一种毒品检测试条及毒品检测试剂盒的制作方法

1.本发明涉及毒品检测技术领域，特别是涉及一种时间分辨荧光免疫层析法检测毛发中大麻、摇头丸、可卡因的试条、试剂盒及制备方法。


背景技术：

2.二十多年来，毛发毒品分析技术飞速发展，而体液(主要指尿液和血液)仍是检验毒品较好的生物检材，但体液中毒品的检出时限短，吸毒者吸毒后，一般在3至7天就由于代谢而难以通过尿液、血液、唾液精确检测出毒品成分及含量，检材不易保存，不能探究受检者更长一段时间内的吸毒信息，导致部分吸毒人员借此规避查处和管理。而传统的毛发检测技术中，高效液相色谱法得到结果需要的时间长，操作复杂，不适用于现场执法工作。


技术实现要素：

3.基于此，有必要针对毒品检出时限短、检测时间长、操作复杂的问题，提供一种能够快速检测、灵敏度高、特异性好的毒品检测试条、试剂盒及其制备方法。
4.一种毒品检测毒品检测试条，所述的毒品检测毒品检测试条包括：样品垫、结合垫、检测膜、吸收垫和底板，所述样品垫、所述结合垫、所述检测膜和所述吸收垫在所述底板上依次连接；所述结合垫上设有至少一种毒品的发光微球标记的特异性单克隆抗体，所述检测膜上具有至少一条分别对应毒品的检测线，所述检测线包被有相应毒品的合成抗原，所述毒品包括大麻、摇头丸及可卡因的至少其中一种或其组合物。
5.在其中一个实施例中，所述毒品检测试条的所述结合垫上具有至少一种发光微球标记的特异性单克隆抗体，且所述毒品检测试条的所述检测膜上具有至少一条所述检测线。
6.在其中一个实施例中的毒品检测试条，所述检测膜的制备步骤如下：将至少一种毒品的合成抗原溶液划线于所述检测膜上，形成对应于不同毒品的检测线；所述毒品大麻、摇头丸、可卡因中至少其中一种；干燥后即得所述检测膜。
7.在其中一个实施例中的毒品检测试条，所述结合垫的制备步骤如下：将发光微球标记的至少一种所述毒品的特异性单克隆抗体溶液均匀涂布在结合垫上，干燥后即得。
8.在其中一个实施例中，所述合成抗原溶液是将相应的合成抗原使用磷酸缓冲液或海藻糖稀释液稀释至浓度为0.3～1mg/ml得到。
9.在其中一个实施例中，所述检测膜上还设有包被羊抗鸡igy抗体的质控线。
10.在其中一个实施例中的毒品检测试条，还包括在检测膜上使用羊抗鸡igy抗体溶液进行划线，并干燥形成质控线的步骤；所述羊抗鸡igy抗体溶液时将羊抗鸡igy抗体使用磷酸盐缓冲液或海藻糖稀释液稀释至浓度为1～3mg/ml得到。
11.在其中一个实施例中，所述发光微球为时间分辨荧光微球。
12.在其中一个实施例中，所述发光微球标记的毒品特异性单克隆抗体溶液的制备步骤如下：
13.将发光微球溶于mes缓冲液中，加入edc/nhs活化剂活化；
14.活化后洗涤、离心后，将发光微球用硼酸缓冲液复溶，随后加入相应毒品的单克隆抗体进行反应；
15.反应完毕后加入封闭剂进行封闭；
16.封闭过后，洗涤、离心，收集固体再次用硼酸缓冲液及封闭剂复溶、超声，使发光微球标记的特异性单克隆抗体均匀分散在缓冲液中。
17.在其中一个实施例中，所述发光微球与特异性单克隆抗体的质量比为(0.8～1.2mg):0.1mg；和/或
18.所述封闭剂是牛血清白蛋白；和/或
19.所述发光微球标记的毒品的特异单克隆抗体溶液中发光微球标记的特异性单克隆抗体的浓度为0.1～1mg/ml。
20.一种毒品检测试剂盒，包括：检测卡、样品裂解液以及如上述任一一项所述的毒品检测试条；
21.所述检测卡具有检测腔，并设有与所述检测腔连通的加样槽和观察窗，至少一条所述的毒品检测试条安装在所述检测腔内，且所述至少一条所述毒品检测试条用于检测的毒品不重复；所述检测线露于所述观察窗，所述样品垫位于所述检测卡的加样槽中，且所述检测线露于所述检测卡的观察窗。
22.上述的毒品检测试条，通过采用时间分辨发光微球进行标记和优选的抗体抗原配对，保证了毛发中大麻、摇头丸、可卡因毒品检测的高灵敏度要求。还可以同时检测毛发中的三种常见毒品，极大的提高了毛发中毒品检测的方便性。
23.上述的毒品检测试剂盒，采用了独有的样品裂解液，能快速释放毛发中的大麻、摇头丸、可卡因，不影响检测的特异性和灵敏度，并能在室温长期稳定保存，取材方便和保存稳定，为检测带来极大的便利性。在本方法使用的样品裂解液在加入毛发超声后，不仅可以加样检测毛发中大麻、摇头丸、可卡因毒品，还可以加样到其他毛发毒品系列的试剂卡，适用范围广，操作灵活。
24.此外，使用上述毒品检测试剂盒进行三项相应毒品检测时间为10min，比传统的检测方法中需要数小时，快约数十倍，极大地提高检测效率，降低检测成本，满足现场检测现场执法的需求。
25.实验证明，利用本方法制作的毛发大麻、摇头丸、可卡因毒品检测试条，大麻灵敏度能达到2.0ng/ml，摇头丸灵敏度能达到1.0ng/ml，可卡因灵敏度能达到5.0ng/ml。明显优于市面上普遍的快速毒品检测对应的产品的灵敏度。利用本方法检测了确定为阴性的样本30人份，加标大麻、摇头丸、可卡因为阳性的毛发样品各30份，检测符合率在100％。
附图说明
26.图1为本发明一实施例的毒品检测试条的结构示意图。
27.其中，附图标记与部件名称之间的对应关系为：
28.1、样品垫；2、结合垫；3、检测膜；4、吸收垫；5、底板；6、质控线；7、检测线。
具体实施方式
29.为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的最佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
30.需要说明的是，当元件被称为“固定于”、“设于”另一个元件，它可以直接在另一个元件上或者也可以存在居中的元件。当一个元件被认为是“连接”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件或者可能同时存在居中元件。
31.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
32.如图1所示，本发明一实施例提供了一种毒品检测试条，其包括样品垫1、结合垫2、检测膜3、吸收垫4和底板5，样品垫1、结合垫2、检测膜3和吸收垫4在底板5上依次连接；结合垫2上设有至少一种毒品的发光微球标记的特异性单克隆抗体(如广州万翎生物技术有限公司生产的单克隆抗体产品)，检测膜3上具有至少一条分别对应毒品的检测线7，检测线7包被有相应毒品的合成抗原(如广州万翎生物技术有限公司生产的合成抗原)，毒品包括大麻、摇头丸及可卡因的至少其中一种或其组合物。
33.在本实施例中，结合垫2上设有至少一种毒品的发光微球标记的特异性单克隆抗体，可以与检测的毒品小分子产高效地发生特异性结合。本实施例中的检测膜3为硝酸纤维素膜。检测膜3上具有至少一条分别对应于相应毒品的检测线7。各检测线7包被有相应的毒品合成抗原，一种偶联了牛血清白蛋白的小分子，与检测毒品分子相似的物质，更有利于结合到检测膜3上。本发明所述的待检测毒品分别是大麻(thc)、摇头丸(mdma)、可卡因(coc)。
34.上述的毒品检测试条，采用发光微球作为标记物，当待测样品中的毒品抗原分子与结合垫2中的发光微球标记的毒品特异性单克隆抗体结合并通过毛细作用向前层析，当达到检测区后，与检测线上固定的毒品抗体结合，形成发光微球
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毒品特异性单克隆抗体
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毒品抗原
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毒品抗体的夹心复合物并固定在检测线上。在反应结束后，用激发光对检测区扫描检测，检测线发光，且衰变时间较长。利用延缓测量时间，待待测样品中自发的背景光全部衰变后，再测量特异性光，就可以排除本底光的干扰，大大提高了待测样品检测灵敏度。
35.在本实施例中，毒品检测试条的结合垫2上设有一种发光微球标记的特异性单克隆抗体，且该毒品检测试条的检测膜3上具有一条检测线。此时，毒品检测试条的检测特异性好，准确率高。
36.如图1所示的具体示例中，每张毒品检测试条的结合垫2上设有三种发光微球标记的特异性单克隆抗体，且该毒品检测试条的检测膜3上具有三条检测线。因而，该毒品检测试条可以实现同时检测三种毒品的作用。极大地提高了毒品检测的效率。
37.本实施例中的毒品检测试条，检测膜的制备步骤如下：将发光微球标记的特异性单克隆抗体溶液涂布在检测膜。将至少一种毒品的合成抗原溶液划线于检测膜上，形成对应于不同毒品的检测线；毒品为大麻、摇头丸、可卡因中至少其中一种，干燥后即得。制作检测膜时干燥条件可以是但不限于在37～45℃下干燥12～48小时。
38.在本实施例中的毒品检测试条，结合垫的制备步骤如下：将发光微球标记的至少一种所述毒品的特异性单克隆抗体溶液均匀涂布在结合垫上，干燥后即得。制作结合垫时干燥条件可以是但不限于在37～45℃下干燥1～7小时。
39.在一个具体实施例中，合成抗原溶液是将相应的合成抗原使用浓度优选为0.005～0.02mol/l，ph值为7.2～7.4的磷酸盐缓冲液或浓度为0.05％～4％，ph值为7.2～7.4的海藻糖稀释液稀释至浓度为0.3mg/ml～1mg/ml得到。
40.如图1所示，本实施例中的毒品检测试条，检测膜3上还设有质控线6，质控线6优选包被羊抗鸡igy抗体。通过在检测膜3上同时设置质控线6，待测样品中的毒品抗原分子与结合垫2中的发光微球标记的毒品特异性单克隆抗体结合并通过毛细作用向前层析，当达到检测区后，与检测线7上固定的毒品抗体结合，形成发光微球
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毒品特异性单克隆抗体
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毒品抗原
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毒品抗体的夹心复合物并固定在检测线上，而多余的发光微球标记物继续向前层析，与固定在质控线6的二抗结合。在反应结束后，用激发光对检测区扫描检测，检测线发光，且衰变时间较长。利用延缓测量时间，待待测样品中自发产生的背景光全部衰变后，再测量特异性光，通过检测线7和质控线6发光强弱的比值，即可分析出待测样品中待测毒品的浓度。
41.进一步地，在本实施例中的毒品检测试条，还包括在检测膜3上使用羊抗鸡igy抗体溶液进行划线，并干燥形成质控线6的步骤。其中，羊抗鸡igy抗体溶液优选是羊抗鸡igy抗体使用浓度优选为0.005～0.02mol/l，ph值为7.2～7.4的磷酸盐缓冲液或浓度为0.05％～4％，ph值为7.2～7.4的海藻糖稀释液稀释至浓度为1～3mg/ml得到。
42.本实施例中的毒品检测试条，发光微球为时间分辨荧光微球，通过使用长衰减寿命的标记物标记待测毒品的特异性单克隆抗体，如稀土元素荧光标记物，用稀土元素标记上述特异性单克隆抗体，根据稀土元素螯合物的发光特点，再用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，有效排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度。
43.在本实施例中的毒品检测试条，发光微球标记的毒品特异性单克隆抗体溶液通过如下步骤制备得到：
44.将东莞汉诺生物技术有限公司生产的200nm～400nm的发光微球(如荧光微球)溶于20mm～100mm的mes缓冲液中，优选ph为5～7，加入edc/nhs活化剂室温活化，优选加入量为5～50μl，时间为10～60min；
45.活化后洗涤、离心，将收集的发光微球用硼酸缓冲液复溶，优选浓度为5mm～50mm，ph7～8.5，随后加入相应毒品的特异性单克隆抗体进行反应；
46.反应完毕后加入封闭剂进行封闭，优选加入量为50μl～100μl；
47.封闭过后，洗涤、离心，收集固体最再次用硼酸缓冲液及封闭剂复溶，优选加入浓度为5mm～20mm，ph7～8.5，加入恢复原有体积的量，超声使发光微球标记的特异性单克隆抗体均匀分散在缓冲液中，于2～8℃避光保存。
48.其中，发光微球与特异性单克隆抗体的质量比优选为(0.8～1.2):0.3.封闭剂优选是牛血清白蛋白。最终制备的发光微球标记的三种毒品的特异性单克隆抗体溶液中发光微球标记的特异性单克隆抗体的浓度优选为0.1mg/ml～1mg/ml。
49.涂布时可以使用但不限于biodot点膜仪将相应的溶液均匀喷涂在经过预处理的结合垫上。所述预处理是先在结合垫加入0.05％～2.50％的tween
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80或tx
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100溶液10ml～
80ml烘干改性。
50.本发明还提供了一种毒品检测试剂盒，包括：检测卡、样品裂解液以及如前述任一一项的毒品检测试条；
51.检测卡具有检测腔，并设有与检测腔连通的加样槽和观察窗，至少一条的毒品检测试条安装在检测腔内，且至少一条所述毒品检测试条用于检测的毒品不重复；检测线露于观察窗，样品垫位于检测卡的加样槽中，且所述检测线露于检测卡的观察窗。优选地，上述毒品检测试剂盒中的样品裂解液是一种快速裂解毛发并释放大麻(thc)、摇头丸(mdma)、可卡因(coc)的液体，分装至2ml的冻存管内保存。
52.以下为具体的检测实施例部分。
53.检测的时候剪取嫌疑人少量根部毛发并剪碎，放入毛发裂解液中，超声5分钟，吸取毛发裂解液加入到检测卡的加样口中，等待5分钟后放进荧光定量分析仪中读取数据，最后可分别得到毛发中大麻(thc)、摇头丸(mdma)、可卡因(coc)的含量。
54.利用本方法制作的毛发大麻(thc)、摇头丸(mdma)、可卡因(coc)检测试剂条，检测时间为10min，比传统的检测方法(数小时)要快约数十倍。
55.利用本方法使用的毛发裂解液在加入毛发超声后，不仅可以加样检测毛发中大麻(thc)、摇头丸(mdma)、可卡因(coc)毒品，还可以加样到其他毛发毒品系列的试剂卡，极大的提高检测效率及检测方便性。
56.利用本方法制作的毛发大麻(thc)、摇头丸(mdma)、可卡因(coc)试剂卡，大麻(thc)灵敏度能达到2.0ng/ml，摇头丸(mdma)灵敏度能达到1.0ng/ml，可卡因(coc)灵敏度能达到5.0ng/ml。明显优于市面上普遍的快速毒品检测对应的产品的灵敏度。
57.利用本方法检测了确定为阴性的样本30人份，加标大麻(thc)、摇头丸(mdma)、可卡因(coc)为阳性的毛发样品各30份，检测符合率在100％。
58.以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
59.以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。