一种肠胃散的质量评价方法与流程

1.本发明涉及药效学评价技术领域，具体的说涉及一种肠胃散的质量评价方法。


背景技术：

2.肠胃散是广西源安堂药业有限公司开发的otc药物，由肉桂叶、吴茱萸、艾叶、砂仁、丁香、陈皮、茯苓、岗松、大叶桉叶等多味中药配伍加工制成，是用于治疗寒湿蕴结所致泄泻、腹痛肠鸣的外用贴剂，常在联合治疗方案中有显著效果。肠胃散化学成分复杂，许多成分都直接影响功能主治。肠胃散目前仅有少量关于含量测定和临床联合治疗效果观察等研究。指纹图谱技术适用于多组分复杂样品，可涵盖未定性化合物对制剂的质量进行综合评价，是确保其一致性和稳定性的有效方法。
3.目前，中药指纹图谱相似度评价系统是常用的评价方法，但该软件也存在缺陷，对于差异不大的样品和工艺稳定的制剂很难反映出显著性。中指纹图谱普遍存在数据量大，难处理的特点，聚类分析和主成分分析可对数据降维，又能保留主要信息，改善了处理过程。
4.我国疆域辽阔，具有复杂的自然地理环境，日照、温度、土质等环境不尽相同，这会造成药材的批间差异。中成药在加工过程中又会发生化学反应，更加剧了其中化学成分分析的复杂程度，增加了批内研究的难度；又由于药厂的加工工艺基本定型，每批次成药中的成分类别及其含量趋于相似，这增加了批间质量评价的难度。
5.中药以及中药制剂在世界各地的需求增长很快，因此药材质量的评估和控制尤为关键，由于中药很难完全定性所有化合物，但是这些化合物通常在治疗方面起到协同作用，找到合适的分析方法变得很有必要。指纹图谱是测定中药各种化学成分而得到的光谱或色谱图，其相应的分析技术很多，结合hplc就是常用的方法之一，它能对中药材的基因片段进行研究，是评价中药优劣、鉴别真伪、区分物种和确保一致性和稳定性的有效方法。
6.因此，提供一种简便、快速、重现性好的肠胃散的质量评价方法是本领域技术人员亟需解决的技术问题。


技术实现要素：

7.有鉴于此，本发明提供了一种肠胃散质量评价方法，用于肠胃散hplc指纹图谱的建立，对多批次肠胃散进行相似度评价和进行聚类分析，主成分分析可研究对肠胃散中的化学成分的权重，为制订产品批内、批间质量控制标准及促进更多研究提供基础。
8.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
9.一种肠胃散的质量评价方法，包括以下步骤：
10.(1)分别称取橙皮苷、肉桂酸、桂皮醛、丁香酚、吴茱萸碱和吴茱萸次碱，加甲醇溶解，制得含上述6种成分的混合溶液，将混合溶液进行过滤，即得对照品溶液；
11.(2)称取肠胃散药粉，将其溶于甲醇，超声处理之后，放冷至室温，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
12.(3)采用高效液相色谱仪分别对对照品溶液以及供试品溶液进行检测，得到对照品和供试品hplc色谱图；
13.(4)将色谱图导入中药色谱指纹相似度评价系统软件，以任一供试品色谱图为参照图谱，采用多点校正法进行色谱峰匹配，中位数法生成对照图谱，用对照品对色谱峰进行指认，确定橙皮苷、肉桂酸、桂皮醛、丁香酚、吴茱萸碱和吴茱萸次碱所属峰，将丁香酚所属峰设为参照峰，测定不同供试品共有峰的相对峰面积；
14.(5)分别采用中药色谱指纹相似度评价系统软件、整体相似度公式和改良程度相似度公式来计算供试品的hplc图谱与对照图谱的相似度，计算两个指纹图谱之间的整体相似度q用公式(1)，计算两个指纹图谱之间的改良程度相似度q
′
用公式(2)；
[0015][0016][0017]
其中，a
i
、b
j
分别为色谱图a和b中相同色谱峰的峰面积，n为色谱峰的数目；
[0018]
(6)以共有峰的相对峰面积为原始数据，运用spss软件，以组间联接法测量平方欧式距离，对不同供试品进行聚类分析；
[0019]
(7)用spss软件对各共有峰的峰面积进行标准化处理，对不同供试品指纹图谱所得的共有峰进行主成分分析，得出相关矩阵的特征性及其方差；
[0020]
(8)用spss软件，根据主成分的得分矩阵计算出主成分得分和综合得分。
[0021]
进一步，上述步骤(1)中对照品溶液中橙皮苷质量浓度为97.52μg/ml、肉桂酸质量浓度为1.14μg/ml、桂皮醛碱质量浓度为8.68μg/ml、丁香酚质量浓度为7.93μg/ml、吴茱萸碱质量浓度为10.04μg/ml、吴茱萸次碱质量浓度为4.26μg/ml。
[0022]
采用上述进一步方案的有益效果在于：通过对处方中一些君药的有效成分群进行定性分析，有助于肠胃散指纹图谱的建立，以及明确一些影响质量评价的化学成分，也增加了主成分分析法为本实验提供的信息量。
[0023]
进一步，上述步骤(2)中肠胃散药粉的质量与甲醇的体积比为1:50。
[0024]
更进一步，上述步骤(2)中超声功率为500w、超声频率为40khz、超声时间为30min。
[0025]
采用上述进一步方案的有益效果在于：通过合适的供试品溶液制备方法，可简单、快速、高效地获得留所需、去杂质的供试品溶液，有助于后续实验研究。
[0026]
进一步，上述步骤(3)高效液相色谱仪的色谱条件为：
[0027]
色谱柱：agilentxdb
‑
c18(250mm
×
4.6mm
×
5μm)；
[0028]
流动相：乙腈(a)
‑
0.2％磷酸溶液(b)；
[0029]
梯度洗脱：0～10min、22％a，10～60min、22％～45％a，60～70min、45％a；流速：1.0ml/min；
[0030]
检测波长：226nm；
[0031]
柱温：25℃；
[0032]
进样量：10μl。
[0033]
采用上述进一步方案的有益效果在于：高效液相色谱法是目前主流的化学成分分析手段，通过该法可获得认可度较高的实验结果。所摸索出的色谱条件是建立本文指纹图
谱最关键因素之一，既可检验该实验的可靠性，又为下一步分析提供图谱和数据信息。
[0034]
本发明的有益效果在于：
[0035]
本发明建立了肠胃散hplc指纹图谱，对比了其在中药指纹图谱相似度评价系统、整体相似度和改良程度相似度等不同评价方式下结果，并运用spss软件进行聚类和主成分分析，从hplc指纹图谱得到18个共有峰，用对照品确定了其中的6个化合物。聚类分析结果与整体相似度和改良程度相似度分析结果一致，能够将不同批次的肠胃散区别开，主成分分析中，上述6个化合物既是处方中君药的指标性有效成分，也是较大的权重指标，是肠胃散质量评价的关键因素。本发明方法简便、快速、重现性好，是对多批次肠胃散质量进行批内、批间分析的有效手段，具有较高的应用价值。
[0036]
本发明对比了中药指纹图谱相似度评价系统、整体相似度和改良程度相似度等不同评价方式，整体相似度和改良程度相似度均能较好地发现批间差异。聚类分析是收集相同性质相似物的数据，运用spss软件对从指纹图谱获得的相关数据进行聚类分析，可做为初步的探索性分析，能直观、简明地得到一些结论。利用这一分析方法所得结论与整体相似度和改良程度相似度分析结果一致，双向验证了它们在此的实用性。
[0037]
本发明采用的主成分分析为双线性模型方法，利用方差最大原则，对原始数据所包含的多个自变量进行线性拟合，以新的低维变量代替原始高维变量，即主成分，各主成分之间互不相关，从而这些主成分能够反映原始变量的绝大部分信息，且所含的信息互不重叠，进而实现数据的降维，该方法在中药质量控制方面具有广泛的应用。这为摸索肠胃散中共有成分的相关性提供了方法，运用spss软件对从指纹图谱获得的相关数据进行主成分分析，对方差和权重结果换算出主成分的得分，这对药材质量的评价有重要参考价值。
[0038]
结合上述研究手段及分析结果，能够使肠胃散批内和批间的质量控制方法相较之前得到了拓展和提升，跟上中药现代化的步伐，有益于产品的监管。
[0039]
相比于现有技术，本发明为肠胃散建立了基于hplc(高效液相色谱法)的指纹图谱；本发明为肠胃散以橙皮苷、肉桂酸、桂皮醛、丁香酚、吴茱萸碱和吴茱萸次碱等物质为主的质量控制方法提供参考；本发明为肠胃散建立了多种相似度评价方式和基于运用spss统计软件的聚类分析方法，双向验证了整体相似度和改良程度相似度评价方法和聚类分析结果的一致性；本发明为肠胃散建立了基于运用spss统计软件主成分分析方法，并通过主成分分析结果发现了君药中指标性有效成分与质量的相关性。
附图说明
[0040]
图1为本发明实施例中肠胃散hplc对照指纹图谱；
[0041]
图2为本发明实施例中混合对照品hplc色谱图；
[0042]
图中，1
‑
橙皮苷；7
‑
肉桂酸；9
‑
桂皮醛；11
‑
丁香酚；14
‑
吴茱萸碱；16
‑
吴茱萸次碱；
[0043]
图3为本发明实施例中10个批次样品的hplc指纹图谱；
[0044]
图4为本发明实施例中10个批次样品聚类结果示意图。
具体实施方式
[0045]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于
本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0046]
仪器与试药
[0047]
waterse2695系列四元梯度泵高效液相色谱仪(美国沃特世公司)；xs205电子天平(瑞士梅特勒
‑
托利多公司)；ks
‑
500de型超声波清洗器(昆山洁力美超声仪器有限公司)
[0048]
橙皮苷(批号：110721
‑
201818)、肉桂酸(批号：110786
‑
201604)、桂皮醛(批号：110710
‑
201720)、对照品均购自中国食品药品检定研究院；丁香酚(批号：must
‑
16040204)吴茱萸碱(批号：must
‑
16040313)、吴茱萸次碱(批号：must
‑
16040314)，对照品均购自成都曼思特生物科技有限公司，纯度依次为96.2％、98.8％、98.7％、99.00％、99.99％、99.97％。
[0049]
10个批次肠胃散编号为s1～s10，批号依次为201812051、201812052、201812061、201812062、201812063、201812071、201812072、201812073、201812081、201812082，由广西源安堂药业有限公司提供。
[0050]
乙腈为色谱纯；其他试剂均为分析纯；水为纯净水。
[0051]
实施例
[0052]
一种肠胃散的质量评价方法：
[0053]
(1)分别称取橙皮苷、肉桂酸、桂皮醛、丁香酚、吴茱萸碱和吴茱萸次碱，加甲醇溶解，制得含上述6种成分的混合溶液，将混合溶液进行过滤，即得对照品溶液，对照品溶液中橙皮苷质量浓度为97.52μg/ml、肉桂酸质量浓度为1.14μg/ml、桂皮醛碱质量浓度为8.68μg/ml、丁香酚质量浓度为7.93μg/ml、吴茱萸碱质量浓度为10.04μg/ml、吴茱萸次碱质量浓度为4.26μg/ml；
[0054]
(2)称取0.5g肠胃散药粉并将其溶于25ml甲醇，500w、40khz下超声处理30min之后，放冷至室温，摇匀，滤过，取续滤液，即得10个批次的供试品溶液；
[0055]
(3)采用高效液相色谱仪分别对对照品溶液以及10个批次的供试品溶液进行检测，得到对照品和供试品hplc色谱图；
[0056]
高效液相色谱仪的色谱条件为：
[0057]
色谱柱：agilentxdb
‑
c18(250mm
×
4.6mm
×
5μm)；
[0058]
流动相：乙腈(a)
‑
0.2％磷酸溶液(b)；
[0059]
梯度洗脱：0～10min、22％a，10～60min、22％～45％a，60～70min、45％a；流速：1.0ml/min；
[0060]
检测波长：226nm；
[0061]
柱温：25℃；
[0062]
进样量：10μl。
[0063]
(4)将色谱图导入中药色谱指纹相似度评价系统软件，以s1号色谱图为参照图谱，采用多点校正法进行色谱峰匹配，中位数法生成对照图谱r，见图1，确定18个共有峰，用对照品对色谱峰进行指认，其中1、7、9、11、14、16号峰分别为橙皮苷、肉桂酸、桂皮醛、丁香酚、吴茱萸碱和吴茱萸次碱，混合对照品hplc色谱图见图2，10批样品hplc叠加指纹图谱见图3。其中11号峰峰面积较大，且分离度和对称因子均符合要求，故设为参照峰(s)，测定10批样品共有峰的相对峰面积，结果见表1。
[0064]
表1 共有峰的相对峰面积
[0065]
峰号s1s2s3s4s5s6s7s8s9s1011.0991.1730.9911.0171.2350.9341.0151.0301.1060.92120.0550.0670.0730.0790.0670.0810.0930.0570.0640.05030.0180.0230.0230.0230.0270.0230.0280.0160.0180.01440.0310.0350.0320.0310.0390.0330.0340.0300.0330.02750.1070.1120.1080.1010.0940.1040.1140.1080.1150.10560.0320.0350.0330.0310.0380.0300.0370.0380.0400.03270.0280.0310.0320.0300.0520.0320.0330.0270.0280.02380.0200.0190.0200.0200.0320.0200.0210.0180.0180.01690.3630.3510.3850.3690.3880.3680.4130.3700.3950.384100.2340.2470.2430.2340.2350.2570.2850.2910.2840.276111.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0001.000120.0440.0510.0460.0480.0550.0480.0520.0420.0450.026130.1990.2120.1840.1840.2360.1850.2020.1870.1960.168140.2120.2640.2320.2300.2450.2470.2500.2000.2560.217150.1310.1370.1210.1210.1550.1200.1340.1240.1290.109160.1250.1620.1470.1440.1560.1430.1570.1250.1580.130170.0660.0260.0220.0220.0290.0220.0260.0240.0250.021180.0510.0570.0510.0460.0590.0500.0500.0470.0460.026
[0066]
(5)分别采用中药色谱指纹相似度评价系统软件、整体相似度公式和改良程度相似度公式来计不同的供试品的hplc图谱与对照图谱的相似度；
[0067]
其中，整体相似度可以定量的反映样品相对差异的大小，则指纹图谱a和b的相似度q用公式(1)计算；当峰面积的差异不超过100％时，改良程度相似度可以精确反映样品与参照的相对差异，则指纹图谱a和b的相似度q
′
用公式(2)计算；
[0068][0069][0070]
a
i
，b
j
为色谱图a和b中相同色谱峰的峰面积，n为色谱峰的数目；
[0071]
不同相似度计算方法下10批样品hplc指纹图谱与对照图谱的结果见表2，结果显示，中药色谱指纹相似度评价系统的相似度结果均大于0.996，说明肠胃散各批次间化学成分基本一致，但反映不出10批样品与参照之间的差异。采用整体相似度和改良程度相似度公式计算10批样品的相似度结果都在0.88～0.96之间，其中8批超过0.91，3、4、6、7、9批次与参照相似度较高，而5、10批次与参照差异最大。各批次的整体相似度和改良程度相似度结果基本一致，说明这两种评价方法对肠胃散均适用。
[0072]
表2 10批样品hplc指纹图谱与对照图谱的相似度
[0073][0074]
(6)以共有峰的相对峰面积为原始数据，运用spss软件，以组间联接法测量平方欧式距离，对10个批次供试品进行聚类分析；结果如图4。10批样品可聚类为三类：s3、s4、s6、s7、s9为一类；s8、s10为一类；s1、s2、s5为一类。分类结果与整体相似度和改良程度程度相似度结果一致。
[0075]
(7)用spss软件对各共有峰的峰面积进行标准化处理，对不同供试品指纹图谱所得的共有峰进行主成分分析，得出相关矩阵的特征性及其方差；部分结果见表3。结果前4个成分特征值λ大于1，它们的累积方差贡献率达到90.662％，故取前4个为主成分。由表4主要因子载荷矩阵可知，主成分1主要反映了橙皮苷、桂皮醛、丁香酚、吴茱萸碱、吴茱萸次碱及5、6、10号峰的信息，主成分2主要反映了肉桂酸及2、3、4、12号峰的信息，主成分3主要反映了8、13、15、17号峰的信息，主成分4主要反映了18号峰的信息。
[0076]
表3 主成分特征值及贡献率
[0077][0078][0079]
表4 主成分载荷矩阵
[0080][0081]
(8)用spss软件，根据主成分的得分矩阵计算出主成分得分和综合得分，得分的高低对应不同批次肠胃散的整体质量，并按分数进行排名，结果见表5。10批肠胃散质量由高到低依次为s8、s9、s6、s3、s7、s10、s4、s5、s1、s2。
[0082]
表5 10批样品主成分得分、综合得分及排名
[0083][0084][0085]
国家药典委员会推荐的中药色谱指纹相似度评价系统是一款常用的分析软件，采用夹角余弦作为相似度评价指标。本发明中使用该法计算的相似度在0.996～1.000之间，说明各色谱峰在比例上相似度较高，但没有检测到峰面积的线性波动，由于工艺的原因，每批制剂成分的种类和含量基本稳定，所以该法对制剂的评价会存在缺陷，它更适合药材的品种鉴别。于是引入整体相似度和改良程度相似度进行对比评价，整体相似度结果在0.886～0.955之间，改良程度相似度结果在0.878～0.951之间，和聚类结果一致，说明两个方法均适用于肠胃散指纹图谱相似度的评价。
[0086]
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。