一种显微成像技术评价女贞子炮制质量的方法

1.本发明属于中药品质分析技术领域，具体涉及一种显微成像技术评价女贞子炮制质量的方法。


背景技术：

2.中药炮制是中医临床用药特色，中药经炮制后可减毒增效，中药炮制品质量关乎中医临床疗效。女贞子为木犀科植物女贞ligustrum lucidum ait . 的干燥成熟果实，具有滋补肝肾、明目乌发的功能。酒女贞子为女贞子经酒蒸法炮制而成。女贞子经酒蒸后可增强其补肝肾作用，因此临床常以酒女贞子入药。《中国药典》2020年版中收载了女贞子和酒女贞子两种炮制规格。现有研究中鲜有针对女贞子与酒女贞子显微鉴别的量化研究。
3.传统经验鉴别法依赖于人的感官评价，而个人存在感官敏感程度的差异，主观性强、个体差异大，尤其是当粉末作为丸剂、散剂、胶囊剂等中成药的原料入药后，更难以评价投药饮片的质量。现代仪器检测手段又存在样品处理过程繁琐，仪器操作复杂，检测成本高的问题。《中国药典》2020年版及各省市中药炮制规范都只对女贞子与酒女贞子的显微鉴别内容进行主观描述，未规定客观化的评价指标，同时酒女贞子的显微鉴别内容同女贞子，未体现生、制品的差异，而已经研究表明，女贞子经酒蒸后其显微特征颜色发生明显变化。为了增强女贞子与酒女贞子显微鉴别的客观性，提升其质量评价标准，有必要对女贞子与酒女贞子显微特征颜色的差异性进行数字化研究，建立女贞子与酒女贞子的显微特征数字化的质量评价指标，为女贞子与酒女贞子质量标准研究提供借鉴。


技术实现要素：

4.针对现有技术中对女贞子与酒女贞子显微鉴别研究主观性强，未见女贞子与酒女贞子显微鉴别的客观指标的问题，本发明提供了一种基于显微成像技术评价女贞子炮制质量的方法，通过显微特征颜色的数字化表达有效地对女贞子与酒女贞子进行判别，为女贞子与酒女贞子质量标准研究提供客观依据。
5.本发明通过以下技术方案实现：一种基于显微成像技术评价女贞子炮制质量的方法，包括以下步骤：（1）分别称取女贞子与酒女贞子粉末置于载玻片上，滴加水合氯醛试液，盖上盖玻片，置于烘箱内加热，冷却后置于显微镜下拍摄其显微特征图，提取显微特征的色度值l
*
、a
*
、b
*
，并计算总色度值e
*
ab，利用偏最小二乘
‑
判别分析确定主要差异性显微特征，通过fisher判别分析建立女贞子与酒女贞子的判别函数和判别规则；（2）分别称取待测女贞子或酒女贞子粉末置于载玻片上，滴加水合氯醛试液，盖上盖玻片，置于烘箱内加热，冷却后置于显微镜下拍摄其差异性显微特征图，提取显微特征的色度值l
*
、a
*
、b
*
，并计算总色度值e
*
ab，根据步骤（1）中确定的判别函数和判别规则确定女贞子与酒女贞子的质量；其中，e
*
ab=（l
*2
+ a
*2
+ b
*2
）
1/2
。
6.进一步地，所述的女贞子或酒女贞子粉末的取样量为1
‑
2mg，加入水合氯醛试液的量为30
‑
40μl/mg待测样品。
7.进一步地，所述的烘箱内温度为80~120℃，加热时间为10~20min。
8.进一步地，所述的女贞子与酒女贞子的差异性特征细胞为果皮表皮细胞、内果皮纤维细胞。
9.进一步地，所述的女贞子和酒女贞子的判别函数为：(1)女贞子与酒女贞子果皮表皮细胞的判别函数为y=0.841
×
l
*
+0.425
×
a
*
‑
0.162
×
b
*
‑
0.364
×
e
*
ab
‑
15.166；（2）女贞子与酒女贞子内果皮纤维细胞的判别函数为y=0.132
×
l
*
‑
1.283
×
b
*
+1.214
×
e
*
ab
‑
32.280；所述的判别规则为当y＞0时为女贞子，当y＜0时为酒女贞子。
10.进一步地，所述的烘箱内温度为90℃，加热时间为10min。
11.进一步地，所述的女贞子或酒女贞子为样品粉碎后过4号筛的粉末。
12.进一步地，所述的显微镜下拍摄放大倍数为
×
200。
13.进一步地，所述水合氯醛试液配制方法为：水合氯醛加水和甘油溶解，每50g 水合氯醛中加入15ml水和10ml甘油。
14.有益效果（1）本发明利用显微成像技术测定女贞子与酒女贞子粉末的显微特征颜色，建立了一种快速、便捷判别女贞子生、制品的判别方法，可以有效的运用于以女贞子生、制品为原料的丸剂、散剂、胶囊剂等中成药的质量评价，为女贞子和酒女贞子质量评价研究提供借鉴和参考；（2）本发明为一种数字化、简单、快速判别女贞子与酒女贞子的方法，能够通过中药饮片显微特征颜色的数字化表达有效的对女贞子与酒女贞子进行判别，并归属女贞子、酒女贞子所属阈值，在一定程度上解决了现有女贞子与酒女贞子判别手段主观性强、样品处理复杂、检测成本高的问题。
附图说明
15.图1为女贞子与酒女贞子显微特征图（
×
200），其中a为女贞子显微特征图，b为酒女贞子显微特征图。
具体实施方式
16.为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是进一步说明本发明的特征及优点，而不是对本发明进行限制。
17.下列实施例中使用的水合氯醛的配制方法为：每50g 水合氯醛中加入15ml水和10ml甘油溶解，得水合氯醛试液。
18.表1 10批女贞子样品信息表
表2 10批酒女贞子样品信息表。
19.实施例1（1）分别取表1、表2中的女贞子和酒女贞子，粉碎，过4号筛，称取过筛后的粉末2mg，置于载玻片上，滴加水合氯醛试液75μl，盖上盖玻片，置于烘箱内90℃加热10min，待冷却后置于显微镜下，分别拍摄果皮表皮细胞、内果皮纤维、种皮细胞的显微特征图片，女贞子的显微特征图片如图1（a）所示，酒女贞子的显微特征图片如图1（b）所示，与女贞子相比，酒女贞子显微特征颜色呈不同程度的加深。
20.显微镜拍摄参数：分辨率：预览分辨率设定为2560
*
1944；捕抓分辨率为2560
*
1944；曝光控制：非自动曝光（目标：120；增益1；曝光时间：500.0 ms）；帧速为normal sp；电源频率为直流；颜色控制：增益控制（红色增益：75；绿色增益：68；蓝色增益：165）；无颜色增强（饱和度默认100）；无单色；无自动白平衡；颜色校正off；图像调整：亮度控制（亮度：115；对比度：23；伽马值：0.730；锐度0）；无降噪与3d降噪；荧光控制：自动黑平衡（最小值24；最大值255）；无曝光检测；无过曝检测；binning:1x1；染色：off；相机参数：confg1；固定光圈大小为3，光源强度为3，放大倍数200倍。
21.（2）分别提取步骤（1）中拍摄的女贞子和酒女贞子的显微特征的颜色值（l
*
、a
*
、
b
*
），并计算总色度值（e
*
ab），其中，e
*
ab=（l
*2
+ a
*2
+ b
*2
）
1/2
，20批样本（10批女贞子和10批酒女贞子）果皮表皮细胞的l
*
、a
*
、b
*
、e
*
ab值见表3，内果皮纤维的l
*
、a
*
、b
*
、e
*
ab值见表4，种皮石细胞的l
*
、a
*
、b
*
、e
*
ab值见表5；表3 女贞子和酒女贞子果皮表皮细胞颜色测定结果（n=3）表4 女贞子和酒女贞子内果皮纤维细胞颜色测定结果（n=3）
表5 女贞子和酒女贞子种皮细胞颜色测定结果（n=3）。
22.（3）将10批女贞子与10批酒女贞子饮片的果皮表皮细胞、内果皮纤维、种皮细胞的e
*
ab值导入simca14.1 软件中，启动偏最小二乘
‑
判别分析（pls
‑
da）程序，量重要性投影值
图（vip图）可直观的表现出各显微特征影响女贞子和酒女贞子分类的权重大小、根据vip值大小排序依次为果皮表皮细胞＞内果皮纤维＞种皮细胞，vip＞1表明该变量对模型分类的贡献度具有统计学意义。3种显微特征细胞中，vip＞1的为果皮表皮细胞与内果皮纤维，认为这两种显微特征是造成女贞子与酒女贞子具有差异的主要显微特征。
23.（4）基于果皮表皮细胞色差值的判别分析10批女贞子与10批酒女贞子饮片，利用spss 21.0软件，以组别为因变量，以生、酒女贞子果皮表皮细胞的l
*
、a
*
、b
*
、e
*
ab值为自变量进行fisher判别分析，建立判别函数，并用训练样本对判别式作回代考核，对判别函数进行可靠性检验；判别函数：y=0.841
×
l
*
+0.425
×
a
*
‑
0.162
×
b
*
‑
0.364
×
e
*
ab
‑
15.166该函数判别规则为：y＞0判为女贞子，y＜0判为酒女贞子。
24.将20批样本带入判别函数进行验证，验证结果见表6，结果表明，判别函数对女贞子、酒女贞子的正判率均为100%，平均正判率为100%。
25.表6 20批样本回顾性检验结果。
26.（5）基于内果皮纤维色差值的判别分析10批女贞子与10批酒女贞子饮片，利用spss 21.0软件，以组别为因变量，以生、酒女贞子内果皮纤维的l
*
、a
*
、b
*
、e
*
ab值为自变量进行fisher判别分析，建立判别函数，并用训练样本对判别式作回代考核，对判别函数进行可靠性检验；判别函数：y=0.132
×
l
*
‑
1.283
×
b
*
+1.214
×
e
*
ab
‑
32.280该函数判别规则为：y＞0判为女贞子，y＜0判为酒女贞子。
27.将20批样本带入判别函数进行验证，验证结果见表7，结果表明，判别函数对女贞子、酒女贞子的正判率均为100%，平均正判率为100%；表7 训练集样本回顾性检验结果。
28.实施例2精密称取女贞子粉末（过4号筛）2mg置于载玻片上，滴加水合氯醛试液75μl，盖上盖玻片，置于烘箱内分别于80℃、90℃、100℃加热10min、20min，显微镜视野及显微特征分析如下表8所示；表8 不同烘制条件下女贞子粉末的透化效果分析
。