一种食源性致病菌的快速检测方法及系统

1.本发明属于检测技术领域，利用纳米传感、荧光、成像等技术手段实现食源性致病菌的快速高灵敏检测，具体涉及一种食源性致病菌的快速检测方法及系统。


背景技术：

2.食源性致病菌污染途径广，不易被察觉，易产毒素，严重危害人们身体健康，近年来，由于牛奶中食源性致病菌所引起的安全问题不断出现，给社会公共卫生安全造成了严重威胁。传统检测方法虽然具有成本低、准确度高的优点，但操作步骤繁琐、鉴定微生物种类有限，无法满足快速检测的需求。分子生物学等方法虽然具有快速、高灵敏度的优点，但存在所需设备昂贵、需要专业人员操作及出现假阳性等缺点。因此，为了避免食源性致病菌所带来的危害，更好地监视相关食源性疾病的发生和传播，建立快速高灵敏的牛奶中食源性致病菌检测方法具有十分重要的意义。上转换荧光技术作为近年来应用较多的一种新型荧光技术，在检测中具有荧光背景低、光学性质稳定等优点，可提高检测系统的灵敏度，被广泛应用于生物分析和成像领域。
3.目前，将上转换发光材料与磁性富集材料填充至聚苯乙烯微球中制备多特性粒子，作为荧光捕捉探针；以特异性识别元件与上转换发光材料连接，作为信号探针，结合荧光光谱及成像技术实现食源性致病菌的快速、高灵敏检测仍未见报道。


技术实现要素：

4.为了解决现有技术中存在的不足，本发明提出了一种食源性致病菌的快速检测方法及系统，目的在于其灵敏度高、可靠性强、检测速度快的食源性致病菌的快速检测方法，能够实现对典型食源性致病菌检测的目的，适用于食品安全、环境监测等技术领域。
5.本发明所采用的技术方案如下：
6.一种食源性致病菌的快速检测方法，将掺杂一种元素的上转换发光材料ucnps1与磁性富集材料mems填充至聚苯乙烯微球中，并将食源性致病菌的抗体连接至聚苯乙烯微球表面，形成多特性粒子，作为荧光捕捉探针；再将食源性致病菌的特异性适配体apt与掺杂另一种元素的上转换发光材料ucnps2进行连接，形成ucnps
er
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apt信号探针；当待测物不存在时，荧光捕捉探针与信号探针独立存在；当待测物存在时，由于适配体、抗体对待测物的特异性识别，形成信号探针
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待测物
‑
荧光捕捉探针复合物，经磁分离后，复合物在980nm近红外光激发下，产生荧光信号，基于此原理建立了待测物浓度和荧光强度的关系曲线，实现食源性致病菌的快速高灵敏定量检测；该方法适用于食品安全、环境监测等技术领域。
7.进一步，所述多特性粒子以聚合物微球为基底进行制备，聚合物微球是直径在纳米级至微米级的球形高分子复合材料，对于单分散且表面功能化的聚合物微球具有良好的物理性能和化学性能。
8.进一步，所述聚苯乙烯微球是基于分散聚合法制备，在制备聚苯乙烯微球的过程中，将aibn、pvp、无水乙醇分别作为引发剂、稳定剂、分散介质，在通氩气的环境下进行反
应；步骤为：首先向四口圆底烧瓶通入氩气10
‑
15分钟，除去残留的氧气，加入含有pvp的无水乙醇；将aibn溶于苯乙烯中，加入至体系充分混合，在50
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55℃下反应30
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40分钟，再升高温度至70
‑
75℃，反应12
‑
14小时。聚合反应结束后，用筛网过滤产物混合液，洗涤三次，除去未反应的杂质，最后将产物分散在乙醇水溶液中从而得到粒径均一的聚苯乙烯微球。
9.进一步，制备所述多特性粒子的方法为：首先以分散聚合法制得的聚苯乙烯微球为基底制备多孔聚苯乙烯微球，过程为：首先以环己烷为溶胀剂通过超声乳化的方法将其分散在sds溶液中，加入到圆底烧瓶中搅拌，在30
‑
35℃下溶胀10
‑
12小时；以过氧化苯甲酰为引发剂溶于苯乙烯中，再加入交联剂egdma、maa和致孔剂，通过超声乳化的方法均匀分散在溶液中，继续在30℃下溶胀16
‑
18小时；加入聚乙烯醇溶液，升温至80
‑
82℃，反应16
‑
17小时；反应结束后，用筛网过滤，再用乙醇/水洗涤三次，将聚合物微球分散在乙醇/水溶液中；将实验所制备的ucnp与mems粒子，包入所制备的多孔聚苯乙烯微球中；操作步骤为：取所制备的羧基化的多孔聚苯乙烯微球，加入ode超声30
‑
35秒，加入500μl的上转换荧光纳米材料溶液和chcl3震荡30
‑
40秒；加入mems，混合均匀，在45℃的条件下反应2小时；继续升温，在180
‑
185℃下保持30
‑
35min，迅速降温，加入环己烷离心三次，最后分散在乙醇溶液中，获得多特性粒子。
10.进一步，取上述多特性粒子，加入ph为7.4的pbs缓冲液超声，离心移去上清液；加入mes缓冲液，洗涤3次；再次向微球中加入mes缓冲液，以及edc和nhs，震荡反应30
‑
35分钟，然后再使用pbs缓冲液离心洗涤3次完成活化；向上述溶液中加入食源性致病菌的抗体，37℃下通过摇床孵育30分钟，离心去上清液，用pbs溶液对其洗涤3次，使未连接成功的食源性致病菌抗体被除去，获得捕捉探针。
11.进一步，所述多特性粒子通过表面偶联适配体分子，具有极高的生物相容度。
12.进一步，所述多特性粒子上填充上转换发光材料与磁性富集材料，因此同时具有信号响应及磁性捕捉性能。
13.进一步，由于荧光捕捉探针与信号探针对待测物的特异性识别，形成信号探针
‑
待测物
‑
荧光捕捉探针复合物，故检测方法具有双荧光检测特性，可实现食源性致病菌的快速检测及判别。
14.进一步，利用图像采集装置获取荧光图像，结合上转换发光材料的发光性能可调性质，通过对所获取的不同发光图像进行合并，可实现食源性致病菌的快速判别，该判别方法相比于使用染料的判别方法，结果更可靠，准确；利用染料检测的判别方法会引起光漂白、光损伤和自荧光问题。
15.进一步，所述的判别方法具有显著的光稳定性，能长期监测上转换标记的食源性致病菌，而没有显著信号强度的损失。
16.进一步，检测过程如下：
17.步骤1、食源性致病菌的培养与计数：首先，将食源性致病菌接种于所配制的牛肉膏培养基上，恒温倒置培养24
‑
28小时；取出培养皿，在超净工作台中从平板上挑出单一分散菌落，将挑出的菌落转移至装有牛肉膏液体培养基的锥形瓶内，在37℃下摇动孵育18小时；然后使用ph 7.4的pbs缓冲液将菌液稀释十倍，制成一系列浓度梯度的菌液，从每个梯度的菌液中吸取300μl，涂布在牛肉膏琼脂培养基上，在37℃下恒温倒置培养，最终通过计数平板上的菌落数确定每毫升菌落形成单位的数量；所用培养皿、锥形瓶均经过高温高压
灭菌，操作均在无菌环境下进行；
18.步骤2、ucnps的制备与修饰：按照比例称取六水合氯化钇，六水合氯化镱和一水合氯化铥，溶解在锥形瓶中，加入10ml甲醇用于超声溶解；然后加入6ml的油酸和15ml的1
‑
十八烯，并在氩气下，转移至三口烧瓶中排气10分钟；将该溶液在搅拌状态下，在160℃下反应30分钟，然后冷却至室温，缓慢添加0.1482g氟化铵和0.1g氢氧化钠的混合溶液；在密闭环境中，在50℃下搅拌30分钟，然后在70℃下搅拌40分钟；将温度升至100℃，并维持大流量排气10分钟；最后，将温度快速升高至300℃保持1小时，然后冷却至室温；向含有ucnps的混合溶液中，加入5ml水和20ml乙醇，然后离心；为了获得无杂质的上转换纳米材料，分别添加20ml环己烷和20ml乙醇进行多次清洗，最后离心；由于通过上述步骤合成的ucnps的表面具有油酸层，因此材料仅可溶于有机试剂中并且不溶于水，这限制了其与相关抗体、适配体的连接与应用；因此，通过羧基化的方法对材料的表面进行改性；改性的操作为：称取四氟硼酸亚硝固体粉末，溶解于n，n
‑
二甲基甲酰胺溶液中；接着将上转换溶液加入到n，n
‑
二甲基甲酰胺溶液中，此时出现分层；将分层溶液上下晃动溶液10min，将体积比为1：1的甲苯和环己烷混合溶液加入至上述颗粒分散均匀的溶液中，超声混合均匀；离心3次，每次取沉淀物重新分散在n，n
‑
二甲基甲酰胺溶液中；然后加入丙烯酸水溶液，持续搅拌加热到80℃，维持该温度并继续搅拌30min；最后加入丙酮，离心3次，沉淀物分散在2ml超纯水中；
19.步骤3、聚苯乙烯微球的制备：基于分散聚合法制备聚苯乙烯微球；将aibn、pvp、无水乙醇分别作为引发剂、稳定剂、分散介质，在通氩气的环境下进行反应；具体步骤为：首先向四口圆底烧瓶通入氩气10分钟，除去残留的氧气，加入含有pvp的无水乙醇；将aibn溶于苯乙烯中，加入至体系充分混合，在50℃下反应30分钟，再升高温度至70℃，反应12小时；聚合反应结束后，用筛网过滤产物混合液，洗涤三次，除去未反应的杂质，最后将产物分散在乙醇水溶液中从而得到粒径均一的微球；
20.步骤4、多特性粒子的制备：以分散聚合法制得的聚苯乙烯微球为基底制备多孔聚苯乙烯微球；首先以环己烷为溶胀剂通过超声乳化的方法将其分散在sds溶液中，加入到圆底烧瓶中搅拌，在30℃下溶胀10小时；以过氧化苯甲酰为引发剂溶于苯乙烯中，再加入；交联剂egdma、maa和致孔剂，通过超声乳化的方法均匀分散在溶液中，继续在30℃下溶胀16小时；加入聚乙烯醇溶液，升温至80℃，反应16小时；反应结束后，用筛网过滤，再用乙醇/水洗涤三次，将聚合物微球分散在乙醇/水溶液中；将实验所制备的ucnps1与mems粒子，包入所制备的多孔聚苯乙烯微球中；具体操作步骤为：取所制备的羧基化的多孔聚苯乙烯微球，加入；ode超声30秒，加入500μl的上转换荧光纳米材料溶液和chcl3震荡30秒；加入制备的mems，混合均匀，在45℃的条件下反应2小时；继续升温，在180℃下保持30min，迅速降温，加入环己烷离心三次，最后分散在乙醇溶液中，获得多特性粒子；
21.步骤5、捕捉探针的制备：取上述多特性粒子，加入ph为7.4的pbs缓冲液超声，离心移去上清液。加入mes缓冲液，洗涤3次。再次向微球中加入mes缓冲液，以及加入edc和nhs，震荡反应30分钟，然后再使用pbs缓冲液离心洗涤3次完成活化；向上述溶液中加入食源性致病菌抗体，37℃下通过摇床孵育30分钟，离心去上清液，用pbs溶液对其洗涤3次，使未连接成功的食源性致病菌抗体被除去，获得捕捉探针；
22.步骤6、信号探针的制备：称取羧基化的ucnps和edc溶解在超纯水中；震荡反应30
‑
35min后，加入ph＝7.4的pbs缓冲液和nhs，反应10
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12min；加入500μl的适配体，孵育一段时
间后离心，分离未连接的适配体，将产物再次重悬于pbs缓冲液中，获得apt
‑
ucnp
er
信号探针，贮藏于4℃冰箱以备后续使用；通过该反应，长链适配体被共价修饰到上转换纳米材料表面；
23.步骤7、检测方法的构建：由于ucnps1与mems被填充至聚苯乙烯微球中，并连接待测物单克隆抗体至微球表面，形成荧光捕捉探针；通过待测物特异性适配体与ucnps2进行连接，形成信号探针；当待测物存在时，由于适配体、抗体对待测物的特异性识别，形成信号探针
‑
待测物
‑
荧光捕捉探针复合物，经磁分离后，复合物在980nm近红外光激发下，产生双荧光信号；在一定浓度范围内，复合物荧光强度与待测物浓度呈线性关系。
24.一种食源性致病菌的快速检测系统，其特征在于，包括复合物荧光图像采集装置和食源性致病菌的定量检测单元，利用复合物荧光图像采集装置获取复合物双荧光图像的光谱信号，食源性致病菌的定量检测单元接收复合物荧光图像采集装置所采集的光谱信号，利用食源性致病菌的定量检测单元内存的待测物浓度和荧光强度的关系曲线，实现对复合物荧光信号的快速读取，同时对食源性致病菌进行快速判别及检测，实现食源性致病菌的定量检测。
25.本发明的有益效果：
26.1、本发明所制备的多特性粒子，通过填充上转换发光材料与磁性富集材料，因此同时具有信号响应及磁性捕捉性能。
27.2、本发明所述的检测方法具有双荧光检测特性，可实现食源性致病菌的快速检测及判别。
28.3、本发明所述的快速检测系统，利用设计的图像采集装置，获取荧光图像，结合上转换发光材料的发光性能可调性质，通过获取的不同发光图像的合并，可实现食源性致病菌的快速判别，该判别方法相比于使用染料的判别方法，结果更可靠，准确；利用染料检测的判别方法会引起光漂白、光损伤和自荧光问题。
29.4、本发明所述的判别方法具有显著的光稳定性，能长期监测上转换标记的食源性致病菌，而没有显著信号强度的损失。
附图说明
30.图1中，图a是ucnp的tem图；图b是聚苯乙烯微球的sem图；图c是多功能聚苯乙烯微球的sem图。
31.图2本发明快速检测方法的检测原理图。
具体实施方式
32.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
33.为了进一步验证本发明所构建方法对食源性致病菌检测的作用，本发明实例，仅以金黄色葡萄球菌为例，但是本技术所述的食源性致病菌不仅限于金黄色葡萄球菌，具体操作步骤如下：
34.1)食源性致病菌的培养与计数：首先，将金黄色葡萄球菌接种于所配制的牛肉膏
培养基上，恒温(37℃)倒置培养24
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28小时。取出培养皿，在超净工作台中从平板上挑出单一分散菌落，将挑出的菌落转移至装有牛肉膏液体培养基的锥形瓶内，在37℃下摇动孵育18小时。然后使用pbs缓冲液(ph 7.4)将菌液稀释十倍，制成一系列浓度梯度的菌液，从每个梯度的菌液中吸取300μl，涂布在牛肉膏琼脂培养基上，在37℃下恒温倒置培养，最终通过计数平板上的菌落数确定每毫升菌落形成单位的数量(cfu/ml)。本研究中所用培养皿、锥形瓶等均经过高温高压灭菌，操作均在无菌环境下进行；
35.2)ucnps的制备与修饰：按照比例称取六水合氯化钇，六水合氯化镱和一水合氯化铥，溶解在锥形瓶中。加入10ml甲醇用于超声溶解。然后加入6ml的油酸和15ml的1
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十八烯，并在氩气下，转移至三口烧瓶中排气10分钟。将该溶液在搅拌状态下，在160℃下反应30分钟，然后冷却至室温，缓慢添加0.1482g氟化铵和0.1g氢氧化钠的混合溶液。在密闭环境中，在50℃下搅拌30分钟，然后在70℃下搅拌40分钟。将温度升至100℃，并维持大流量排气10分钟。最后，将温度快速升高至300℃保持1小时，然后冷却至室温。向反应混合物(含有ucnps的混合溶液)中，加入5ml水和20ml乙醇，然后离心。为了获得无杂质的上转换纳米材料，分别添加20ml环己烷和20ml乙醇进行多次清洗，最后离心，获得ucnps，ucnp的tem图如图1a所示；由于通过上述步骤合成的ucnps的表面具有油酸层，因此材料仅可溶于有机试剂中并且不溶于水，这限制了其与相关抗体、适配体的连接与应用。因此，通过羧基化的方法对材料的表面进行改性。具体操作为：称取一定量的四氟硼酸亚硝固体粉末，溶解于n，n
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二甲基甲酰胺溶液中。接着将上转换溶液加入到n，n
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二甲基甲酰胺溶液中，此时出现分层。将分层溶液上下晃动溶液10min，将体积比为1：1的甲苯和环己烷混合溶液加入至上述颗粒分散均匀的溶液中，超声混合均匀。离心3次，每次取沉淀物重新分散在n，n
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二甲基甲酰胺溶液中。然后加入一定量的丙烯酸水溶液，持续搅拌加热到80℃，维持该温度并继续搅拌30min。最后加入丙酮，离心3次，沉淀物分散在2ml超纯水中；
36.3)聚苯乙烯微球的制备：基于分散聚合法制备聚苯乙烯微球。在该方法中，aibn、pvp、无水乙醇分别作为引发剂、稳定剂、分散介质，在通氩气的环境下进行反应。具体步骤为：首先向四口圆底烧瓶通入氩气10分钟，除去残留的氧气，加入含有一定pvp的无水乙醇。将aibn溶于苯乙烯中，加入至体系充分混合，在50℃下反应30分钟，再升高温度至70℃，反应12小时。聚合反应结束后，用筛网过滤产物混合液，洗涤三次，除去未反应的杂质，最后将产物分散在乙醇水溶液中从而得到粒径均一的微球，聚苯乙烯微球的sem图如图1b所示；
37.4)多特性粒子的制备：以分散聚合法制得的聚苯乙烯微球为基底制备多孔聚苯乙烯微球,多功能聚苯乙烯微球的sem图如图1c所示。首先以环己烷为溶胀剂通过超声乳化的方法将聚苯乙烯微球分散在sds溶液中，加入到圆底烧瓶中搅拌，在30℃下溶胀10小时。以过氧化苯甲酰为引发剂溶于苯乙烯中，再加入一定量的交联剂egdma、maa和致孔剂(甲苯)，通过超声乳化的方法均匀分散在溶液中，继续在30℃下溶胀16小时。加入聚乙烯醇溶液，升温至80℃，反应16小时。反应结束后，用筛网过滤，再用乙醇/水洗涤三次，将聚合物微球分散在乙醇/水溶液中；将实验所制备的ucnps
tm
与mems粒子，包入所制备的多孔聚苯乙烯微球中。具体操作步骤为：取所制备的羧基化的多孔聚苯乙烯微球，加入一定量的ode超声30秒，加入500μl的上转换荧光纳米材料溶液和chcl3震荡30秒。加入一定量的制备的mems，混合均匀，在45℃的条件下反应2小时。继续升温，在180℃下保持30min，迅速降温，加入环己烷离心三次，最后分散在乙醇溶液中，获得多特性粒子；
38.5)捕捉探针的制备：取一定量上述多特性粒子，加入ph为7.4的pbs缓冲液超声，离心移去上清液。加入mes缓冲液，洗涤3次。再次向微球中加入mes缓冲液，以及加入一定量的edc和nhs，震荡反应30分钟，然后再使用pbs缓冲液离心洗涤3次完成活化。向上述溶液中加入金黄色葡萄球菌单克隆抗体，37℃下通过摇床孵育30分钟，离心(10000rpm，5min)去上清液，用pbs溶液对其洗涤3次，使未连接成功的金黄色葡萄球菌单克隆抗体被除去，获得多特性粒子。
39.6)信号探针的制备：称取一定量羧基化的ucnps和edc溶解在超纯水中。震荡反应30min后，加入pbs缓冲液(ph＝7.4)和nhs，反应10min。加入500μl的适配体，孵育一定时间后离心，分离未连接的适配体，将产物再次重悬于pbs缓冲液中，获得apt
‑
ucnps
er
信号探针，贮藏于4℃冰箱以备后续使用。通过该反应，长链适配体被共价修饰到上转换纳米材料表面。
40.7)检测方法的构建：本发明所构建方法的检测原理图如图2所示，由于ucnps
tm
与mems被填充至聚苯乙烯微球中，并连接待测物单克隆抗体至微球表面，形成荧光捕捉探针。通过金黄色葡萄球菌特异性适配体与ucnps
er
进行连接，形成信号探针。当金黄色葡萄球菌存在时，由于适配体、抗体对待测物的特异性识别，形成信号探针
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金黄色葡萄球菌
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荧光捕捉探针复合物，经磁分离后，复合物在980nm近红外光激发下，产生双荧光信号。在一定浓度范围内，复合物荧光强度与待测物浓度呈线性关系。
41.此外，为了进一步实现对复合物荧光信号的快速读取，同时对金黄色葡萄球菌进行快速判别及检测，本技术还设计了一种食源性致病菌的快速检测系统，包括复合物荧光图像采集装置和食源性致病菌的定量检测单元，利用复合物荧光图像采集装置获取复合物双荧光图像的光谱信号，食源性致病菌的定量检测单元接收复合物荧光图像采集装置所采集的光谱信号，食源性致病菌的定量检测单元内存的待测物浓度和荧光强度的关系曲线，当待测物存在时，复合物经磁分离后，利用双荧光图像的形成，对金黄色葡萄球菌进行快速判别，获取荧光图像的光谱信号并基于内存的待测物浓度和荧光强度的关系曲线，结合标准曲线法及化学计量学方法，实现食源性致病菌的定量检测。
42.以上实施例仅用于说明本发明的设计思想和特点，其目的在于使本领域内的技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，本发明的保护范围不限于上述实施例。所以，凡依据本发明所揭示的原理、设计思路所作的等同变化或修饰，均在本发明的保护范围之内。