α-葡萄糖苷酶抑制剂体内评价方法

本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种α-葡萄糖苷酶抑制剂体内评价方法。

背景技术：

据国际糖尿病联盟2019年发布的最新数据显示，2019年全球糖尿病患者人数约4.63亿，预计糖尿病患者人数还会逐年攀升。其中我国糖尿病患者人数在世界各国中位居榜首，2型糖尿病患者人数约占我国总糖尿病患者人数的90％。α-葡萄糖苷酶抑制剂是通过抑制小肠黏膜刷状缘的α-葡萄糖苷酶以延缓碳水化合物的吸收，降低餐后高血糖，可以用于治疗部分2型糖尿病患者。

发掘植物源的α-葡萄糖苷酶抑制剂需经过体外和体内评价，体外评价方法十分成熟，而现有体内评价方法95％以上均采用小鼠动物模型，该模型周期长，养殖成本高和养殖场所要求苛刻，十分不利于α-葡萄糖苷酶抑制剂的体内评价。

斑马鱼属于辐鳍亚纲鲤科短担尼鱼属，其基因与人类基因同源性高达87％。其胰腺的结构和功能以及参与血糖调节的相关组织器官与哺乳动物相似度高，具有一定的保守性。其繁殖速度快、个体小、可活体观察组织等优点使其作为模式生物在糖尿病研究中得到了应用。

现有技术中，如一种ii型糖尿病斑马鱼模型的构建方法及应用，申请号cn201911005040.4，虽然提供了一种斑马鱼模型，但构建转基因斑马鱼，部分实验室由于实验条件限制无法实现，普适性不太高。构建过程较复杂，存在一定的风险。另外，采用药物对转基因斑马鱼进行造模，药物的使用量对模型构建成功是否会产生影响并未进行相关说明。再者，含有硝基基团的化合物具有一定的诱变性和遗传毒性，在造模过程中除了发挥诱导杀死胰腺组织细胞的作用外，可能对斑马鱼机体产生其它毒害。

技术实现要素：

基于此，有必要针对上述提到的至少一个问题，提供一种α-葡萄糖苷酶抑制剂体内评价方法。

本发明申请提供的α-葡萄糖苷酶抑制剂体内评价方法，包括下列步骤：

饲养斑马鱼直至状态稳定；

将所述斑马鱼投入3％葡萄糖水中养殖2～6天，确定得高血糖斑马鱼模型；

在所述3％葡萄糖水中再加入杨梅苷，饲养所述高血糖斑马鱼模型若干天后，测定所述高糖斑马鱼模型的肠道样品中α-葡萄糖苷酶的酶活力。

在其中一个实施例中，所述饲养斑马鱼直至状态稳定的步骤，包括：

将斑马鱼放入水温为25℃～27℃的清水中，断食24小时；

向所述斑马鱼投喂丰年虫，每隔三天更换清水一次，每天对所述斑马鱼光照14小时；

检测到斑马鱼在两周内的死亡率小于或等于5％，确定所述斑马鱼为状态稳定。

在其中一个实施例中，所述将所述斑马鱼投入3％葡萄糖水中养殖2～6天的步骤，包括：

每天定时定量向所述斑马鱼投放过量食物；

间隔48小时更换2/3的3％葡萄糖水；

所述3％葡萄糖水的水温维持在25～27℃，控制所述斑马鱼的昼夜时长分别为14h和10h。

在其中一个实施例中，所述测定所述高糖斑马鱼模型的肠道样品中α-葡萄糖苷酶的酶活力的步骤，包括：

测定α-葡萄糖苷酶浓度与吸光度值关系间的标准曲线；

解剖所述高糖斑马鱼模型，得到若干组肠道样品，并根据所述肠道样品制作待测液；

测定含有所述待测液的酶浓度测试液的实测吸光度曲线；

根据所述标准曲线和所述实测吸光度曲线，确定各组肠道样品中α-葡萄糖苷酶的酶活力。

在其中一个实施例中，所述测定α-葡萄糖苷酶浓度与吸光度值关系间的标准曲线的步骤，包括：

以磷酸盐缓冲盐溶液分别配制浓度为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5u/ml的多组α-葡萄糖苷酶溶液；

在酶标板中加入第一容积的标准磷酸盐缓冲盐溶液和第二容积的所述α-葡萄糖苷酶溶液后，混匀得第一测试混合物；

将所述第一测试混合物在37℃下静置10min后，加入第三容积的pnpg溶液，混匀得第二测试混合物；

将所述第二测试混合物在37℃下静置30min后，加入第四容积的na2co3溶液，混匀后得第三测试混合物，并置于酶标仪中测定吸光度值。

在其中一个实施例中，所述测定含有所述待测液的酶浓度测试液的实测吸光度曲线的步骤，包括：

将所述肠道样品破碎后加入标准磷酸盐缓冲盐溶液，在4℃下静置1h后，离心处理后得到待用上清液；

在酶标板中加入第一容积的标准磷酸盐缓冲盐溶液和第二容积的所述待用上清液后，混匀得第一实测混合物；

将所述第一实测混合物在37℃下静置10min后，加入第三容积的pnpg溶液，混匀得第二实测混合物；

将所述第二实测混合物在37℃下静置30min后，加入第四容积的na2co3溶液，混匀后得第三实测混合物，并置于酶标仪中测定吸光度值，得到实测吸光度曲线。

在其中一个实施例中，所述第一容积为60μl，所述第二容积为10μl，所述第三容积为10μl；所述第四容积为50μl；所述标准磷酸盐缓冲盐溶液的浓度为0.02mol/l，所述pnpg溶液的浓度为2.5mmol/l，所述na2co3溶液的浓度为0.2mol/l。

本发明的实施例中提供的技术方案带来如下有益技术效果：

本发明提供的α-葡萄糖苷酶抑制剂体内评价方法可通过人工饲养的高糖斑马鱼模型进行，高糖斑马鱼模型构建效率高，能够节省时间成本和经济成本，也能够成功评价a-葡萄糖苷酶抑制剂类降血糖物质的体内降血糖活性，以及用于评价a-葡萄糖苷酶抑制剂在体内降低肠道酶活力的性能，操作方便难度低。

本申请附加的方面和优点将在后续部分中给出，并将从后续的描述中详细得到理解，或通过对本发明的具体实施了解到。

附图说明

图1为本发明一实施例中α-葡萄糖苷酶抑制剂体内评价方法的方法流程示意图；

图2为本发明一实施例中s100饲养斑马鱼直至状态稳定的方法流程示意图；

图3为本发明一实施例中高血糖斑马鱼模型构建时长对比图；

图4为本发明一实施例中测定高糖斑马鱼模型的肠道样品中α-葡萄糖苷酶的酶活力的方法流程示意图；

图5为本发明一实施例中测定α-葡萄糖苷酶浓度与吸光度值关系间的标准曲线的方法流程示意图；

图6为本发明一实施例中测定含有待测液的酶浓度测试液的实测吸光度曲线的方法流程示意图；

图7为本发明一实施例中杨梅苷暴露后斑马鱼血糖浓度变化结果示意图；

图8为本发明一实施例中药物暴露后斑马鱼肠道内α-葡萄糖苷酶浓度变化结果示意图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的可能的实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文已经通过附图描述的实施例。通过参考附图描述的实施例是示例性的，用于使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面，而不能解释为对本发明的限制。此外，如果已知技术的详细描述对于示出的本发明的特征是非必要技术的，则可能将这些技术细节予以省略。

相关领域的技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)，具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语，应该被理解为具有与现有技术中的意义一致的意义，并且除非像这里一样被特定定义，否则不会用理想化或过于正式的含义来解释。

本技术领域技术人员可以理解，除非特意声明，这里使用的单数形式“一”、“一个”、“所述”和“该”也可包括复数形式。应该进一步理解的是，本申请的说明书中使用的措辞“包括”是指存在所述特征、整数、步骤、操作、元件和/或组件，但是并不排除存在或添加一个或多个其他特征、整数、步骤、操作、元件、组件和/或它们的组。应该理解，这里使用的措辞“和/或”包括一个或更多个相关联的列出项的全部或任一单元和全部组合。

下面以具体地实施例对本发明的技术方案以及该技术方案如何解决上述的技术问题进行详细说明。

本发明申请一实施例中提供了一种α-葡萄糖苷酶抑制剂体内评价方法，如图1所示，包括下列步骤：

s100:饲养斑马鱼直至状态稳定。

s200:将斑马鱼投入3％葡萄糖水中养殖2～6天，确定得高血糖斑马鱼模型。

s300:在3％葡萄糖水中再加入杨梅苷，饲养高血糖斑马鱼模型若干天后，测定高糖斑马鱼模型的肠道样品中α-葡萄糖苷酶的酶活力。具体内容可以是：葡萄糖浓度旋转为3％，同时加入杨梅苷，以清水饲养的斑马鱼作为空白对照。两组的喂食量和换水换药时间均保持一致，每日喂食2次，每隔48h换水换药一次，暴露若干天，例如共暴露5天。取样当天，喂完食2h后开始进行血糖浓度测定。

本发明提供的α-葡萄糖苷酶抑制剂体内评价方法可通过人工饲养的高糖斑马鱼模型进行，高糖斑马鱼模型构建效率高，能够节省时间成本和经济成本，也能够成功评价a-葡萄糖苷酶抑制剂类降血糖物质的体内降血糖活性，以及用于评价a-葡萄糖苷酶抑制剂在体内降低肠道酶活力的性能，操作方便难度低。

可选你的，在本发明申请一个实施例中，s100饲养斑马鱼直至状态稳定的步骤，如图2所示，具体包括：

s110：将斑马鱼放入水温为25℃～27℃的清水中，断食24小时。

s120：向斑马鱼投喂丰年虫，每隔三天更换清水一次，每天对斑马鱼光照14小时。

s130：检测到斑马鱼在两周内的死亡率小于或等于5％，确定斑马鱼为状态稳定。

在采购斑马鱼前，提前准备好足量已经经过杀菌、曝气处理过两天的水，并调节水温至25℃～27℃。将成年野生型斑马鱼采购回来后，隔袋放置在曝气水中半小时，让其适应斑马鱼养殖系统内的温度，待其适应环境温度后，再将其缓慢放入准备好的鱼缸中，可在每缸放入25～30尾。对上述刚进入斑马鱼养殖系统的斑马鱼，断食24h，24h后开始定时定量投喂丰年虫，一日三次，每次投喂一吸管丰年虫，再逐步半管补加。

每天观察斑马鱼养殖系统中的水质情况，每隔3天给斑马鱼换一次水。在此期间，通过斑马鱼养殖系统内的时控开关控制斑马鱼的光照时长，照明时长14h，黑夜10h。每天观察记录斑马鱼的存活情况以及活动状态。若斑马鱼在两周内的死亡率小于等于5％，即该批斑马鱼状态已稳定，可用于后续科学研究。

可选的，在本发明申请一个实施例中，将斑马鱼投入3％葡萄糖水中养殖2～6天的步骤，包括：每天定时定量向斑马鱼投放过量食物；间隔48小时更换2/3的3％葡萄糖水；3％葡萄糖水的水温维持在25～27℃，控制斑马鱼的昼夜时长分别为14h和10h。

模型的建立采用葡萄糖浸泡法。实验开始时，提前两天随机挑取270尾体型相当的成年斑马鱼，分为9缸，每缸30尾野生型斑马鱼，每三缸为一组，一共三组，分别为对照组、实验组1、实验组2，实验组1和实验组2均为高糖组。对照组用25l清水养殖。实验组1采用2％葡萄糖水养殖，每缸25l清水加入500g葡萄糖。实验组2采用3％葡萄糖水养殖，每缸25l清水加入750g葡萄糖。对照组和高糖组实验时的喂食量、换水时间、昼夜条件和水温等均保持一致。

每天定时定量喂食两顿(过量喂食)，每隔48h换2/3水以保持高糖组的高糖环境，而对照组直接换曝气杀过菌的清水，高糖组换上对应浓度的葡萄糖水。实验中严格保持每缸水温在25℃-27℃，通过斑马鱼养殖系统中的时控开关控制斑马鱼的昼夜时长分别为14h和10h。检测餐后2h血糖，每次每组随机取6尾野生型斑马鱼检测，此后每隔48h定时利用血糖仪监测两组斑马鱼餐后2h的血糖浓度，当葡萄糖浸泡的高糖组斑马鱼血糖值较对照组上升约2倍时，即确定高血糖斑马鱼模型建立所需的时间。

如图3所示，当暴露时间在2-6天时，3％葡萄糖暴露组血糖值约是空白对照组的2倍，且血糖值趋于稳定。虽在第10天和26天血糖值出现急剧升高，但这两天的血糖值不能保持在稳定值，影响模型的稳定性。且养殖时间过长，也容易导致斑马鱼死亡，不能确保实验的稳定进行。因此，确定高血糖斑马鱼模型构建时长为2-6天。

可选的，在本发明申请的一个实施例中，测定高糖斑马鱼模型的肠道样品中α-葡萄糖苷酶的酶活力的步骤，如图4所示，具体包括如下步骤：

s310：测定α-葡萄糖苷酶浓度与吸光度值关系间的标准曲线。

s320：解剖高糖斑马鱼模型，得到若干组肠道样品，并根据肠道样品制作待测液。

s330：测定含有待测液的酶浓度测试液的实测吸光度曲线。

s340：根据标准曲线和实测吸光度曲线，确定各组肠道样品中α-葡萄糖苷酶的酶活力。

可选的，结合上述实施例，在本发明申请一个实施例的具体实现方式中，测定α-葡萄糖苷酶浓度与吸光度值关系间的标准曲线的步骤，如图5所示，具体包括如下步骤：

s311：以磷酸盐缓冲盐溶液分别配制浓度为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5u/ml的多组α-葡萄糖苷酶溶液。

s312：在酶标板中加入第一容积的标准磷酸盐缓冲盐溶液和第二容积的α-葡萄糖苷酶溶液后，混匀得第一测试混合物。

s313：将第一测试混合物在37℃下静置10min后，加入第三容积的pnpg溶液，混匀得第二测试混合物。

s314：将第二测试混合物在37℃下静置30min后，加入第四容积的na2co3溶液，混匀后得第三测试混合物，并置于酶标仪中测定吸光度值。

在对实验样品进行测定前，配制系列浓度的标准α-葡萄糖苷酶溶液进行酶活力测定，建立α-葡萄糖苷酶浓度定量测定标准曲线。然后，测定斑马鱼肠道样品中α-葡萄糖苷酶浓度。具体步骤如下：用pbs(phosphatebufferedsaline,磷酸盐缓冲盐溶液)分别配制浓度为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5u/ml的α-葡萄糖苷酶溶液，再按如下条件进行实验：

在酶标板中加入60μl的0.02mol/l的pbs，10μl的α-葡萄糖苷酶溶液，混匀，在37℃静置10min后加入10μl的2.5mmol/lpnpg溶液，混匀，在37℃下静置30min后，加入50μl的0.2mol/lna2co3溶液，混匀。最后将得到的混合溶液在酶标仪中于405nm波长处测定吸光度值。

以α-葡萄糖苷酶浓度为横坐标，其对应的吸光度值为纵坐标，制作α-葡萄糖苷酶浓度与吸光度值关系间的标准曲线。

可选的，结合上述实施例，在本发明申请一个实施例的具体实现方式中，测定含有待测液的酶浓度测试液的实测吸光度曲线的步骤，如图6所示，包括：

s321：将肠道样品破碎后加入标准磷酸盐缓冲盐溶液，在4℃下静置1h后，离心处理后得到待用上清液；

s331：在酶标板中加入第一容积的标准磷酸盐缓冲盐溶液和第二容积的待用上清液后，混匀得第一实测混合物；

s332：将第一实测混合物在37℃下静置10min后，加入第三容积的pnpg溶液，混匀得第二实测混合物；

s333：将第二实测混合物在37℃下静置30min后，加入第四容积的na2co3溶液，混匀后得第三实测混合物，并置于酶标仪中测定吸光度值，得到实测吸光度曲线。

将高糖斑马鱼模型中的斑马鱼进行解剖后，取肠道样品(4条肠道作为一个样品。)，置于冰上解冻后，用无菌剪刀分别将各组肠道样品剪碎。然后，加入相同体积的0.02mol/lpbs溶液，在4℃静置1h后，在8000r/min、4℃条件下离心10min，收集上清液待用，也即获取到待用上清液。

在酶标板中加入60μl的0.02mol/l的pbs，10μl的待用上清液，混匀，在37℃静置10min后加入10μl的2.5mmol/lpnpg溶液，混匀，在37℃下静置30min后，加入50μl的0.2mol/lna2co3溶液，混匀。最后将得到的混合溶液在酶标仪中于405nm波长处测定吸光度值。将测定值代入到酶浓度标准曲线中，计算各组肠道样品中α-葡萄糖苷酶的活力。

如图7所示的是杨梅苷暴露后斑马鱼血糖浓度变化。结果表明，本发明申请提供的高血糖斑马鱼模型能够用于α-葡萄糖苷酶抑制剂降血糖活性评价。也能说明杨梅苷和阿卡波糖在体内具有一定的降血糖作用。

如图8所示的是药物暴露后斑马鱼肠道内α-葡萄糖苷酶浓度。结果进一步表明杨梅苷和阿卡波糖在斑马鱼肠道内对α-葡萄糖苷酶活力具有抑制作用。

目前，以斑马鱼为模式生物构建高血糖模型的主要方法可分为诱导型、基因修饰型和自发型，模型周期与小鼠模型并未体现优势。本课题组通过优化模型的构建条件，构建了a-葡萄糖苷酶抑制剂体内降血糖和降低酶活力的快速评价模型。其大大节省了时间成本与经济成本，在实际应用中具有重要意义。

与现有技术方案相比较，本发明申请提供的α-葡萄糖苷酶抑制剂体内评价方法具有如下技术效果：

(1)时间优势。利用葡萄糖浸泡法构建高血糖斑马鱼模型中，已报道的模型构建时长一般为14-28天，耗时较长。本发明申请通过连续的暴露时间监测和暴露浓度优化，确定采用3％高浓度葡萄糖溶液浸泡结合过量食物喂养斑马鱼的方法，高血糖模型的稳定时间为2-6天，可具体选择5天。

(2)样本优势。本发明申请提供的技术方案缩短了高血糖斑马鱼模型的构建时间，缩短了斑马鱼在高糖环境中的生活时间，一定程度上降低了并发症的发生时间，样本量的存活率较高。

(3)成本优势。本发明申请采用短时高浓度葡萄糖溶液浸泡法制备高血糖斑马鱼模型，节约了时间成本的同时，需用的葡萄糖总量及饲养总量减少，降低了模型构建成本。

(4)操作优势。采用葡萄糖浸泡法构建高血糖斑马鱼模型，只需定期更换喂养体系中的葡萄糖水，相比于基因敲除法及链脲佐菌素注射法，操作简单、快速。

本技术领域技术人员可以理解，本申请中已经讨论过的各种操作、方法、流程中的步骤、措施、方案可以被交替、更改、组合或删除。进一步地，具有本申请中已经讨论过的各种操作、方法、流程中的其他步骤、措施、方案也可以被交替、更改、重排、分解、组合或删除。进一步地，现有技术中的具有与本申请中公开的各种操作、方法、流程中的步骤、措施、方案也可以被交替、更改、重排、分解、组合或删除。

术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本申请的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。

在本申请的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本申请中的具体含义。

在本说明书的描述中，具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

应该理解的是，虽然附图的流程图中的各个步骤按照箭头的指示依次显示，但是这些步骤并不是必然按照箭头指示的顺序依次执行。除非本文中有明确的说明，这些步骤的执行并没有严格的顺序限制，其可以以其他的顺序执行。而且，附图的流程图中的至少一部分步骤可以包括多个子步骤或者多个阶段，这些子步骤或者阶段并不必然是在同一时刻执行完成，而是可以在不同的时刻执行，其执行顺序也不必然是依次进行，而是可以与其他步骤或者其他步骤的子步骤或者阶段的至少一部分轮流或者交替地执行。

以上所述仅是本申请的部分实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。