性抗ns1抗体的种型为igg及/或igm，且第二检测结果是指第一抗体与第二抗体的含量比。
15.在上述实施例中，个体可例如为哺乳动物，例如人类。
16.在上述实施例中，当第一检测结果及第二检测结果之二者为阴性结果，则判断离体生物样本对应的个体归类于非登革感染重症。
17.在上述实施例中，至少一检测步骤包含酵素连结免疫吸附分析法(elisa)、西方墨点分析法、侧层流免疫分析法、多重免疫分析法、放射免疫分析法、免疫放射量测分析法、荧光免疫分析法、化学发光免疫分析法及/或免疫浊度测定法。
18.应用本发明的提升登革感染重症预测准确性的分群方法，其同时检测及交叉比对离体生物样本是否含有登革病毒的ns1及内源性抗ns1抗体，可有效降低检测结果的伪阴率，并提高登革热重症患者的分群准确性。
附图说明
19.为让本发明的上述和其他目的、特征、优点与实施例能更明显易懂，附图的详细说明如下：
20.图1为绘示根据本发明一实施例的各种登革热患者血清的修饰后ns1侧翼结构域(ns1-wd)igg/ns1 igg的含量比。
21.图2为绘示根据习知方法对于登革感染重症预测的专一性与敏感度二者的一致性结果。
22.图3为绘示根据本发明一实施例的登革热患者血清的ns1抗原对于登革感染重症预测的专一性与敏感度二者的一致性结果。
23.图4为绘示根据本发明一实施例的登革热患者血清的内源性抗ns1抗体比例对于登革感染重症预测的专一性与敏感度二者的一致性结果。
24.图5为绘示根据比较例的小鼠抗体检测登革热患者血清的内源性抗ns1抗体比例对于登革感染重症预测的专一性与敏感度二者的一致性结果。
具体实施方式
25.通过以下详细说明，并参酌附图，以下详细说明本发明的实施例。图式及说明书使用的相同图号，尽可能是指相同或类似的部分。
26.此处参照引用的所有文献，视同通过引用每篇个别文献或专利申请书特定且个别并入参考文献。倘若引用文献对一术语的定义或用法，与此处对该术语的定义不一致或相反，则适用此处对该术语的定义，而不适用该引用文献对该术语的定义。
27.为了解释说明书，将适用以下定义，在适当的情况中，单数名词也包括复数，反之亦然。整个详细说明阐述额外的定义。
28.除非上下文不适当，否则此处所述的「一(a/an)」及「该(the/said)」定义为「一或多」且包括复数型。
29.如前所述，本发明提供一种提升登革感染重症预测准确性的分群方法，其同时检测及交叉比对离体生物样本是否含有登革病毒的非结构性蛋白1(ns1)及内源性抗-ns1抗体，可有效降低检测结果的伪阴率，并提高登革热重症患者的分群准确性。
30.此处所述的「登革病毒(dengue virus)」可与「登革热病毒(dengue fever virus)」及「denv」交替使用。前述登革病毒的血清型可包含但不限于第一型、第二型、第三型及第四型。
31.在登革感染患者的血清样本中，登革病毒的非结构性蛋白1(non-structural protein 1，ns1)会与凝血酶(thrombin)或凝血酶原形成复合物，延长活化部份凝血酶活化时间，进而引发出血重症。习知技术虽有利用检测活体外生物样品(in vitro biological sample)中是否存在含有ns1与凝血酶的复合物或含有ns1与凝血酶原的复合物，以判断个体是否感染登革热病毒。然而，在登革感染患者中，不同患者的疾病严重程度存在相当大的差异，罹患重症者甚至可能会死亡。现行检验流程仅检测ns1与凝血酶的复合物或含有ns1与凝血酶原的复合物，其检验结果的伪阴性偏高，无法准确地判断疾病严重度，很可能会轻忽病况而延误治疗的时程。
32.因此，本发明的方法是对离体生物样本进行至少一检测步骤，将所得的第一检测结果及第二检测结果进行交叉比对并获得分群结果，以判断离体生物样本是否含有登革病毒的ns1及内源性抗ns1抗体，借此有效降低检测结果的伪阴率，并提高登革热重症患者的分群准确性。补充说明的是，此处所述的「检测」可与「检验」交替使用，「准确性」亦可与「准确率」交替使用。
33.上述的「离体生物样本」一般是指登革病毒感染个体内可影响的范围，并无特别限制，可包含但不限于血液(例如血清、血浆或全血)、尿液、唾液、淋巴液或组织液等，或是血液、尿液、淋巴液或组织液流经的附近组织或细胞等。在一些例子中，上述离体生物样本以含有被登革病毒感染的细胞者较佳，这些细胞可包括但不限于神经细胞、肌肉细胞、肝脏细胞、内皮细胞、血球细胞及淋巴细胞，又以含有哺乳动物的内皮细胞或血球细胞为较佳。在其他例子中，上述离体生物样本可例如为新鲜、经组织培养或经冷藏或冷冻的样品。在一些具体例中，上述离体生物样本可经过习知前处理(例如纯化、离心、萃取或浓缩等方法)，以提升待测物(例如ns1及/或ns1复合物、内源性抗ns1抗体等)浓度。
34.上述的「第一检测结果」是对应于登革病毒的非结构性蛋白1(non-structural protein 1，ns1)及/或ns1复合物。申言之，前述第一检测结果是利用一抗体检测ns1及/或
ns1复合物，其中此抗体为外源性抗ns1抗体。在一例示中，ns1复合物包含ns1-凝血酶或ns1-凝血酶原。
35.上述的「外源性抗体」可例如为单株抗体或多株抗体。在一些实施例中，专一性辨识ns1的抗体可例如为单株抗体。在其他实施例中，专一性辨识ns1复合物的抗体可例如为多株抗体。
36.前述的外源性抗体包括抗体为主的结合部分(antibody-based binding moiety)、免疫球蛋白分子(immunoglobulin molecules)及其免疫活性决定位(immunologically active determinants)，例如含有一个会与ns1或前述的复合物免疫专一性结合的抗原结合位(antigen-binding site)的分子。外源性抗体的抗体种型不拘，可包括不限于例如igg、iga、igm及ige等。
37.上述的外源性抗体亦可包括与ns1或前述ns1复合物专一性反应的抗原结合片段。抗原结合片段的结构不拘，在兼顾互补决定区(complementarity-determiningregion；cdr)结构稳定性的前提下，可为完整的抗体结构，或是简化的抗体结构，例如单链可变区片段(single-chain variable fragment；scfv)、单链可变区片段二聚体﹝(scfv)2﹞、单链可变区片段三聚体﹝(scfv)3﹞、可变区片段(variable fragment；fv)、fab片段、fab'片段、f(ab')2片段、纳米抗体〔nanobody，又称单域抗体(single domain antibody，sdab)或重链抗体(heavy-chain antibody)〕或上述的任意组合。
38.除了检测离体生物样本的ns1及/或ns1复合物之外，患者感染登革病毒后，体内会产生对抗ns1的「内源性抗体」。发明人也发现患者体内的ns1及/或ns1复合物的浓度、对抗特定ns1胜肽序列的内源性抗体浓度与登革疾病严重度有关。在一实施例中，可检测离体生物样本的内源性抗ns1抗体，以获得第二检测结果。
39.在此实施例中，内源性抗ns1抗体的种类不拘，可包含但不限于第一抗体及第二抗体。在一些例示中，上述第一抗体是指专一性辨识登革病毒ns1的第109个至第122个氨基酸残基的内源性抗体，其中ns1的第109个至第122个氨基酸残基可定义为修饰后ns1侧翼结构域胜肽(modified ns1-wd peptide)，以下称为抗修饰后ns1侧翼结构域(ns1-wd)胜肽的抗体或抗ns1-wd胜肽的抗体。在过去的临床研究发现，患者体内这类抗ns1-wd胜肽的抗体浓度越高者，较不容易发展为重症。另外，抗ns1-wd胜肽的抗体的质与量也与疾病的严重度有关。
40.在另一些例示中，上述第二抗体是指专一性辨识登革病毒ns1的第114个至第119个氨基酸残基的内源性抗体，其中ns1的第114个至第119个氨基酸残基属于登革病毒的四种血清型保留序列(conserved sequence)，有利于辨识登革病毒的四种血清型的ns1，亦称为「抗所有血清型ns1的抗体」或「抗ns1的抗体」。
41.在其他实施例中，上述内源性抗ns1抗体的种型不拘，可例如为igg及/或igm。在一些具体例中，上述第二检测结果是指第一抗体与第二抗体的含量比。
42.在一些具体例中，可利用例如人类化抗体(humanized antibody，hab)专一性辨识上述内源性抗ns1抗体。关于产生人类化抗体的方法，为本发明所属技术领域的公知常识。在一些例子中，可使用受体人类抗体骨架，并以啮齿目动物抗体的cdr序列取代人类抗体的对应序列，以获得人类化抗体，而这类人类化抗体属于人-鼠嵌合抗体。在人-鼠嵌合抗体的例子中，受体人类抗体骨架可选用公开数据库取得的人类抗体种系序列，其中受体人类抗
体骨架的人种并无特别限制，端视欲检测的离体生物样本而定。
43.此处所述的「个体」、「受试者」或「患者」是指哺乳动物。在一具体例中，个体、受试者或患者可例如为人类。
44.此处所述的具有「轻症」的登革热患者是指呈现「警示征象(warning signs)」(或称「警示症状」)或无警示征象，其中警示征象可包括但不限于例如腹部疼痛或压痛(abdominal pain or tenderness)、持续性呕吐(persistent vomiting)、临床体液蓄积(clinical fluid accumulation)及黏膜出血(mucosal bleed)等。在其他例子中，无警示征象的轻症患者可归类为a群患者，呈现警示征象的轻症患者则可归类为b群患者。相关判断原则可参照世界卫生组织(world health organization，who)发布的登革热临床处理手册(handbook for clinical management of dengue)。
45.此处所述的具有「重症」的登革热患者是指呈现例如严重血浆渗漏(severe plasma leakage)而造成休克(shock)及体液蓄积并呼吸窘迫(respiratory distress)、严重出血(severe bleeding)或严重器官损伤(severe organ impairment)等征象。在其他例子中，重症患者亦可归类为c群患者。相关判断原则可参照上述who发布的登革热临床处理手册。
46.此处所述的「登革感染重症群」是指根据本发明的分群方法判断者。一般而言，医学检验领域系以α代表伪阳性，或称为特异性(specificity，亦称为专一性)的反面；而以β代表伪阴性，或称为敏感性(sensitivity)的反面。在应用时，本发明的分群方法是同时检测及交叉比对离体生物样本是否含有登革病毒的ns1及内源性抗ns1抗体，将第一检测结果及第二检测结果的至少一者为阳性时归类于登革感染重症群，借此有效降低β数值(即降低「伪阴率」)，进而提高登革热重症患者的「分群准确率」(即相当于提高「1-β」的数值，亦指分群准确性)。另外，当第一检测结果及第二检测结果之二者为阴性结果，则判断离体生物样本对应的个体归类于非登革感染重症。
47.在上述实施例中，上述检测步骤可包含但不限于酵素连结免疫吸附分析法(elisa)、西方墨点分析法、侧层流免疫分析法、多重免疫分析法、放射免疫分析法、免疫放射量测分析法、荧光免疫分析法、化学发光免疫分析法及/或免疫浊度测定法等。在其他实施例中，亦可使用其他方式检测离体生物样本的ns1及内源性抗ns1抗体。
48.另外说明的是，习知检验流程大多是根据单一检测结果以先后顺序判断登革热患者的严重程度，实无法有效降低检测结果的伪阴性。在一些具体例中，相较于现行检验流程的伪阴率约10％～30％，本发明的分群方法的「登革感染重症群」经临床医师诊断并确认后，确实可将检测结果的伪阴率降低至约4.5％。
49.以下利用数个实施例以说明本发明的应用，然其并非用以限定本发明，本发明技术领域中具有公知常识者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种的更动与润饰。
50.实施例一
51.1.病毒株
52.登革病毒血清型第一型(denv 1，tw病毒株8700828)、第二型(denv 2，病毒株16681以及病毒株454009a)、第三型(denv 3，tw病毒株8700829)以及第四型(denv 4，tw病毒株59201818)可使用习知培养方法在c6/36细胞中复制，为病毒培养乃本发明所属技术领域中具有公知常识者所熟知，在此不另赘述。去除细胞后的上清液利用市售离心设备(例如
science products,mansfield,ma)作为受质进行呈色反应。之后，各孔加入终止溶液(2n h2so4)停止反应，利用市售微量盘判读仪(例如versamax microplate reader；molecular devices,sunnyvale,ca)于od450nm读取吸亮度，其结果相当于第二检测结果。
60.5.统计分析
61.所有数值利用prism软件(graphpad,san diego,ca)分析。所有结果是利用非成对司徒顿t检定(unpaired student’s t-test)或单因子变异数分析(one-way anova)，以分别比较二个或二个以上的独立族群。所有数值由三个独立试验得出，以平均值
±
sd表示。统计显著性设定以图号*代表p《0.05，以图号**代表p《0.01，以图号***代表p《0.001，而ns代表在95％双尾信赖区间下无显著差异。
62.实施例二
63.利用实施例一的方法分别检测患者血清中抗修饰后ns1-wd胜肽的抗体(igg)光学密度(od)值与抗所有血清型ns1的抗体(igg)的od值，以二者od比值(ns1-wd igg/ns1 igg)对不同严重度的登革热患者进行评估，其结果如图1所示。
64.请参阅图1，其为绘示根据本发明一实施例的各种登革热患者血清的抗修饰后ns1侧翼结构域(ns1-wd)igg/抗ns1 igg的含量比，其中图号*代表p《0.05，图号**代表p《0.01，而图号***代表p《0.001。
65.如图1所示，相较于具有警示征象的登革热患者血清(n＝20)或无警示征象的登革热患者血清(n＝30)，登革感染重症患者血清(n＝17)的抗ns1-wd igg/抗ns1 igg的含量比为显著降低。进一步分析后，所有患者的抗ns1 igg的od值在统计上无显著差异(结果未显示)，显示检测抗ns1-wd胜肽的抗体确实有助于提升登革热患者分群准确性。
66.请参阅图2，其为绘示根据习知方法对于登革感染重症预测的专一性与敏感度之间的一致性结果。图2使用的习知方法包括根据患者症状、病史及简单非专一性检验结果(包括根据单一检测结果或未针对抗ns1-wd igg的检验结果)，进行专一性与敏感度二者之一致性分析。
67.由图2结果可知，习知方法(仅根据症状、病史及简单非专一性检验结果)的检验方法的敏感性高于专一性，曲线下面积(area under curve，auc)为0.7036(信赖区间为0.60-0.81)。
68.请参阅图3，其为绘示根据本发明一实施例的登革热患者血清的ns1抗原对于登革感染重症预测的专一性与敏感度之间的一致性结果(相当于第一检测结果)。由图3结果可知，登革热患者血清的ns1抗原的检验方法的敏感性亦高于专一性，曲线下面积(auc)为0.8052(信赖区间为0.71-0.90)。
69.请参阅图4，其为绘示根据本发明一实施例的登革热患者血清的内源性抗ns1抗体比例对于登革感染重症预测的专一性与敏感度二者的一致性结果(相当于第二检测结果)。由图4结果可知，由登革热患者血清的内源性抗ns1抗体的检验方法的敏感性亦高于专一性，曲线下面积(auc)为0.7027(信赖区间为0.59-0.81)。
70.请参阅表1，其列出根据本发明一实施例的同时检测及交叉比对登革热患者血清的ns1抗原与内源性抗ns1抗体比例的阳性或阴性的个数与鉴别诊断确认的结果，其中重症与轻症是根据who发布的登革热临床处理手册对受试者事后进行鉴别诊断确认后的结果。
71.[表1]
[0072][0073]
根据表1可知，利用人类化抗体检测内源性抗-ns1抗体比例且同时检测登革热患者血清的ns1与内源性抗-ns1抗体的至少一者为阳性时，判断离体生物样本对应的受试者归类于登革感染重症群，经事后诊断或鉴别诊断的确认后，以本发明的方法预估登革热重症的分群准确率(亦指分群准确性)可高达95.5％(即62/65＝95.5％)，相当于伪阴率(即β值)降至4.5％。因此，本发明的分群方法可应用于预估登革热重症患者，亦有利于做为临床医疗人员评估风险及/或拟定治疗策略的参考。
[0074]
相较之下，利用小鼠抗体检测内源性抗-ns1抗体比例对登革热患者进行分群，其伪阴率偏高。请参阅图5，其为绘示根据比较例的小鼠抗体检测登革热患者血清的内源性抗ns1抗体比例对于登革感染重症预测的专一性与敏感度二者的一致性结果(相当于第二检测结果)。由图5结果可知，以小鼠抗体检测登革热患者血清的内源性抗ns1抗体的检验方法的敏感性(72.97％)则低于专一性(83.33％)，曲线下面积(auc)为0.7739(信赖区间为0.6557-0.8921)。
[0075]
请参阅表2，其列出根据比较例的小鼠抗体检测登革热患者血清的内源性抗ns1抗体比例的阳性或阴性的个数与鉴别诊断确认的结果，其中重症与轻症是根据who发布的登革热临床处理手册对受试者事后进行鉴别诊断确认后的结果。
[0076]
[表2]
[0077][0078]
由表2可知，比较例以小鼠抗体检测登革热患者血清的内源性抗-ns1抗体为阳性时，判断离体生物样本对应的受试者归类于登革感染重症群，经事后诊断或鉴别诊断的确
认后，其预估登革热重症的分群准确率(亦指分群准确性)仅达72.9％(即27/37＝72.9％)，而分群伪阴率高达27.1％(即10/37＝27.1％)，确实远高于本发明的分群方法的伪阴率(4.5％)。
[0079]
综言之，上述特定的抗原、特定的抗体、特定的病患群、特定的分析模式或特定的评估方法仅用于例示说明提升登革感染重症预测准确性的分群方法。然而，本发明所属技术领域中具有公知常识者应可理解，在不脱离本发明的精神及范围内，其他的抗原、其他的抗体、其他的病患群、其他的分析模式或其他的评估方法亦可用于提升登革感染重症预测准确性的分群方法，并不限于上述。举例而言，在不影响分群准确性的前提下，第一检测结果可使用其他方式检测ns1及/或ns1复合物，或者第二检测结果可使用其他方式检测内源性抗ns1抗体。
[0080]
由上述实施例可知，本发明的提升登革感染重症预测准确性的分群方法同时检测及交叉比对离体生物样本是否含有登革病毒的ns1及内源性抗ns1抗体，可有效降低检测结果的伪阴率，并提高登革热重症患者的分群准确性。
[0081]
虽然本发明已以数个特定实施例揭露如上，但可对前述揭露内容进行各种润饰、各种更动及替换，而且应可理解的是，在不脱离本发明的精神和范围内，某些情况将采用本发明实施例的某些特征但不对应使用其他特征。因此，本发明的精神和权利要求范围不应限于以上例示实施例所述。