超声辅助浊点萃取土茯苓有效成分的方法与流程

1.本发明属于生物医药领域，具体涉及超声辅助浊点萃取土茯苓有效成分的方法。


背景技术：

2.浊点萃取法(cloudpoint extraction,cpe)是一种利用表面活性剂溶液的增溶作用和浊点现象实现溶质的分离和富集的新型的绿色的液—液萃取技术。与传统的溶剂萃取过程相比，浊点萃取法提取过程不需要有机溶剂，对环境的影响较小，同时可以较好地保护被萃取物的原有性质，也能够提高萃取物质的富集率和萃取率。
3.土茯苓为百合科植物光叶菝葜的干燥根茎，其为多年生常绿攀缘状灌木，多生于山坡或林下，入药部分只选择其干燥后的根茎。味甘、淡，性平，有解毒，除湿，通利关节之功效，主要用于梅毒及汞中毒所致的肢体拘挛，筋骨疼痛；湿热淋浊，带下，痈肿，瘰疬，疥癣。
4.二氢黄酮醇类是土茯苓中的主要成分，现有技术中该类物质的提取多采用有机溶剂萃取的方式得到，如袁久志等公开了一种土茯苓中二氢黄酮醇类的提取方法，土茯苓干燥根茎6kg用80％乙醇回流提取2次，减压回收溶剂。将提取物溶于适量水中，依次用石油醚、醋酸乙酯和正丁醇萃取，得到石油醚萃取物(13.8g)，醋酸乙酯萃取物(15.1g)和正丁醇萃取物(36.g)。正丁醇萃取物上diaionhp
‑
20大孔树脂柱，分别用水，40％甲醇和甲醇洗脱。甲醇洗脱部分(12.5g)经硅胶柱色谱(氯仿一甲醇一水)和ods柱色谱(甲醇一水)，最后经制备hplc反复纯化得到化合物(土茯苓二氢黄酮醇类成分研究,袁久志，窦德强，中国中药杂志,第29卷第9期,2004)。


技术实现要素：

5.本发明依托上述研究进行，提供了一种新的土茯苓有效成分的提取方法，将浊点萃取法应用于中药活性成分的萃取和浓缩，建立了中药土茯苓中多种活性成分的浊点萃取
‑
高效液相色谱检测方法。
6.本发明提供的超声辅助浊点萃取土茯苓有效成分的方法，包括如下步骤：
7.a、浊点萃取
8.土茯苓粉末过筛后，按固液比1:15～30加入质量浓度为30～50g
·
l
‑1的浊点萃取剂genapol x
‑
080水溶液，搅拌混匀后，置于超声仪器中萃取，12000rpm离心后，取上清液为萃取液；
9.b、富集
10.向所述萃取液中加入碱金属无机盐粉末，形成盐离子浓度为0.7～1.1mol
·
l
‑1，涡旋混匀后于水浴锅中恒温50～60℃加热30～50min，12000rpm离心后，弃去上层水相，下层的表面活性剂相加醇溶剂稀释后过0.4～0.5μm滤膜后，得到土茯苓二氢黄酮醇类提取物。
11.通过该方法提取得到的二氢黄酮醇类提取物至少包括新落新妇苷、落新妇苷、新异落新妇苷、异落新妇苷、黄杞苷五种组分。
12.通过实验验证，采用上述提取方法，5种有效成分在各自质量浓度范围内与峰面积
线性关系良好，精密度高、重复性及稳定性良好。
13.同时，通过单因素试验结合响应面优化法筛选出浊点萃取法提取土茯苓中5种有效成分的最佳提取工艺，为土茯苓药材的提取工艺的研究与开发，提供进一步的提供理论依据。
14.两道工序的最优提取条件如下：
15.步骤a中，土茯苓粉末过60目筛后，进行浊点萃取。
16.genapol x
‑
080水溶液与土茯苓粉末的固液比为1:16～20，genapol x
‑
080水溶液的质量浓度为37.5～40g
·
l
‑1；搅拌混匀后，置于超声仪器中萃取30min，12000rpm离心10min后，取上清液为萃取液。
17.步骤b中，碱金属无机盐粉末为nacl粉末，盐离子浓度为0.7～0.9mol
·
l
‑1。涡旋混匀后于水浴锅中恒温60℃加热40～45min，12000rpm离心10min后，弃去上层水相。
18.醇溶剂为甲醇，表面活性剂相与甲醇溶液的体积比为1:20，滤膜孔径为0.45μm。
19.发明的作用与效果
20.与现有提取方法对比，本发明提取方法仅用到genapol x
‑
080水溶液、碱金属无机盐粉末、醇溶剂三种溶剂，不仅对环境的影响较小，同时可以较好地保护被萃取物的原有性质，也能够提高萃取物质的富集率和萃取率。
21.通过实验验证，本发明提取方法线性关系、精密度、重复性以及稳定性均良好。所建立的回归模型可适用于土茯苓中多种有效成分的总含量的预测，其与实际测定的数值拟合度较好，优化得到的提取工艺参数稳定可行、准确可靠。
附图说明
22.图1为对照品及样品的hplc色谱图，其中，(a)混合对照品、(b)triton x
‑
100浊点萃取样品、(c)triton x
‑
114浊点萃取样品和(d)genapol x
‑
080浊点萃取样品；色谱图中，1.新落新妇苷2.落新妇苷3.新异落新妇苷4.异落新妇苷5.黄杞苷。
23.图2为表面活性剂的质量浓度对5种有效成分及其总含量的影响。
24.图3为固液比对5种有效成分及其总含量的影响。
25.图4为盐离子浓度对5种有效成分及其总含量的影响。
26.图5为平衡时间对5种有效成分及其总含量的影响。
27.图6为表面活性剂质量浓度和固液比交互作用对土茯苓中5种成分总含量影响的响应面图和等高线图。
28.图7为表面活性剂质量浓度和盐离子浓度交互作用对土茯苓中5种成分总含量影响的响应面图和等高线图。
29.图8为表面活性剂质量浓度和平衡时间交互作用对土茯苓中5种成分总含量影响的响应面图和等高线图。
30.图9为固液比和盐离子浓度交互作用对土茯苓中5种成分总含量影响的响应面图和等高线图。
31.图10为固液比和平衡时间交互作用对土茯苓中5种成分总含量影响的响应面图和等高线图。
32.图11为盐离子浓度和平衡时间交互作用对土茯苓中5种成分总含量影响的响应面
图和等高线图。
33.图12为残差的正态概率图(a)和残差与预测响应的关系图(b)。
具体实施方式
34.下面结合实施例和附图对本发明进行详细描述。但下列实施例不应看作对本发明范围的限制。
35.实施例1：高效液相色谱方法的建立
36.1.1色谱条件
37.色谱柱：上海月旭(welch)液相色谱柱ultimate c18(4.6mm
×
250mm,5μm)，流动相：甲醇(a)
‑
0.1％乙酸水溶液(b)，梯度洗脱(0～20min，35％a；20～35min,35％a～40％a；35～50min,40％a～45％a)，流速1.0ml
·
min
‑1，柱温30℃，进样量10μl，检测波长按药典选择291nm。5个成分的色谱峰分离度＞1.5，且峰形对称，理论塔板数以落新妇苷峰计算不低于5000。色谱图结果如图1显示，在此色谱条件下待测组分与其他组分的分离效果良好。
38.1.2供试品溶液的制备
39.平行精密称取土茯苓粉末(过60目筛)三份，每份2g分别置于50ml烧杯中，分别加入20ml质量浓度为40g
·
l
‑1的triton x
‑
100水溶液，20ml质量浓度为40g
·
l
‑1的triton x
‑
114水溶液和20ml质量浓度为40g
·
l
‑1的genapol x
‑
080水溶液，搅拌混匀后，超声提取30min。12000rpm离心10min，弃去沉淀，取上清液，即为萃取液。
40.富集过程的方法为：按上述萃取液的体积加入nacl粉末，形成浓度为0.5mol
·
l
‑1，triton x
‑
114组于水浴锅中恒温40℃加热20min；triton x
‑
100组于水浴锅中恒温80℃加热20min；genapol x
‑
080组于水浴锅中恒温60℃加热20min，12000rpm离心10min，弃去上层水相，取下层的表面活性剂相100μl加2ml甲醇稀释后过0.45μm滤膜后，准备检测，结果见图1。
41.1.3对照品溶液的制备
42.分别精密称取落新妇苷、新落新妇苷、异落新妇苷、新异落新妇苷、黄杞苷对照品适量，加入甲醇溶解，摇匀，制成每1ml含落新妇苷2.139mg，新落新妇苷1.047mg，异落新妇苷0.840mg，新异落新妇苷1.040mg，黄杞苷1.775mg的混合对照品储备液，冰箱4℃保存，备用。
43.实施例2：方法学考察
44.2.1线性关系
45.精密吸取“1.3”项下的混合对照品溶液不同体积，加50％甲醇稀释至刻度，配制6个不同浓度溶液，另取“1.3”项下的混合对照品溶液，共计7个不同浓度的对照品溶液。按“1.1”项下色谱条件进样测定。以对照品质量浓度x为横坐标，峰面积y为纵坐标，进行线性回归，结果见表1。5种有效成分在各自质量浓度范围内与峰面积线性关系良好。
46.表1 5种有效成分的线性关系
47.[0048][0049]
2.2精密度试验
[0050]
精密吸取“1.3”项下混合对照品溶液，按“1.1”项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积。结果表明新落新妇苷、落新妇苷、新异落新妇苷、异落新妇苷和黄杞苷峰面积的rsd值分别为0.29％，0.26％，0.28％，0.21％，0.32％(n＝6)，表明仪器精密度良好。结果见表2。
[0051]
表2精密度试验结果(n＝6)
[0052]
[0053][0054]
2.3重复性试验
[0055]
精密称取同一批次土茯苓粉末，共6份，每份1g，按“1.2”项下方法制备供试品溶液，再按“1.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，计算每份样品中各组分含量。新落新妇苷、落新妇苷、异落新妇苷、新异落新妇苷和黄杞苷的平均含量分别为6.07mg
·
g
‑1、33.86mg
·
g
‑1、2.54mg
·
g
‑1、9.12mg
·
g
‑1、8.94mg
·
g
‑1，rsd值分别为0.36％、0.07％、0.83％、0.48％、0.25％(n＝6)。表明本方法重复性良好。结果见表3。
[0056]
表3重复性试验结果(n＝6)
[0057]
[0058][0059]
2.4稳定性试验
[0060]
精密称取同一批次土茯苓粉末，共6份，每份1g，按“1.2”方法制备供试品溶液，分别于室温下放置0、2、4、8、12、24h，按“1.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果表明新落新妇苷、落新妇苷、新异落新妇苷、异落新妇苷和黄杞苷峰面积的rsd值分别为0.34％，0.04％，0.60％，0.17％，0.19％(n＝6)，表明供试品溶液于室温下放置24h内稳定性良好。结果见表4。
[0061]
表4稳定性实验结果(n＝6)
[0062]
[0063][0064]
2.5加样回收率试验
[0065]
精密称取同一批土茯苓样品6份，每份约0.5g，加入一定量的对照品溶液，按“1.2”项中的方法制备供试品溶液，稀释后进样并测定峰面积，计算平均回收率及rsd值，见表5。
结果表明方法的准确度良好。
[0066]
表5加样回收率实验结果(n＝6)
[0067]
[0068][0069]
2.6浊点萃取剂的确定
[0070]
在浊点萃取方法对中药有效成分的萃取研究中，常用的表面活性剂有triton x
‑
100、triton x
‑
114和genapol x
‑
080等，但triton x
‑
100和triton x
‑
114这些表面活性剂结构中均含有苯环，在紫外吸收区有吸收，可能会影响样品的检测。而genapol x
‑
080疏水基为十三烷基，在紫外区无吸收。同时triton x
‑
114浊点温度为25℃，在萃取过程中会产生分层现象，从而影响提取效率；triton x
‑
100浊点温度为65℃，平衡温度需要达到80℃，长时间高温加热不仅会对提取效率产生影响，还会破坏土茯苓中相关的活性成分；genapol x
‑
080出现浊点的温度较低，为45℃，平衡温度选取60℃即可，分层温度比较容易实现，且在相关温度下土茯苓中活性成分较为稳定。经过对不同种类的表面活性剂triton x
‑
100,triton x
‑
114和genapol x
‑
080进行筛选。发现选用genapol x
‑
080作为浊点萃取剂，土茯苓5种二氢黄酮醇类化合物含量最高，色谱图见图1。各成分含量结果见表6。因此选择genapol x
‑
080作为本实验的浊点萃取剂。
[0071]
表6三种表面活性剂浊点萃取土茯苓中5种有效成分的结果
[0072][0073][0074]
实施例3：浊点萃取法单因素试验
[0075]
选取表面活性剂genapol x
‑
080质量分数、固液比、盐离子浓度和平衡时间作为影响土茯苓中5种二氢黄酮醇类物质超声提取率的四个因素，并进行单因素试验以及响应面优化实验筛选最佳的提取工艺。
[0076]
3.1表面活性剂的质量浓度的选择
[0077]
精密称取土茯苓粉末2g(过60目筛)，加入20ml一定质量浓度的genapol x
‑
080水溶液，搅拌混匀后，置于超声仪器中萃取30min。改变genapol x
‑
080水溶液的质量浓度，分别为30g
·
l
‑1、40g
·
l
‑1、50g
·
l
‑1、60g
·
l
‑1、70g
·
l
‑1。12000rpm离心10min，弃去沉淀，取上清液。向上清液中加入0.5mol
·
l
‑1的nacl，涡旋混匀后于水浴锅中恒温60℃加热20min，再于离心机中12000rpm离心10min，弃去上层水相，取下层的表面活性剂相加2ml甲醇稀释后过0.45μm滤膜后，备用。每个单因素试验组平行三次，结果见图2。由图2
‑
2可知，当表面活性剂质量浓度为40～60g
·
l
‑1时，落新妇苷的含量随表面活性剂的质量浓度增加而增大，但三组数据无显著性差异。当表面活性剂质量浓度为50g
·
l
‑1时，黄杞苷的含量最大，但综合5种有效成分及其总提取含量的值，应当选取表面活性剂质量浓度为40g
·
l
‑1。
[0078]
3.2固液比的选择
[0079]
精密称取土茯苓粉末2g(过60目筛)，加入一定量的质量浓度为40g
·
l
‑1的genapol x
‑
080水溶液，搅拌混匀后，超声提取30min，改变固液比为1:10、1:20、1:30、1:40、1:50。12000rpm离心10min，弃去沉淀，取上清液。向上清液中加入0.5mol
·
l
‑1的nacl，涡旋混匀后于水浴锅中恒温60℃加热20min，再于离心机中12000rpm离心10min，弃去上层水相，下层的表面活性剂相加2ml甲醇稀释后过0.45μm滤膜后，备用。每个单因素试验组平行三次，结果见图3。如图3所示，当固液比为1:20时，5种有效成分及其总提取含量的值均最大。
[0080]
3.3盐离子浓度的选择
[0081]
精密称取土茯苓粉末2g(过60目筛)，加入40ml质量浓度为40g
·
l
‑1的genapol x
‑
080水溶液，搅拌混匀后，超声提取30min，12000rpm离心10min，弃去沉淀，取上清液。向上清液中加入不同浓度的nacl，分别为0.5mol
·
l
‑1、0.7mol
·
l
‑1、0.9mol
·
l
‑1、1.1mol
·
l
‑1、1.3mol
·
l
‑1涡旋混匀后于水浴锅中恒温60℃加热20min，再于离心机中12000rpm离心10min，弃去上层水相，下层的表面活性剂相加2ml甲醇稀释后过0.45μm滤膜后，备用。每个单因素试验组平行三次，结果见图4。由图可知，当盐离子浓度在0.5～0.9mol
·
l
‑1时，5种有效成分及其总提取含量随加入盐离子的浓度的增加而增大，在0.9～1.3mol
·
l
‑1范围内，随着盐离子浓度的增大，5种有效成分及其总提取含量逐渐减少，但是经计算盐离子浓度为0.7mol
·
l
‑1和0.9mol
·
l
‑1时，测得的含量无显著性差异，因此，从节约成本的角度选择盐离子浓度为0.7mol
·
l
‑1为最佳条件。
[0082]
3.4平衡时间的选择
[0083]
精密称取土茯苓粉末2g(过60目筛)，加入40ml质量浓度为40g
·
l
‑1的genapol x
‑
080水溶液，搅拌混匀后，超声提取30min，12000rpm离心10min，弃去沉淀，取上清液。向上清液中加入0.7mol
·
l
‑1的nacl，涡旋混匀后于水浴锅中恒温60℃加热一定时间，改变平衡时间分别为10min、20min、30min、40min、50min，再于离心机中12000rpm离心10min，弃去上层水相，下层的表面活性剂相加2ml甲醇稀释后过0.45μm滤膜后，备用。每个单因素试验组平行三次，结果见图5。由图5所示，平衡时间在10～40min内，5种有效成分的含量及其总含量随着平衡时间的增加而增大；当平衡时间为40min时达到最大值，在40～50min内，随时间的增加含量逐渐减小。因此选择平衡时间为40min作为最佳条件。
[0084]
实施例4：box
‑
behnken响应面试验设计
[0085]
4.1因素与水平选定
[0086]
选择表面活性剂质量浓度(a)、固液比(b)、盐离子浓度(c)、平衡时间(d)等变量作
为考察因素，根据单因素试验结果得到因素的最佳范围，因素水平见表7。
[0087]
表7因素与水平
[0088][0089][0090]
4.2 box
‑
behnken响应面法试验设计与结果
[0091]
根据单因素实验结果，采用design
‑
expert 8.0.6软件，选择box
‑
behnken设计原理以表面活性剂质量浓度(a)、固液比(b)、盐离子浓度(c)、平衡时间(d)四个因素为自变量，设置5个中心试验点，以5种成分的总含量为响应值，设计出29个试验点的试验方案，每组实验平行3次，试验方案和5种有效成分的含量以及其总含量结果见表8。
[0092]
表8 box
‑
behnken中心组合实验设计及结果
[0093]
[0094][0095]
注：共有29个实验，其中24个为析因实验，5个为中心实验以估计误差。
[0096]
4.3建立模型回归方程与显著性检验
[0097]
由于各因素对土茯苓中5种有效成分的总含量的影响不是简单的线性关系，为了更明确各因素对其的影响，利用design
‑
expert 8.0.6软件对表2
‑
8的结果进行多元线性回归拟合，得到土茯苓中5种有效成分的总含量(y)对表面活性剂质量浓度(a)、固液比(b)、盐离子浓度(c)、平衡时间(d)的二次多项回归方程：y＝36.07
‑
0.1562a
‑
0.1880b
‑
0.4032c
‑
0.3991d
‑
0.2358ab+0.0635ac+0.0955ad
‑
0.2967bc+0.1354bd+0.2819cd
‑
1.67a2‑
2.16b2‑
1.79c2‑
1.02d2[0098]
式中：a、b、c、d为一次项系数；ab、ac、ad、bc、bd、cd为交互项系数；a2、b2、c2、d2为二次项系数。为考察上述回归方程的有效性及各因素对5种成分总含量的影响程度，对上述回归模型进行方差分析，结果见表9。
[0099]
表9响应面分析结果
[0100][0101]
注：p＜0.05为显著，标注为*；p＜0.01为极显著，标注为**。
[0102]
由表可以看出模型p＜0.0001，说明选用的模型极显著，可知模型所得方程与实际数据非常拟合，可用该模型设计试验优化用表面活性剂genapol x
‑
080浊点萃取土茯苓中5种二氢黄酮醇类物质的提取工艺。而失拟项p＝0.1941＞0.05，差异不显著，说明该试验误差小，模型残差由随机误差产生。模型的相关系数r2＝0.9423，表明试验值与预测值之间密切相关，该模型可解释四个因素94.23％的变异性，即实验所选的变量可影响土茯苓中5种有效成分总含量中94.23％的变化量。一次项表面活性剂质量浓度(a)、固液比(b)的p＞
0.05，差异不显著，表明表面活性剂质量浓度和固液比对土茯苓中5种有效成分总含量的影响均不显著；盐离子浓度(c)的p＝0.0012；平衡时间(d)的p＝0.0013，p＜0.01，差异性极显著，盐离子浓度与平衡时间对土茯苓中5种有效成分的总含量影响极为显著。各因素间的交互作用p＞0.05，差异也均不显著。二次项a2、b2、c2、d2的p值均小于0.0001，差异极显著，表明各因素的二次项对土茯苓中5种有效成分的总含量影响都极为显著。由此可以说明各实验因素对响应值的影响不是简单的线性关系。再根据f值分布和p值，可知一次项对表面活性剂genapol x
‑
080浊点萃取土茯苓中5种有效成分总含量的影响强弱顺序为：盐离子浓度(c)＞平衡时间(d)＞固液比(b)＞表面活性剂质量浓度(a)。
[0103]
4.4响应面的分析和优化
[0104]
为了进一步研究选择的相关变量之间的交互作用，利用design
‑
expert 8.0.6软件模拟了四个影响因素对总响应因子交互影响的3d响应曲面图和等高线图，见图6、7、8、9、10和11，选取其中的两个因素固定在零水平，考察另外两个因素之间的交互作用。从响应面曲面图和对应的等高线的形状可以直观反映出两自变量交互作用的显著程度，响应曲面图的曲面越陡峭，说明因素对土茯苓中5种有效成分的总含量影响越显著；对应等高线为圆形时表明选取的两因素交互作用不显著，为椭圆形时表明两因素交互作用显著。
[0105]
由图6可知，响应面曲线变化相对陡峭，等高线近似椭圆形，表明表面活性剂质量浓度(a)和固液比(b)的交互作用较明显，对土茯苓中5种有效成分的总含量影响较为显著。由图7可知，响应曲面变化较平缓，等高线近似圆形，说明表面活性剂质量浓度(a)和盐离子浓度(c)的交互作用不明显且对土茯苓中5种有效成分的总含量影响不显著。由图8可知，表面活性剂质量浓度(a)和平衡时间(d)对土茯苓中5种有效成分的总含量影响显著，等高线稀疏且呈椭圆形，并且弧度较大，说明两因素的交互作用明显。由图9可知，固液比(b)和盐离子浓度(c)的交互作用明显，响应面曲线变化陡峭，等高线呈椭圆形，说明两因素对土茯苓中5种有效成分的总含量影响也较为显著。由图10可知，固液比(b)和平衡时间(d)的交互作用也十分明显，响应面曲线变化陡峭，等高线稀疏呈椭圆形，并且弧度较大，说明两因素对土茯苓中5种有效成分的总含量影响也较为显著。由图11可知，盐离子浓度(c)和平衡时间(d)对土茯苓中5种有效成分的总含量影响也较为显著，响应面曲线变化陡峭，等高线稀疏呈椭圆形，并且弧度较大，说明两因素的交互作用也比较明显。
[0106]
4.5预测模型验证
[0107]
为确保拟合模型能够为实际系统提供足够的近似值，通常需要检查拟合模型
[38]
。通过构建残差的正态概率图，见图12，检查正态性假设，如图12(a)所示，由于残差曲线近似直线且沿直线分布，因此较为满足正态性假设。图12(b)给出残差与方程预测值的对应关系图，残差显示是随机的呈散射状，表明原始观察的方差对于所有值都是恒定的。图12所得到的结果较符合模型，因此可以得出结论，预测模型足以描述响应面的提取得率。
[0108]
4.6最佳提取工艺的确定
[0109]
同时，利用design
‑
expert 8.0.6软对回归模型进行进一步的典型性分析，得到最优提取工艺条件为：表面活性剂质量浓度为37.466g
·
l
‑1，固液比为1:16.273，盐离子浓度0.633mol
·
l
‑1，平衡时间为42.819min。因实验室实际条件限制，最终选用genapol x
‑
080型表面活性剂质量浓度为37.5g
·
l
‑1，土茯苓药材粉末与表面活性剂水溶液的固液比为1:16，搅拌混匀后，置于超声仪器中萃取30min，12000rpm离心10min，弃去沉淀，取上清液。向上清
液中加入0.6mol
·
l
‑1的nacl，涡旋混匀后于水浴锅中恒温60℃加热43min，再于离心机中12000rpm离心10min，弃去上层水相，得到下层的表面活性剂相。土茯苓中5种有效成分的总含量理论值为33.17mg
·
g
‑1。
[0110]
4.7验证试验
[0111]
按照上述条件进行3次平行试验进行验证，试验结果见表10，测得的总含量实际均值为32.73mg
·
g
‑1，与预测值之间的相对偏差均值为1.32％。结果证明，本试验所建立的回归模型可适用于土茯苓中多种有效成分的总含量的预测，其与实际测定的数值拟合度较好，优化得到的提取工艺参数稳定可行、准确可靠。
[0112]
表10验证试验结果(n＝3)
[0113][0114]
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。