一种检测索磷布韦中有关物质的液相色谱法的制作方法

1.本发明涉及药物分析领域，具体地涉及但不限于一种检测索磷布韦有关物质的液相色谱法。
2.背景
3.索磷布韦(sofosbuvir，又译为索非布韦或索氟布韦)是由吉利德(gilead sciences)公司研制的丙型肝炎病毒(hepatitis c virus，hcv)核苷酸类似物ns5b聚合酶抑制剂，用于治疗慢性丙型肝炎病毒感染。临床试验证实，针对1和4型丙肝，索磷布韦联合聚乙二醇干扰素和利巴韦林的总体持续病毒学应答率(sustained virological response，svr)高达90％；针对2型丙肝，该药物联合利巴韦林的svr为89％-95％；针对3型丙肝，该药物联合利巴韦林的svr为61％-63％；索磷布韦在用于治疗特定基因型慢性丙型肝炎时，可消除对传统注射药物干扰素(interferon，ifn)的需求，降低患者的不良反应和提高患者的顺应性，被广泛认为是慢性丙肝的突破性治疗药物。2013年以来，索磷布韦原研药已在美国、欧盟、日本、中国等国家获批上市。
4.有关物质是在药物合成生产过程中带入的起始物料、中间体、副反应产物和降解杂质等，其影响着药物的产品质量，甚至还会造成严重的不良反应。有关物质的检测方法的开发是药品质量研究中的重要部分，能够提高药物安全性、有效性与质量可控性。
5.关于检测索磷布韦及其有关物质的液相色谱法，cn107402267a公开了一种正相高效液相色谱法测定索氟布韦原料药非对映异构体及杂质含量的方法，杂质包括：
[0006][0007]
该方法使用岛津lc-20at高效液相色谱仪且配二极管阵列检测器，chiralcelad-h 250mm
×
4.6mm，5μm正相色谱柱。cn107449842a公开了测定索氟布韦原料药中对映异构体的正相高效液相色谱法，采用岛津lc-20at高效液相色谱仪，chiralcel ad-h250mm
×
4.6mm，5μm正相色谱柱。cn107402267a和cn107449842a均使用了正相手性色谱柱。正相手性色谱柱成本高，普遍适用性较差。cn107402267a检测四种异构体，cn107449842a仅检测了一种杂质sf-z8且未公开sf-z8的结构。
[0008]
cn112213418a公开了一种索非布韦中有关物质的检测方法采用流动相a：磷酸二氢钾-四丁基溴化铵-水，流动相b：乙腈，十八烷基硅烷键合硅胶柱进行梯度洗脱。有关物质
包括：
[0009][0010][0011]
cn107402267a和cn112213418a公开的均为手性杂质。索磷布韦合成过程中除了涉及手性杂质，还涉及某些非手性杂质。因此对于使用非手性柱检测索磷布韦中手性杂质和非手性杂质的液相色谱法存在迫切需求。


技术实现要素：

[0012]
针对现有技术存在的问题，本发明提供一种采用反相非手性柱检测索磷布韦中手性杂质和非手性杂质的液相色谱法。在本发明液相色谱法中流动相的流速为梯度变化的。
[0013]
本发明提供一种检测索磷布韦中有关物质的液相色谱法，包括下述步骤：
[0014]
供试品溶液的配制，用流动相为溶剂配制所述供试品溶液；
[0015]
对照品溶液的配制，用流动相为溶剂配制所述对照品溶液；
[0016]
系统适用性溶液的配制，用流动相为溶剂配制所述系统适用性溶液；
[0017]
高效液相色谱法进行检测；
[0018]
其中，所述有关物质选自杂质1和杂质2中的任一种或两种。
[0019][0020]
在本发明中，杂质1为：二氯化磷酸苯酯；杂质2为：n-(氯基(苯氧基)磷酰基)-l-丙
氨酸异丙酯。
[0021]
本发明优选的实施方案中，所述有关物质选自杂质1和杂质2中的任一种或两种。
[0022]
本发明优选的实施方案中，所述有关物质由杂质1和杂质2组成。
[0023]
本发明优选的实施方案中，所述供试品溶液的浓度为1mg/ml-50mg/ml，对照品溶液的浓度可以为0.1μg/ml-10μg/ml。
[0024]
本发明优选的实施方案中，所述供试品溶液的浓度为5mg/ml-30mg/ml，对照品溶液的浓度可以为0.2μg/ml-5μg/ml。
[0025]
本发明优选的实施方案中，所述供试品溶液的浓度为20mg/ml，对照品溶液的浓度可以为1μg/ml。
[0026]
本发明优选的实施方案中，填充柱为硅胶柱。
[0027]
在本发明中，所述十八烷基硅烷键合硅胶柱为商购获得。例如所述十八烷基硅烷键合硅胶柱可以选自ymc、phenomenex、es、merck、agilent、kromasil、agela或techmate公司生产的十八烷基硅烷键合硅胶柱。
[0028]
本发明优选的实施方案中，所述十八烷基硅烷键合硅胶柱选自ymc triat c18、ymc ods c18、ymc-pack c18、phenomenex kinetex c18、titank c18、es-c18、epic c18、zorbax sb-c18、poroshell 120ec-c18、zorbax 300sb-c18、xdb-c18、eclipse plus c18、tc-c18、extend-c18、bonshell c18、venusil c18 plus、bonshell asb c18、venusil hlp c18、venusil mp c18、innoval neo xd c18、venusil xbp c18(a)、venusil xbp c18(b)、techmate c18-st、techmate c18-stⅱ、techmate ci8 ug、kromasil eternity-5-c18、kromasil eternityxt-10-c18、kromasil 100-10-c18、kromasil100-5-c18或kromasil 300-5-c18中的任一种或其组合。
[0029]
本发明优选的实施方案中，填充柱为碳十八硅胶柱，用硅胶为填充剂，优选地ultimate sio24.6mm
×
250mm，5μm。
[0030]
本发明优选的实施方案中，流动相为正己烷-乙酸乙酯。正己烷-乙酸乙酯的体积比为70:30-95:5，优选地为80:20-90:10，更优选地为85:15。
[0031]
本发明优选的实施方案中，流速为每分钟0.7ml-1.6ml。
[0032]
本发明优选的实施方案中，流速在洗脱过程中是变化的，洗脱程序为：
[0033][0033][0034][0035]
本发明优选的实施方案中，洗脱程序为：
[0036][0037]
本发明优选的实施方案中，洗脱程序为：
[0038]
[0039]
在本发明中，配制供试品溶液或对照品溶液时，所用溶剂为正己烷-乙酸乙酯。正己烷-乙酸乙酯的体积比为70：30-95:5，优选地为80:20-90:10，更优选地为85:15。
[0040]
本发明优选的实施方案中，柱温为30℃-60℃，优选地为35℃-55℃，更优选地为45℃。
[0041]
本发明优选的实施方案中，检测波长为240nm-280nm，优选地为250nm-270nm，更优选地为262nm。
[0042]
本发明优选的实施方案中，所述高效液相色谱法的检测条件为：用十八烷基硅烷键合硅胶柱；以正己烷-乙酸乙酯(80:20-90:10)为流动相；柱温为35℃-55℃；检测波长为250nm-270nm；按如下梯度洗脱：
[0043][0044]
本发明优选的实施方案中，所述高效液相色谱法的检测条件为：用十八烷基硅烷键合硅胶柱；以正己烷-乙酸乙酯(80:20-90:10)为流动相；柱温为35℃-55℃；检测波长为250nm-270nm；按如下梯度洗脱：
[0045][0046]
本发明优选的实施方案中，所述高效液相色谱法的检测条件为：用十八烷基硅烷键合硅胶柱；以正己烷-乙酸乙酯(80:20-90:10)为流动相；柱温为35℃-55℃；检测波长为250nm-270nm；按如下梯度洗脱：
[0047][0048]
本发明优选的实施方案中，所述高效液相色谱法的检测条件为：用十八烷基硅烷键合硅胶柱；以正己烷-乙酸乙酯(70:30-95:5)为流动相；柱温为30℃-60℃；检测波长为250nm-270nm；按如下梯度洗脱：
[0049][0050]
本发明优选的实施方案中，所述高效液相色谱法的检测条件为：用十八烷基硅烷键合硅胶柱；以正己烷-乙酸乙酯(70:30-95:5)为流动相；柱温为30℃-60℃；检测波长为250nm-270nm；按如下梯度洗脱：
[0051][0052]
本发明优选的实施方案中，所述高效液相色谱法的检测条件为：用十八烷基硅烷
键合硅胶柱；以正己烷-乙酸乙酯(70:30-95:5)为流动相；柱温为30℃-60℃；检测波长为250nm-270nm；按如下梯度洗脱：
[0053][0054]
本发明优选的实施方案中，所述高效液相色谱法的检测条件为：用硅胶为填充剂ultimate sio24.6mm
×
250mm，5μm；以正己烷-乙酸乙酯(85:15)为流动相；柱温为45℃；检测波长为262nm；按如下梯度洗脱：
[0055][0056]
本发明优选的实施方案中，所述高效液相色谱法的检测条件为：用硅胶为填充剂ultimate sio24.6mm
×
250mm，5μm；以正己烷-乙酸乙酯(85:15)为流动相；柱温为45℃；检测波长为262nm；按如下梯度洗脱：
[0057][0058]
本发明优选的实施方案中，所述高效液相色谱法的检测条件为：用硅胶为填充剂ultimate sio24.6mm
×
250mm，5μm；以正己烷-乙酸乙酯(85:15)为流动相；柱温为45℃；检测波长为262nm；按如下梯度洗脱：
[0059][0060]
在本发明中，杂质1不超过50ppm；杂质2不超过50ppm；杂质1与杂质2之和不超过75ppm。
[0061]
本发明优选的实施方案中，所述液相色谱法包括：
[0062]
取供试品，置于量瓶中，精密加入乙酸乙酯超声使溶解后，精密加入正己烷，摇匀，滤过，取滤液作为供试品溶液；
[0063]
取杂质1与杂质2对照品，用流动相制成每1ml中约含杂质1与杂质2各1μg的溶液，作为对照溶液；
[0064]
用硅胶为填充剂(ultimate sio24.6mm
×
250mm，5μm)；以正己烷-乙酸乙酯(85:15)为流动相；柱温为45℃；检测波长为262nm；按如下梯度洗脱；
[0065][0066]
取对照品溶液与供试品溶液各100μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。杂质1与杂质2含量按外标法以峰面积计算，即得。杂质1不超过50ppm；杂质2不超过50ppm；杂质1与杂质2之和不超过75ppm。
[0067]
在本发明中，提到流动相之间的比例时，指的是流动相之间的体积比。在本发明
中，提到浓度时指的是物质在溶剂中的重量/体积之比。在本发明中，ppm指的是用溶质质量占全部溶液质量的百万分比来表示的浓度，也称百万分比浓度。
[0068]
本发明方法具有以下有益效果：本发明采用反相非手性柱检测索磷布韦中手性杂质和非手性杂质。在本发明液相色谱法中流动相的流速为梯度变化的。所述方法专属性强，索磷布韦与空白溶剂不干扰杂质，分离度较好；本发明色谱条件检测杂质灵敏度高；杂质的相关系数均大于0.99，线性良好；进样精密度良好；重复性试验项下，不同分析人员在不同的时间、不同的仪器上的测定结果一致；溶液稳定性试验结果表明，供试品溶液及对照品溶液室温放置8小时内溶液稳定；杂质平均回收率范围均在90％-110％之间。
附图说明
[0069]
图1为杂质1的线性图，其中
◆
代表0.302μg/ml，
■
代表0.503μg/ml，
▲
代表0.805μg/ml，
╳
代表1.006μg/ml，*代表1.509μg/ml，
●
代表2.012μg/ml；
[0070]
图2为杂质2的线性图，其中
◆
代表0.261μg/ml，
■
代表0.434μg/ml，
▲
代表0.695μg/ml，
╳
代表0.869μg/ml，*代表1.303μg/ml，
●
代表1.737μg/ml。
具体实施方式
[0071]
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下文中将结合附图对本发明的实施例进行详细说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互任意组合。
[0072]
实施例
[0073]
实施例1：hplc法
[0074]
1.1分析方法
[0075]
表1实施例1使用的仪器和试剂
[0076][0077]
色谱条件：用硅胶为填充剂(ultimate sio24.6mm
×
250mm，5μm)；以正己烷-乙酸乙酯(85:15)为流动相；柱温为45℃；检测波长为262nm；按如下梯度洗脱。
[0078][0079]
测定法：取供试品约100mg，置5ml量瓶中，精密加入乙酸乙酯1.5ml超声使溶解后，精密加入正己烷3.5ml，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
[0080]
取杂质1与杂质2对照品，用流动相制成每1ml中约含杂质1与杂质2各1μg的溶液，作为对照溶液；
[0081]
按上述色谱条件进行检测；
[0082]
取对照品溶液与供试品溶液各100μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。杂质1与杂质2含量按外标法以峰面积计算，即得。杂质1不超过50ppm；杂质2不超过50ppm；杂质1与杂质2之和不超过75ppm。
[0083]
1.2方法学验证内容
[0084]
1.2.1、专属性
[0085]
分别取索磷布韦(sfb)、杂质1、杂质2对照品，用流动相制成含各成分1μg/ml的溶液，作为单个杂质定位溶液；另取杂质1、杂质2对照品用流动相制成的混合溶液。
[0086]
取空白溶剂、单个杂质定位溶液、混合溶液各100μl，注入色谱仪，结果见表2。
[0087]
表2专属性试验结果
[0088][0089]
空白溶剂与索磷布韦不干扰杂质1与杂质2的测定。
[0090]
1.2.2、定量限、检测限
[0091]
取杂质1、杂质2对照品，用流动相溶解并稀释制成每1ml中约含杂质1、杂质2各1μg的混合溶液，作为母液。用流动相逐级稀释母液作为供试溶液。精密量取各级供试溶液100μl，注入液相色谱仪，按信噪比(s/n约为10:1)确定定量限；按信噪比(s/n约为3:1)确定检测限。结果见表3。
[0092]
表3检测限和定量限试验结果
[0093][0094]
试验结果表明，本方法测定各杂质的灵敏度良好。
[0095]
1.2.3、线性与范围
[0096]
分别取杂质1、杂质2对照品，精密称定，用流动相配制成含杂质1、杂质2表16.1-16.2中的浓度溶液。分别用溶剂配制成限度200％、限度150％、限度100％、限度80％、限度50％、限度30％溶液。精密量取各系列浓度的溶液100μl，注入色谱仪，记录色谱图，以浓度
为横坐标(μg/ml)、峰面积为纵坐标做线性回归，试验结果见表4.1-表4.2。
[0097]
表4.1杂质1线性试验结果
[0098][0099]
表4.2杂质2线性试验结果
[0100][0101]
试验结果表明，各杂质在从限度30％-限度200％的浓度范围内，相关系数均大于0.999，线性关系良好。
[0102]
1.2.4、精密度
[0103]
(1)进样精密度：取杂质1、杂质2对照品，精密称定，用流动相配制成杂质1、杂质2各1μg/ml的混合溶液，作为进样精密度试验溶液；连续进样6次，考察峰面积的变化，结果见表5。
[0104]
表5进样精密度试验结果
[0105]
峰面积样1样2样3样4样5样6rsd(％)杂质14451442244734547450844920.98杂质22279203722882201204822275.11
[0106]
试验结果表明，进样精密度溶液连续进样6次，杂质1峰面积值的rsd值0.98％、杂质2峰面积值的rsd值5.11％。
[0107]
(2)重复性：取本品，共6份，依实施例1.1分析方法测定。结果见表6。表6重复性试验结果
[0108]
名称样1样2样3样4样5样6平均值rsd杂质1未检出未检出未检出未检出未检出未检出未检出
‑‑
杂质2未检出未检出未检出未检出未检出未检出未检出
‑‑
[0109]
试验结果表明，重复性试验项下6份样品已知杂质的检出数与检出量一致，总杂质的检出量一致，分析方法的重复性良好。不同分析人员在不同的时间、不同的仪器上的12次测定结果一致。
[0110]
1.2.5、溶液稳定性
[0111]
取供试品溶液与对照品溶液，于室温下放置，分别于0、5、6、7、8小时，各取100μl注入液相色谱仪，试验结果见下表7。
[0112]
表7溶液稳定性试验结果
[0113]
名称供试品-杂质1对照品-杂质1供试品-杂质2对照品-杂质20小时未检出4379未检出23605小时未检出4528未检出23946小时未检出4698未检出21187小时 未检出4693未检出24278小时未检出4669未检出2270差值％
‑‑‑
6.8
‑‑‑
10.3
[0114]
注：差值％指的是0小时以后，面积相对于0小时差异最大的考察点时的峰面积与0小时峰面积的差的绝对值与0小时的面积比值。
[0115]
计算公式：差值％＝∣0小时峰面积-差异最大的考察点时的峰面积∣/0小时峰面积
×
100％
[0116]
溶液稳定性试验结果表明，对照品溶液室温放置8小时，杂质1峰面积最大差值6.8％，杂质2峰面积最大差值10.3％，基本满足检测要求；供试品溶液室温放置8小时，均未检测到杂质1、杂质2，供试品室温放置8小时内溶液稳定。综上，供试品溶液及对照品溶液室温放置8小时内溶液稳定。
[0117]
1.2.6、准确度
[0118]
以测定杂质1与杂质2的回收率表示。
[0119]
取索磷布韦、杂质1与杂质2对照品，精密称定，按供试品溶液配制方法制成含索磷布韦20mg和杂质1与杂质2的浓度分别为限度浓度的50％、100％、150％，每种浓度溶液各配制3份。按实施例1.1方法分析。按外标法以峰面积计算杂质1与杂质2的回收率(％)和rsd(％)，结果见回收率试验结果见表8。
[0120]
表8回收率试验结果
[0121][0122]
杂质1回收率在80.18％～103.06％范围内，平均回收率91.92％，rsd值7.59％；杂质2回收率在88.89％～96.91％范围内，平均回收率92.39％，rsd值2.54％，杂质1与杂质2的平均回收率均在90％～110％之间，本方法的准确度良好。
[0123]
虽然本发明所揭露的实施例如上，但所述的内容仅为便于理解本发明而采用的实施方式，并非用以限定本发明。任何本发明所属领域内的技术人员，在不脱离本发明所揭露的精神和范围的前提下，可以在实施的形式及细节上进行任何的修改与变化，但本发明的专利保护范围，仍须以所附的权利要求书所界定的范围为准。