一种肝素结合蛋白(HBP)时间分辨荧光免疫层析半定量检测试纸条

一种肝素结合蛋白(hbp)时间分辨荧光免疫层析半定量检测试纸条
技术领域
1.本发明涉及肝素结合蛋白(hbp)的免疫学检测领域，特别是一种肝素结合蛋白(hbp)时间分辨荧光免疫层析半定量检测试纸条。


背景技术：

2.目前急危重症医学面临的重要临床问题是脓毒症和脓毒性休克，每年全球脓毒症患者超过1900万，将近600万患者死亡，病死率超过25％，严重威胁人们的身心健康。病死率高的主要原因是因感染引起的宿主反应失调导致的危及生命的器官功能障碍，同时并具有严重的循环、细胞和代谢紊乱。因此对于脓毒症及脓毒性休克早期诊断指标的检测显得极为重要，进而采取快速、合理的治疗方案，降低病死率。
3.目前，临床诊断常用的感染性检测指标包括：白细胞计数、血沉(esr)、c反应蛋白(crp)、降钙素原(pct)、血清淀粉样蛋白a(saa)。2014《中国脓毒症早期预防及阻断急诊专家共识》指出，肝素结合蛋白(heparin
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binding protein，hbp)是严重细菌感染的创新型感染诊断标志物，有着非常广阔的应用发展潜力。与其它感染性指标相比，其具有灵敏性高，同时具有出现早，且只在急性细菌感染时浓度极度升高，在病毒感染和非特异性炎症时较低水平表达等特点。2020《中国脓毒症早期预防及阻断急诊专家共识》指出，脓毒症严重程度与hbp含量具有一定相关性，其对脓毒症患者疾病严重程度评估具有临床指导意义，同时对由脓毒症引发的休克性患者的早期诊断和治疗效果监测意义重大。
4.hbp是由成熟中性粒细胞分泌的一种具有杀菌和趋化特性的蛋白质。其相对分子量为37,000，也称为cap37或天青杀素。正常人血中hbp一般不超过10ng/ml，当机体发生感染，部分细菌侵入到血管内，进而菌体自身或者细菌释放的代谢产物等毒素物质刺激中性粒细胞释放hbp，引发血中hbp含量升高，一般感染时，hbp含量在20
‑
30ng/ml，严重感染时血中含量可能超过100ng/ml。
5.目前hbp检测方法主要包括胶乳免疫比浊法、速率散射比浊法、荧光免疫层析法。比浊法需要专门的昂贵检测仪器，现有的荧光免疫层析荧光效率低，荧光材料与hbp偶联后分离困难等缺点。因此，建立一种快速、简单、灵敏及成本低的hbp检测方法具有很高的应用价值。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种肝素结合蛋白(hbp)时间分辨荧光免疫层析半定量检测试纸条，具有特异性高、检测时间短(20分钟内完成hbp的快速灵敏检测，实现对hbp浓度在6.25ng/ml
‑
200ng/ml进行半定量检测)及灵敏度高等优势，适用于实时检测，不需要大型昂贵的仪，可用于感染性疾病及在脓毒症的早期诊疗。
7.本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
8.一种肝素结合蛋白(hbp)时间分辨荧光免疫层析半定量检测试纸条，包括试纸条
本体，所述试纸条本体根据时间分辨荧光微球偶联的hbp标记抗体进行检测；所述试纸条本体两端分别设有检测线和质控线，所述检测线的点样成分为与所述时间分辨荧光微球偶联的hbp标记抗体配对的hbp抗体，所述质控线的点样成分为羊抗小鼠igg。
9.进一步，所述试纸条本体包括背衬底板，所述背衬底板上设有nc膜，样品垫与吸水垫设于nc膜上。
10.进一步，所述试纸条本体上近检测线的一端设有样品垫，所述试纸条本体近质控线的一端设有吸水垫。
11.进一步，所述检测线与质控线间隔为0.3
‑
0.6cm；所述样品垫距检测线间的间隔为0.3
‑
0.6cm。
12.进一步，所述时间分辨荧光微球偶联的hbp标记抗体和检测线的点样成分均为鼠抗人hbp单克隆抗体，所述时间分辨荧光微球偶联的hbp标记抗体和检测线的点样成分分别针对人hbp的不同表位。
13.进一步，所述时间分辨荧光微球偶联的hbp标记抗体采用edc/nhs方法偶联制得。
14.进一步，所述时间分辨荧光微球偶联的hbp标记抗体通过以下步骤制得：
15.s01：在时间分辨荧光微球中加入缓冲液，经吹打混匀、离心以及移出上清后得到清洗时间分辨荧光微球；
16.s02：对清洗时间分辨荧光微球进行重悬得到清洗微球悬液；
17.s03：对清洗微球悬液进行活化；
18.s04：加入hbp检测抗体，并进行吹打混匀以及水浴；
19.s05：加入封闭液进行室温反应，之后进行离心并弃上清，加入保存液进行遮光保存。
20.进一步，所述步骤s01包括以下子步骤：
21.s0101：吸取10μl时间分辨荧光微球，加入2ml圆底离心管中；
22.s0102：加入200μl ph 7.4硼酸缓冲液，用移液器吹打混匀15s，14000g/min，离心5min，移除上清，得到清洗时间分辨荧光微球；
23.所述步骤s02包括以下子步骤：
24.s0201：吸取100μl ph 7.4硼酸缓冲液重悬微球，并用20
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200μl移液器吹打混匀得到清洗微球悬液；
25.所述步骤s03包括以下子步骤：
26.s0301：配制edc溶液和nhs溶液，取4.8μl edc(1mg/ml)和5.6μl nhs(1mg/ml)，加入到s02制备的清洗微球悬液，吹打混匀，37℃水浴，30min，每隔10min晃动一次；
27.s0302：加入500μl ph 7.4硼酸缓冲液，吹打混匀，14000g/min，离心15min，移除上清，加入100μl ph 7.4硼酸缓冲液；
28.所述步骤s04包括以下子步骤：
29.s0401：加入15微升1mg/ml hbp检测抗体(r152c7，南京欧凯生物科技有限公司)，吹打混匀，然后置37℃，水浴1h；
30.所述步骤s05包括以下子步骤：
31.s0501：加入封闭液牛血清白蛋白(bsa)溶液(10％bsa)，加入10μl，室温反应30min，10min晃动一次；
32.s0502：14000g/min,15min离心，弃上清；加入100μl保存液(1％bsa ph 7.4硼酸缓冲液)，4℃避光保存。
33.进一步，所述时间分辨荧光微球的颗粒大小为300nm。时间分辨荧光微球表面基团为羧基。
34.本发明的有益效果是：
35.采用本发明检测hbp具有特异性高、检测时间短(20分钟内完成hbp的快速灵敏检测)及灵敏度高等优势，适用于实时检测，实现对hbp浓度在6.25ng/ml
‑
200ng/ml进行半定量检测，不需要大型昂贵的仪，可用于感染性疾病及在脓毒症的早期诊疗。对严重感染导致患者休克、脓毒症及器官功能障碍综合症的预测、诊断、预后评估具有很好的临床意义，易于现场快速检测及在基层偏远医院和诊所推广使用。
附图说明
36.图1是本发明的结构示意图；
37.图2是采用本发明进行检测的灵敏度测试结果图：试纸条1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11，分别代表样品溶液hbp(k1523，南京欧凯生物科技有限公司)的浓度分别为200ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ml、6.25ng/ml、3.125ng/ml、1.56ng/ml、0.78ng/ml、0.39ng/ml和0ng/ml；
38.图3是采用本发明进行检测的特异性结果图：试纸条1、2、3、4、5和6分别代表n端脑钠肽前体(nt
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probnp)溶液、牛血清白蛋白(bsa)溶液、c反应蛋白(crp)溶液、肺炎支原体p1粘附蛋白溶液、血清淀粉样蛋白a(saa)溶液和和含1％tween 20的ph7.4硼酸缓冲液；
39.图中，1
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反应管、2
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nc膜、3
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吸水垫、4
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背衬底板、5
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质控线、6
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检测线、7
‑
样品垫。
具体实施方式
40.以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。需说明的是，在不冲突的情况下，以下实施例及实施例中的特征可以相互组合。
41.需要说明的是，以下实施例中所提供的图示仅以示意方式说明本发明的基本构想，遂图式中仅显示与本发明中有关的组件而非按照实际实施时的组件数目、形状及尺寸绘制，其实际实施时各组件的型态、数量及比例可为一种随意的改变，且其组件布局型态也可能更为复杂。
42.下述所涉及的实施方案如若无特殊指明，均为常规方法。
43.下述实施方案所涉及的材料、试剂等，若无特殊说明，可从商业途径获取。
44.实施例一：
45.如图1所示，一种肝素结合蛋白(hbp)时间分辨荧光免疫层析半定量检测试纸条，包括试纸条本体，所述试纸条本体根据时间分辨荧光微球偶联的hbp标记抗体进行检测；所述试纸条本体两端分别设有检测线6和质控线5，所述检测线6的点样成分为与所述时间分辨荧光微球偶联的hbp标记抗体配对的hbp抗体，所述质控线5的点样成分为羊抗小鼠igg。
46.检测线6由1mg/ml的与所述时间分辨荧光微球偶联的hbp标记抗体配对的hbp单克隆抗体以移液器点样1μl而成；质控线5由1mg/ml羊抗小鼠igg(纯化)以移液器点样1μl而成。
47.试纸条本体检测线6以及质控线5点样
48.对试纸条本体进行检测线6和质控线5点样，制备试纸条本体的检测线6和质控线5。采用10μl移液器吸取1mg/ml与所述时间分辨荧光微球偶联的hbp标记抗体配对的hbp单克隆抗体(r153a2，南京欧凯生物科技有限公司)1μl加入试纸条检测线6区域；采用10μl移液器吸取1mg/ml羊抗小鼠igg(纯化)(北京索莱宝科技有限公司)1μl加入试纸条质控线5区域。
49.试纸条本体的烘干
50.将经过检测线6以及质控线5点样的试纸条本体置于恒温箱中干燥15min，干燥温度为45℃。
51.优选，所述试纸条本体包括背衬底板4，所述背衬底板4上设有nc膜2，样品垫7与吸水垫3设于nc膜2上。
52.nc膜2为硝酸纤维素膜。在所述背衬底板4上方中间粘贴nc膜。
53.所述nc膜2为爬速110
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165s/4cm的sartorius cn 140，所述样品垫7为玻璃纤维膜，所述吸水纸为吸水滤纸，上述试纸条相关耗材均为常用材料。
54.优选，所述试纸条本体上近检测线6的一端设有样品垫7，所述试纸条本体近质控线5的一端设有吸水垫3。
55.在所述nc膜2两端，在其上方一端搭接有样品垫7，其上方另一端搭接有吸水垫3。所述nc膜2靠近样品垫7一端为检测线6，靠近吸水垫3一端为质控线5。
56.在所述nc膜以溶液从样品垫7流向吸水垫3方向依次包被有检测线6(t线)以及质控线5(c线)。
57.所述检测线6与质控线5间隔为0.3
‑
0.6cm；所述样品垫7距检测线6间的间隔为0.3
‑
0.6cm。
58.优选，所述样品垫7和检测线6以及检测线6和质控线5之间的间隔均为0.5cm。
59.试纸条本体的组装
60.将nc膜2、样品垫7和吸收垫依次贴在背衬底板4上，粘贴位置参照图1，然后采用裁纸刀切成宽度为4
‑
6mm试纸条；
61.所述时间分辨荧光微球偶联的hbp标记抗体设于反应管1内。
62.时间分辨荧光微球偶联的hbp标记抗体即为hbp荧光探针。
63.所述反应管1为体积为2ml ep管(eppendorf)及以上或96孔酶标板微孔。
64.反应管1内设有荧光探针溶液，荧光探针溶液包括样本溶液、样本稀释液以及hbp荧光探针。样本溶液、样本稀释液以及hbp荧光探针的质量分数分别为50、45、5。
65.荧光探针溶液总体积为100μl，包括样本溶液50μl，样本稀释液45μl和hbp荧光探针5μl。
66.所述时间分辨荧光微球偶联的hbp标记抗体和检测线6的点样成分均为鼠抗人hbp单克隆抗体，所述时间分辨荧光微球偶联的hbp标记抗体和检测线6的点样成分分别针对人hbp的不同表位。
67.所述时间分辨荧光微球偶联的hbp标记抗体为时间分辨荧光微球标记的鼠抗人hbp单克隆抗体，检测线6包被是与其配对的鼠抗人hbp单克隆抗体，它们识别hbp不同的表位。
68.所述时间分辨荧光微球偶联的hbp标记抗体为hbp的一种来源于鼠的单克隆抗体。
69.所述时间分辨荧光微球偶联的hbp标记抗体采用edc/nhs方法偶联制得。
70.hbp标记抗体与时间分辨荧光微球(美国bangs，300nm含铕羧基荧光微球)偶联制备hbp荧光探针的方法采用1
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(3
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二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐/n
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羟基磺基琥珀酰亚胺(edc/nhs)。
71.所述时间分辨荧光微球偶联的hbp标记抗体通过以下步骤制得：
72.s01：在时间分辨荧光微球中加入缓冲液，经吹打混匀、离心以及移出上清后得到清洗时间分辨荧光微球；
73.s0101：吸取10μl时间分辨荧光微球，加入2ml圆底离心管中。
74.s0102：加入200μl ph 7.4硼酸缓冲液，用移液器吹打混匀15s，14000g/min，离心5min，移除上清，得到清洗时间分辨荧光微球。
75.s02：对清洗时间分辨荧光微球进行重悬得到清洗微球悬液；
76.吸取100μl ph 7.4硼酸缓冲液重悬微球，并用20
‑
200μl移液器吹打混匀得到清洗微球悬液。
77.s03：对清洗微球悬液进行活化；
78.s0301：配制edc溶液和nhs溶液，取4.8μl edc(1mg/ml)和5.6μl nhs(1mg/ml)，加入到s02制备的清洗微球悬液，吹打混匀，37℃水浴，30min，每隔10min晃动一次。
79.s0302：加入500μl ph 7.4硼酸缓冲液，吹打混匀，14000g/min，离心15min，移除上清，加入100μl ph 7.4硼酸缓冲液。
80.s04：加入hbp检测抗体，并进行吹打混匀以及水浴；
81.加入15微升1mg/ml hbp检测抗体(r152c7，南京欧凯生物科技有限公司)，吹打混匀，然后置37℃，水浴1h。
82.s05：加入封闭液进行室温反应，之后进行离心并弃上清，加入保存液进行遮光保存。
83.s0501：加入封闭液牛血清白蛋白(bsa)溶液(10％bsa)，加入10μl，室温反应30min，10min晃动一次。
84.s0502：14000g/min,15min离心，弃上清。加入100μl保存液(1％bsa ph 7.4硼酸缓冲液)，4℃避光保存。
85.所述时间分辨荧光微球的颗粒大小为300nm。时间分辨荧光微球表面基团为羧基。
86.进行检测时，将样本溶液、样本稀释液及hbp荧光探针震荡2min，静置5min，得到荧光探针溶液，将试纸条本体置于荧光探针溶液中层析10min，以紫外灯(365nm激发波长)观察结果。
87.实施例二
88.采用实施例一中的一种肝素结合蛋白(hbp)时间分辨荧光免疫层析半定量检测试纸条检测hbp的方法(简称为hbp时间分辨荧光试纸条检测方法)
89.取2ml离心管(eppendorf，ep管)或96孔酶标板，每管或每孔分别加入45μl样本稀
释液(1％tween 20ph 7.4硼酸缓冲液)和5μl实施例一中稀释10倍的hbp荧光探针，随后每管加入采用ph7.4硼酸缓冲液稀释的含不同浓度hbp溶液，浓度分别为200ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ml、6.25ng/ml、3.125ng/ml、1.56ng/ml、0.78ng/ml、0.39ng/ml和0ng/ml。手动震荡2min，静置反应5min后，将实施例一制备的试纸条本体插入2ml离心管或96孔酶标板孔内，层析10min，在紫外灯(365nm激发波长)暗室观察结果。
90.结果判定：
91.阳性样本溶液：t线和c线位置都有条带；阴性样本溶液：只有c线位置有条带。
92.hbp时间分辨荧光试纸条检测方法的特异性见图2所述，试纸条1
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11，分别代表hbp浓度为200ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ml、6.25ng/ml、3.125ng/ml、1.56ng/ml、0.78ng/ml、0.39ng/ml和0ng/ml。图2结果表明该hbp时间分辨荧光试纸条检测方法在6.25ng/ml
‑
200ng/ml这一区域可进行半定量检测，借助紫外灯，肉眼观察该试纸条最低检测线6为6.25ng/ml，低于正常人10ng/ml标准，可初步应用于实际对hbp的检测需要。
93.实施例三
94.hbp时间分辨荧光试纸条检测方法的特异性实验
95.采用ph 7.4硼酸缓冲液配制1μg/ml血清淀粉样蛋白a(saa)，c反应蛋白(crp)，n端脑钠肽前体(nt
‑
probnp)肺炎支原体p1粘附蛋白和牛血清白蛋白(bsa)和ph 7.4硼酸缓冲液。
96.随后取6个2ml离心管(eppendorf，ep管)或96孔酶标板6个孔，每管或每孔分别加入45μl样本稀释液(1％tween 20ph 7.4硼酸缓冲液)和5μl实施例一稀释10倍的荧光探针，随后每管/每孔分别各自加入50μl saa溶液、crp溶液、nt
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probnp溶液、肺炎支原体p1粘附蛋白溶液、bsa溶液和ph 7.4硼酸缓冲液，手动震荡2min，反应5min后，将实施例一制备的试纸条本体插入2ml离心管或96孔酶标板孔内，层析10min，在紫外灯(365nm激发波长)暗室观察结果。
97.结果判定：
98.只有c线位置有条带，表明该hbp时间分辨荧光试纸条特异性好，反之，则表明该试纸条特异性不好，不能用于实际样本检测。
99.hbp时间分辨荧光试纸条检测方法的特异性见图3所述，6个试纸条只有在c线有荧光条带，结果表明该hbp时间分辨荧光试纸条检测方法的特异性好，与其他蛋白没有交叉反应。
100.基于时间分辨荧光微球的荧光特性及免疫层析试纸条检测时间短优势，采用一种肝素结合蛋白(hbp)时间分辨荧光免疫层析半定量检测试纸条检测hbp具有特异性高、检测时间短(20分钟内完成hbp的快速灵敏检测)及灵敏度高等优势，适用于实时检测，实现对hbp浓度在6.25ng/ml
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200ng/ml进行半定量检测，不需要大型昂贵的仪，可用于感染性疾病及在脓毒症的早期诊疗。对严重感染导致患者休克、脓毒症及器官功能障碍综合症的预测、诊断、预后评估具有很好的临床意义，易于现场快速检测及在基层偏远医院和诊所推广使用。
101.20min内完成hbp 6.25ng/ml
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200ng/ml该区域样品半定量检测，为医护人员对感染性疾病及脓毒症的快速诊疗提供一定参考依据，且易于现场快速检测及推广。
102.以上所述实施例仅表达了本发明的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并
不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。