一种DNA生物传感器及其制备方法

一种dna生物传感器及其制备方法
技术领域
1.本发明属于生物传感器技术领域，具体涉及一种dna生物传感器及其制备方法。


背景技术：

2.dna作为重要的生物标志物，广泛应用于各类疾病的早期检测。石英晶体微天平是一种利用石英晶体对质量变化敏感的新型生物传感器，当晶体表面质量变化时，所吸附物质的量可以通过频率的变化加以监测，其测量精度可以达到纳克级别。由于石英晶体微天平测定的是质量变化，无需进行标记，可以简化分析操作程序，提高分析速度，因此，具有响应快、灵敏度高、特异性好、小型简便等特点，在生物医学传感技术领域吸引了业界的关注。
3.二硫化钼纳米片作为过渡金属硫族化合物之一，具有较大的比表面积，因此，其表面会产生相对较大的静电吸引力，同时又由于钼原子和硫原子电子云分布一个倾向于在中间，一个倾向于在两端，就造成了二硫化钼纳米片层表面带上了一定的负电荷，对于单链核酸而言，由于其碱基暴露在外而易于被二硫化钼纳米片层所吸附，而对于双链核酸，由于其带负电的磷酸骨架，因为双螺旋结构而暴露在外，会对表面带负电的二硫化钼纳米片层产生较大的排斥，远远大于吸附的静电引力，所以不能被吸附。利用二硫化钼纳米片对单链核酸及双链核酸吸附作用不同这一性质，可构建基于二硫化钼纳米片检测核酸的传感方法。
4.目前，基于二硫化钼纳米片的传感方法中，多为基于荧光共振能量原理的检测手段，该方法需要在dna的一端修饰荧光基团，成本高且操作繁琐。因此，开发基于二硫化钼纳米片与石英晶体微天平的新型生物传感方法可以减少成本和操作程序，具有重大意义。


技术实现要素：

5.针对现有荧光传感器检测核酸的操作繁琐、成本高等问题，本发明提供了一种基于二硫化钼纳米片与石英晶体微天平制备新型生物传感器的方法。其主要原理是：当目标dna不存在时，单链探针dna吸附在二硫化钼纳米片表面，使二硫化钼纳米片保持分散悬浮的状态；当目标dna存在时，被吸附在二硫化钼纳米片表面的单链探针dna便会与其互补的目标dna结合，形成双链dna，并脱离二硫化钼纳米片表面，此时二硫化钼纳米片之间的互斥力减小，二硫化钼纳米片便会发生沉淀聚集的现象，晶体表面的质量增大，输出频率随之减小。
6.为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
7.一种dna生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
8.(1)采用剪切剥离法得到二硫化钼纳米片分散液；
9.(2)用piranha溶液(中文名：食人鱼溶液)清洗金电极至镜面，去离子水冲洗干净，并用惰性气体吹干，随后将金电极和石英晶体微天平的静态池组件组装在一起；
10.(3)向步骤(2)的静态池中先加入二硫化钼分散液，再加入单链探针dna，混合均匀，室温孵育；
11.(4)向步骤(3)得到的混悬液中加入可溶性金属盐，混合均匀，得到第一状态的免
标记生物传感器；
12.(5)向步骤(4)得到的混悬液中加入单链目标dna，室温下反应，得到第二状态的免标记生物传感器。
13.由于二硫化钼纳米片表面带一定程度的负电荷，在二硫化钼纳米片的分散液中，片和片之间有一定的排斥作用，当加入金属阳离子时，由于电荷中和作用，金属阳离子会部分的游离在片与片之间，这样会削弱片与片之间的排斥作用而使得二硫化钼纳米片之间的静电吸附起了主导作用，使得片与片的堆叠和沉积变得相对较容易；当有单链dna存在时，由于单链dna吸附在二硫化钼纳米片的表面，可以保护二硫化钼纳米片在高盐浓度下也不会堆叠和沉积；当有与单链探针dna互补的目标单链dna存在时，两者互补配对，形成双链核酸，由于双链核酸具有刚性结构，与二硫化钼纳米片之间的吸附力很弱，在高盐浓度的环境下，二硫化钼纳米片会发生堆叠和沉积。本发明利用这种性质，构建了由单链探针dna、目标单链dna和金属阳离子调节二硫化钼纳米片沉降程度的免标记生物传感器，实现对目标单链dna浓度的检测。
14.优选的，步骤(1)中，二硫化钼纳米片分散液可采用剪切剥离法制备二硫化钼纳米片分散液；具体方法如下：
15.(1
‑
1)将2g胆酸钠粉末和10g二硫化钼粉末加入200ml去离子水中，在10000～15000rpm的转速下间歇搅拌80～90min；
16.(1
‑
2)搅拌完成后，在1500rpm的转速下离心90min，并取上清液；
17.(1
‑
3)将步骤(1
‑
2)中的上清液在10000～15000rpm的转速下离心20min，取沉淀，向沉淀中加入去离子水使沉淀溶解；
18.(1
‑
4)将步骤(1
‑
3)重复共三次，取沉淀，向沉淀中加入去离子水并超声5min，得到均匀分散的二硫化钼纳米片分散液。
19.优选的，步骤(2)中，向金电极表面滴加新鲜配置的piranha溶液(浓硫酸与质量百分数为30％双氧水按照体积比3:1混合配制)。
20.优选的，步骤(2)中，piranha溶液在金电极表面的反应时间为15～30s，去离子水冲洗时间为30～60s。
21.优选的，步骤(2)中，所述惰性气体为氮气。
22.优选的，步骤(3)中，向二硫化钼纳米片分散液中加入单链探针dna，室温下反应20～60min。
23.优选的，步骤(3)和步骤(5)中的单链探针dna和单链目标dna均溶于tris
‑
hcl缓冲液中，其浓度为25nm，ph＝7.4。
24.优选的，步骤(3)中，二硫化钼和单链探针dna的孵育时间为20～60min。
25.优选的，步骤(4)中，所述的可溶性金属盐为nacl。
26.优选的，步骤(5)中，悬浮液与单链目标dna的反应时间为6～8h。
27.本发明还提供了一种由上述制备方法制得的dna生物传感器。
28.本发明的有益效果是：
29.(1)本发明的dna生物传感器，应用范围广，可以用于特定癌症筛查、遗传工程、食品安全等方面。
30.(2)本发明操作过程简单，成本低，无需昂贵的检测装置，且具有很好的生物相容
性。
31.(3)本发明制备简单，无需繁琐的预处理，且尺寸小，可实现高效实时检测。
附图说明
32.图1为dna生物传感器的检测原理示意图。
具体实施方式
33.下面对本发明优选实施例作详细说明。
34.本实施例一种dna生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
35.步骤(1)，采用剪切剥离法得到二硫化钼纳米片分散液；本步骤操作如下：
36.(1
‑
1)将2g胆酸钠粉末和10g二硫化钼粉末加入200ml去离子水中，在10000～15000rpm的转速下间歇搅拌80～90min；
37.(1
‑
2)搅拌完成后，在1500rpm的转速下离心90min，并取上清液；
38.(1
‑
3)将步骤(1
‑
2)中的上清液在10000～15000rpm的转速下离心20min，取沉淀，向沉淀中加入去离子水使沉淀溶解；
39.(1
‑
4)将步骤(1
‑
3)重复3次，取沉淀，向沉淀中加入去离子水并超声5min，得到均匀分散的二硫化钼纳米片分散液。
40.步骤(2)，用piranha溶液清洗金电极至镜面，去离子水冲洗干净，并用氮气吹干，随后将金电极和石英晶体微天平的静态池组件组装在一起。
41.本步骤(2)中，向金电极表面滴加新鲜配置的piranha溶液(浓硫酸与质量百分数为30％双氧水按照体积比3:1混合配制)。piranha溶液在金电极表面的反应时间为15～30s，去离子水冲洗时间为30～60s。
42.步骤(3)，向步骤(2)的静态池中先加入二硫化钼分散液，再加入单链探针dna，混合均匀，室温孵育，室温下反应20～60min。
43.步骤(4)，向步骤(3)得到的混悬液中加入可溶性金属盐nacl，混合均匀，得到第一状态的免标记生物传感器。
44.步骤(5)，向步骤(4)得到的混悬液中加入单链目标dna，室温下反应，反应时间为6～8h，得到第二状态的免标记生物传感器。
45.本实施例中，步骤(3)和步骤(5)中的单链探针dna和单链目标dna均溶于tris
‑
hcl缓冲液(中文名：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，购买于北京索莱宝科技有限公司，货号：t1090)中，其浓度为25nm，ph＝7.4。本发明基于二硫化钼纳米片对单链dna和双链dna的不同亲和力，以及石英晶体微天平(quartz crystal microbalance,qcm)对质量变化敏感的特性，构建出一种基于二硫化钼纳米片的免标记生物传感器，通过检测石英晶体微天平的静态池中二硫化钼纳米片的不同状态引起的金电极表面的质量变化，得到相应的频率变化，并通过这种频率变化来迅速检测特定的dna。本发明方法操作简单，容易实现，且成本低。
46.以上对本发明的优选实施例及原理进行了详细说明，对本领域的普通技术人员而言，依据本发明提供的思想，在具体实施方式上会有改变之处，而这些改变也应视为本发明的保护范围。