用于碟式微流控芯片的尿液生化检测系统

本发明涉及微流控技术领域和生物医学工程领域，特别涉及一种用于碟式微流控芯片的尿液生化检测系统。

背景技术：

尿液是易获得的体液来源，属于无创检测。可用来检测尿液中蛋白质的方法有酶免疫法、放射免疫法、免疫比浊法等，酶免疫法由于操作周期较长已经慢慢退出快检市场，主要应用在实验室领域；放射免疫比浊法虽具有灵敏度高、特异性强、回收率高的特点，但在操作过程中存在一定的放射污染，且对样本的留样具有严格的要求，不利于研究的开展；近几年免疫比浊法凭借其低成本、快捷测试、高通量等优势占据了一定的市场。

传统的肾功能指标，如血尿肌酐水平检测已经无法满足早期诊断的需要。尿液中蛋白质的含量高低是临床中对相关疾病进行诊断的一项重要指标，例如视黄醇结合蛋白(rbp)、微量白蛋白等。当肾脏滤过功能降低时，尿液中rbp含量显著升高。尿rbp排量与肾小管间质损害程度有明显相关性，可作为肾病监测、指导治疗和判断预后的指标。大型、全自动生化分析系统在临床应用比较广泛，但目前针对尿液的蛋白质快速检测系统开发程度不足，检测特异性不高。

随着微流控技术的快速发展，微流控芯片可实现在几平方厘米甚至更小的尺度上完成传统实验室的样品制备、分离、纯化、检测等过程，具有体积小、集成度高、分析速度快、消耗试剂少等优点，被广泛运用于生物医学、环境监测、分析化学等领域。芯片的多重分析单元可以同时检测多份样本，易于满足较高通量的检测，可缩小检测设备的体积，实现设备的便携性，可用于现场检测。

所以，现在有必要提供一种结合微流控芯片进行尿液生化检测的方案。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种用于碟式微流控芯片的尿液生化检测系统及方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种用于碟式微流控芯片的尿液生化检测系统，包括：

微流控芯片，其具有至少一个可独立实现检测功能的微流道单元；

旋转驱动机构，其用于驱动所述微流控芯片进行旋转；

以及双光路光学检测系统，其包括第一光源、第二光源、二向色镜、非偏振分束立方体、参考光路以及检测光路；

所述参考光路包括参考光聚光透镜和第一光电二极管，所述检测光路包括检测光聚光透镜和第二光电二极管；

所述第一光源发出的波长为λ1的光透射所述二向色镜后到达所述非偏振分束立方体，被分束为两部分，一部分经所述参考光聚光透镜后到达所述第一光电二极管，另一部分经所述检测光聚光透镜后照射到所述微流控芯片中的样品上，透射样品的光再入射到所述第二光电二极管上；

所述第二光源发出的波长为λ2的光被所述二向色镜反射后到达所述非偏振分束立方体，被分束为两部分，一部分经所述参考光聚光透镜后到达所述第一光电二极管，另一部分经所述检测光聚光透镜后照射到所述微流控芯片中的样品上，透射样品的光再入射到所述第二光电二极管上；

其中，λ1与λ2不相等。

优选的是，所述第一光源包括沿光路方向依次设置的第一led灯、第一滤光片和第一光源聚光透镜，所述第二光源包括沿光路方向依次设置的第二led灯、第二滤光片和第二光源聚光透镜。

优选的是，所述非偏振分束立方体将入射光中的10％分至所述参考光路，另外的90％分至所述检测光路。

优选的是，λ1＝340-600nm，λ2＝650-750nm。

优选的是，所述微流道单元包括混合室、通过第一流道与所述混合室连通的样品室、通过第二流道与所述混合室连通的第一试剂腔、通过第三流道与所述混合室连通的检测室以及通过第四流道与所述检测室连通的第二试剂腔。

优选的是，所述第一流道上设置有毛细阀，所述第二流道和第三流道上均设置有虹吸阀，所述第四流道上设置有常闭的铁腊阀。

优选的是，所述样品室和检测室的深度分别为0.5mm和2mm，第一试剂腔、第二试剂腔和混合室的深度均为1.5mm；

所述虹吸阀、毛细阀的宽度和深度均为0.3mm，所述铁腊阀的宽度和深度分别为1.1mm和0.45mm。

优选的是，该系统的检测方法包括以下步骤：

1)将待测样品、试剂1、试剂2分别加入到所述微流控芯片上的样品室、第一试剂腔、第二试剂腔内；

2)通过旋转驱动机构驱动所述微流控芯片以第一速度进行旋转，使待测样品和试剂1均进入所述混合室，混匀孵育后，控制所述微流控芯片以第二速度进行旋转，使待测样品和试剂1一起转移到所述检测室；

3)使所述常闭铁腊阀开启，再通过旋转驱动机构驱动所述微流控芯片以第三速度进行旋转，使试剂2进入检测室与待测样品、试剂1混匀，孵育；

4)孵育t1时间后，通过双光路光学检测系统对检测室中的反应产物进行光学检测，在第一光源开启、第二电源关闭下通过所述第二光电二极管采集吸光度值，记为a1λ1；在第一光源关闭、第二电源开启下通过所述第二光电二极管采集吸光度值，记为a1λ2；计算t1时刻的吸光度差值δat1＝a1λ1-a1λ2；

孵育t2时间后，在第一光源开启、第二电源关闭下通过所述第二光电二极管采集吸光度值，记为a2λ1；在第一光源关闭、第二电源开启下通过所述第二光电二极管采集吸光度值，记为a2λ2；计算t2时刻的吸光度差值δat2＝a2λ1-a2λ2；

计算t1时刻和t2时刻的吸光度差值，记为最终吸光度差值δa，δa＝t2-t1；

5)按照上述步骤1)-4)重复测量n次，计算得到的n个最终吸光度差值δa的平均值：δa'；

6)将δa'与预先建立的表征最终吸光度差值的平均值与浓度值之间的关系的标准曲线进行对比计算，得到目标物的浓度。

优选的是，其中，标准曲线的建立方法为：采用具有一定浓度梯度的若干标准品代替步骤1)中的待测样品，对每个浓度的标准品分别按照步骤1-5)进行检测，得到每个浓度的标准品所对应的最终吸光度差值的平均值，以标准品的浓度为横坐标，各浓度的标准品对应的最终吸光度差值的平均值为纵坐标，拟合得到标准曲线。

优选的是，其中，参考光路获得的检测结果用于在检测过程中对所述双光路光学检测系统进行校准，校准方法为：

采用第一光源对空白碟式微流控芯片进行m次测量，将每次测量结果中的参考光路的结果作为x轴、对应的检测光路的结果作为y值，拟合得到第一光源下的线性曲线l1；

采用第二光源对空白碟式微流控芯片进行m次测量，将每次测量结果中的参考光路的结果作为x轴、对应的检测光路的结果作为y值，拟合得到第二光源下的线性曲线l2；

其中的空白碟式微流控芯片为无样品的碟式微流控芯片或是装有标准品的碟式微流控芯片；

在检测过程中，通过线性曲线l1对所述双光路光学检测系统采用第一光源工作时进行校准，使所述双光路光学检测系统的检测结果满足：参考光路的结果与检测光路的结果满足线性曲线l1的关系；通过线性曲线l2对所述双光路光学检测系统采用第二光源工作时进行校准，使所述双光路光学检测系统的检测结果满足：参考光路的结果与检测光路的结果满足线性曲线l2的关系。

本发明的有益效果是：

本发明提供的用于碟式微流控芯片的尿液生化检测系统能够实现便携性和现场检测的需求，系统体积小，整个过程只需加样，离心、孵育和光电检测等过程全部在芯片上完成，操作简单，样品用量少，检测效率高，可实现快速、高通量检测；

本发明中，通过双光路设计和双波长检测方法能降低光源波动和背景干扰对检测结果的影响。

附图说明

图1为本发明的实施例1中的用于碟式微流控芯片的尿液生化检测系统的结构示意图；

图2为本发明的实施例1中的微流控芯片的结构示意图；

图3为本发明的实施例1中的微流道单元的结构示意图；

图4为本发明的实施例2中的标准曲线；

图5为本发明的实施例2中的3条线性曲线。

附图标记说明：

1—微流控芯片；2—微流道单元；3—双光路光学检测系统；20—混合室；21—第一流道；22—样品室；23—第二流道；24—第一试剂腔；25—第三流道；26—检测室；27—第四流道；28—第二试剂腔；30—第一光源；31—第二光源；32—二向色镜；33—非偏振分束立方体；34—参考光路；35—检测光路；210—毛细阀；230—虹吸阀；270—铁腊阀；300—第一led灯；301—第一滤光片；302—第一光源聚光透镜；310—第二led灯；311—第二滤光片；312—第二光源聚光透镜；340—参考光聚光透镜；341—第一光电二极管；350—检测光聚光透镜；351—第二光电二极管。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

实施例1

如图1-3所示，本实施例的一种用于碟式微流控芯片的尿液生化检测系统，包括：

微流控芯片1，其具有至少一个可独立实现检测功能的微流道单元2；

旋转驱动机构，其用于驱动微流控芯片1进行旋转；

以及双光路光学检测系统3，其包括第一光源30、第二光源31、二向色镜32、非偏振分束立方体33、参考光路34以及检测光路35；

参考光路34包括参考光聚光透镜340和第一光电二极管341，检测光路35包括检测光聚光透镜350和第二光电二极管351；

第一光源30发出的波长为λ1的光透射二向色镜32后到达非偏振分束立方体33，被分束为两部分，一部分经参考光聚光透镜340后到达第一光电二极管341，另一部分经检测光聚光透镜350后照射到微流控芯片1中的样品上，透射样品的光再入射到第二光电二极管351上；

第二光源31发出的波长为λ2的光被二向色镜32反射后到达非偏振分束立方体33，被分束为两部分，一部分经参考光聚光透镜340后到达第一光电二极管341，另一部分经检测光聚光透镜350后照射到微流控芯片1中的样品上，透射样品的光再入射到第二光电二极管351上；

其中，λ1与λ2不相等。

其中，旋转驱动机构为旋转电机，该系统还包括上位机，上位机用于对旋转电机、双光路光学检测系统3进行控制。

本实施例中，λ1＝700nm，λ2＝546nm。

其中，第一光源30包括沿光路方向依次设置的第一led灯300、第一滤光片301和第一光源聚光透镜302，第二光源31包括沿光路方向依次设置的第二led灯310、第二滤光片311和第二光源聚光透镜312。

在一种优选的实施例中，非偏振分束立方体33将入射光中的10％分至参考光路34，另外的90％分至检测光路35。

本实施例中，微流道单元2包括混合室20、通过第一流道21与混合室20连通的样品室22、通过第二流道23与混合室20连通的第一试剂腔24、通过第三流道25与混合室20连通的检测室26以及通过第四流道27与检测室26连通的第二试剂腔28。其中，第一流道21上设置有毛细阀210，第二流道23和第三流道25上均设置有虹吸阀230，第四流道27上设置有常闭的铁腊阀270。微流控芯片1的材料可以使用热塑性材料，如pmma，pc，coc等。

在一种优选的实施例中，样品室22和检测室26的深度分别为0.5mm和2mm，第一试剂腔24、第二试剂腔28和混合室20的深度均为1.5mm；

虹吸阀230、毛细阀210的宽度和深度均为0.3mm，铁腊阀270的宽度和深度分别为1.1mm和0.45mm。

本实施例中，包括芯片结构层、压敏胶层和封装薄膜层

本实施例中，微流控芯片1上具有4个微流道单元2，通过控制微流控芯片1旋转，可将微流道单元2中的检测室26切换进出双光路光学检测系统3的光路中，通过双光路光学检测系统3对检测室26的吸光度进行检测。

实施例2

本实施例提供一种用于碟式微流控芯片1的尿液生化检测系统的检测方法，包括以下步骤：

1)将待测样品、试剂1、试剂2分别加入到微流控芯片1上的样品室22、第一试剂腔24、第二试剂腔28内；

2)通过旋转驱动机构驱动微流控芯片1以第一速度进行旋转，使待测样品和试剂1均进入混合室20，混匀孵育后，控制微流控芯片1以第二速度进行旋转，使待测样品和试剂1一起转移到检测室26；

3)使常闭铁腊阀270开启，再通过旋转驱动机构驱动微流控芯片1以第三速度进行旋转，使试剂2进入检测室26与待测样品、试剂1混匀，孵育；

4)孵育t1时间后，通过双光路光学检测系统3对检测室26中的反应产物进行光学检测，在第一光源30开启、第二电源关闭下通过第二光电二极管351采集吸光度值，记为a1λ1；在第一光源30关闭、第二电源开启下通过第二光电二极管351采集吸光度值，记为a1λ2；计算t1时刻的吸光度差值δat1＝a1λ1-a1λ2；

孵育t2时间后，在第一光源30开启、第二电源关闭下通过第二光电二极管351采集吸光度值，记为a2λ1；在第一光源30关闭、第二电源开启下通过第二光电二极管351采集吸光度值，记为a2λ2；计算t2时刻的吸光度差值δat2＝a2λ1-a2λ2；

计算t1时刻和t2时刻的吸光度差值，记为最终吸光度差值δa，δa＝t2-t1；

5)按照上述步骤1)-4)重复测量10次，计算得到的10个最终吸光度差值δa的平均值：δa'；

6)将δa'与预先建立的表征最终吸光度差值的平均值与浓度值之间的关系的标准曲线进行对比计算，得到目标物的浓度。

其中，标准曲线的建立方法为：采用具有一定浓度梯度的若干标准品代替步骤1)中的待测样品，对每个浓度的标准品分别按照步骤1-5)进行检测，得到每个浓度的标准品所对应的最终吸光度差值的平均值，以标准品的浓度为横坐标，各浓度的标准品对应的最终吸光度差值的平均值为纵坐标，拟合得到标准曲线。在一种实施例中，标准品为浓度为9.3mg/lurbp校准品，用生理盐水按稀释因子1、1/2、1/4、1/8、1/16和0稀释为6个浓度梯度：9.3mg/l、4.65mg/l、2.32mg/l、1.16mg/l、0.58mg/l和0，按照上述标准曲线的建立方法，每个浓度重复测定3次，拟合得到标准曲线如图4所示，其表达式为：y＝0.05668+(0.00314-0.05668)/(1+(x/3.28686)^1.60767)，r²＝0.99549；其中，x为浓度，y为最终吸光度差值的平均值。

本实施例中，待测样品为尿液，需检测的目标物为尿液中的尿视黄醇结合蛋白(rbp)，以此为例进行说明。其中，λ1＝700nm，λ2＝546nm；t1＝10s，t2＝5min。

本实施例中，采用了两种浓度的尿视黄醇结合蛋白质控品(urbp)对系统的精密度进行了检测，具体步骤为：

分别采用5μl的浓度为1mg/l和4.3mg/lurbp质控品代替上述步骤1)中的待测样品，其余的试剂用量为：120μl试剂1和30μl试剂2，其中，试剂1含有0.1mol/l磷酸盐缓冲液、0.1mol/l氯化钠和30g/l聚乙二醇6000；试剂2含有0.1mol/l磷酸盐缓冲液、0.1mol/l氯化钠和14g/l包被羊抗人视黄醇结合蛋白抗体的乳胶颗粒。然后按照以上步骤1)-6)进行实验，得到的低浓度urbp质控品(1mg/l)重复测量10的最终吸光度差值的数值如下表1所示，计算后得到其最终吸光度差值的平均值为0.00999，标准差为0.00024，变异系数(cv)为2.42％；高浓度urbp质控品(4.3mg/l)重复测量10的最终吸光度差值的数值如下表2所示，计算后得到其最终吸光度差值的平均值为0.03853，标准差为0.0005，变异系数(cv)为1.30％。可以看出，高浓度和低浓度质控品精密度都满足cv≤5％，说明系统具有较好的重复性。

表1

表2

本实施例中，参考光路34获得的检测结果用于在检测过程中对双光路光学检测系统3进行校准，校准方法为：

采用第一光源30对标准品(也可采用无样品的碟式微流控芯片)进行m次测量，将每次测量结果中的参考光路34的结果作为x轴、对应的检测光路35的结果作为y值，拟合得到第一光源30下的线性曲线l1；

采用第二光源31对标准品(也可采用无样品的碟式微流控芯片)进行m次测量，将每次测量结果中的参考光路34的结果作为x轴、对应的检测光路35的结果作为y值，拟合得到第二光源31下的线性曲线l2；

在检测过程中，通过线性曲线l1对双光路光学检测系统3采用第一光源30工作时进行校准，使双光路光学检测系统3的检测结果满足：参考光路34的结果与检测光路35的结果满足线性曲线l1的关系；通过线性曲线l2对双光路光学检测系统3采用第二光源31工作时进行校准，使双光路光学检测系统3的检测结果满足：参考光路34的结果与检测光路35的结果满足线性曲线l2的关系。也即在检测过程中，通过线性曲线l1/l2作为标准对双光路光学检测系统3进行校准，当该系统中的参考光路34与检测光路35的测量结果满足对应的线性曲线l1/l2时，说明该系统完成了校准。

以下在对上述校准方法的原理进行说明，以便于对本发明的理解。

双光路光学检测系统3的检测原理是基于光电比色法和郎伯比尔定律(lamber-beerlaw)，其表达式为a＝lg(i0/i)＝kbc，其中，a为吸光度；i0为入射光强；i为透射光强；k为吸光系数，l/g*cm；b为光程，cm；c为被测物的质量浓度，g/l。

本实施例中，该系统用了检测光和参考光双光路补偿设计，可消除光源自身波动引起的误差。假设光源发出的光强设置为i0，非偏振分束立方体33的分光比为rr/rs(rr为参考光路34的比例，rs为检测光路35的比例)，检测光路35受到光纤的影响为αs，两个光路使用相同的放大模块对光电二极管产生的信号进行处理，假定检测光路35放大模块对光强的影响为βs，参考通道放大模块对光强的影响为βr。

检测光路35采集的电压信号为：

vs＝i0[rs/(rr+rs)]αsβs；

参考光路34采集的电压信号为：

vr＝i0[rr/(rr+rs)]βr；

由于使用的放大模块相同，所以βs和βr的值相等；将两式相除得

在测量通道的光纤没有受到外界影响的情况下，光纤对测量通道的影响保持不变，所以αs为固定的值；非偏振分束立方体33的分光比为固定的值，因此m为常数。所以检测光路35采集的信号与参考光路34采集的信号之间满足线性关系，通过测量得到的数据拟合得到的线性曲线可用于双光路光学检测系统3的校准。

本实施例中，对波长为546nm和700nm的光源分别进行3次测量，并通过matlab对两个光路采集的数据进行拟合，以参考光路34数据为x轴，检测光路35数据为y轴，两个光路在不同波长的光源下进行3次测量后拟合得到的3条线性曲线如图5所示。结果表明两个通道都具有较好的线性相关性(即拟合度r²接近1)，且具有较好的重复性。546nm波长下，两光路的线性曲线近似为y＝3.3x+0.08；700nm波长时，两光路的线性曲线近似为y＝2.54x+0.08。拟合得到的线性曲线可用于后续检测过程中的系统校准。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。