一种基于微电极的肿瘤标志物快速高灵敏检测方法

1.本发明涉及一种肿瘤标志物检测方法，具体涉及一种基于微电极的肿瘤标志物快速高灵敏检测方法，属于微电极检测技术领域。


背景技术：

2.肿瘤标志物可稳定存在于血清、尿液等体液或组织中，对肿瘤存在与生长变化具有指示作用，是肿瘤早期诊断的重要指标。
3.实现肿瘤标志物的快速高灵敏检测一直以来是临床检测的主要需求。
4.目前，肿瘤标志物的检测方法有：放射免疫分析法、化学发光免疫分析法、酶联免疫吸附试验测定法、免疫传感器、蛋白质组学、分子生物学方法、液体活检、电化学传感器等。
5.1、放射免疫分析法
6.作为传统的肿瘤标志物检测方法，放射免疫分析法具有灵敏度高、易于商品化的优势。但是，该方法缺陷也很明显，如：使用寿命短且有放射性污染风险。
7.2、化学发光免疫分析法、酶联免疫吸附试验测定法、免疫传感器
8.基于抗原抗体分子之间特异性结合的化学发光免疫分析法、酶联免疫吸附试验测定法和免疫传感器法具有特异性高且灵敏度较高的优势。但是，以上免疫学方法存在样品前处理复杂、耗时较长、抗体成本昂贵等缺陷。
9.3、蛋白质组学
10.基于双向电泳和质谱技术的蛋白质组学可实现肿瘤标志物的高通量和高灵敏检测，是进行肿瘤标志物研究的良好的平台。但是，该方法检测成本昂贵、对技术人员操作要求高，不适合大范围的普及应用。
11.4、分子生物学方法
12.以聚合酶链反应和荧光原位杂交技术为代表的分子生物学方法同样具有高通量、特异性强、敏感性高的优势。但是，该方法存在运行成本昂贵的不足之处，且检测周期相对较长。
13.5、液体活检
14.液体活检在临床检测中可实现无创、反复取样，且操作简便，并可实时监控。但是，该方法运行成本贵、标准不统一，尚需进一步完善。
15.6、电化学传感器
16.电化学传感器是基于待测物的电化学性质并将待测物化学量转变成电学量进行检测的一种装置，具有操作简单、携带方便、对分析物可以进行连续快速检测等优越性能，已经广泛应用于环境样品中有机、无机、颗粒物、微生物等物质的检测以及环境参数的快速、高灵敏检测。其中，基于方波伏安法的电化学分析方法因其具有成本低、操作简便、反应快速、易于小型化等优点而备受研究者们青睐。作为电化学和电分析化学的前沿领域，微电极可实现微小体积样品及微环境中物质的检测。因此，发展基于电化学微电极的传感技术
为肿瘤标志物的微小体积样品临床检测提供了新的思路。
17.微电极是指几何尺寸小于100微米的电极，具有传质速率快、ir降低、时间常数(rc)小、响应快速、充电电流小等优点，已广泛应用于生命科学、环境检测和临床诊断等多个领域。其中，电流型微电极可实现单细胞神经递质和微环境下氧化还原物质测定。因此，通过电流型微电极阻抗及电流变化可实现微小体积血清等体液样品中肿瘤标志物的快速、高灵敏测定，是实现临床快速诊断的良好工具。
18.核酸适配体(aptamer)是利用体外筛选技术——指数富集的配体系统进化技术，从核酸分子文库中得到的可特异识别靶分子的寡核苷酸片段，具有分子量小、生产成本低、存储和运输简单、无批次间差异、可以快速放大以及质控简单等优点。作为类似抗体的平台型技术，aptamer已在食品检测、环境分析、临床诊断等方面具有非常广泛的应用。与免疫学测定方法相比，基于aptamer的测定方法具有合成简单、稳定性好、亲和力强、选择性高等优点，在生物学检测方面具有广阔的应用前景。
19.然而，基于aptamer的微电极在肿瘤标志物的临床快速诊断中的应用尚未见报道。


技术实现要素：

20.本发明的目的在于提供一种基于微电极的肿瘤标志物快速高灵敏检测方法。
21.为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
22.一种基于微电极的肿瘤标志物快速高灵敏检测方法，其特征在于，前述肿瘤标志物为cea，前述检测方法包括以下步骤：
23.步骤1、制作裸电极
24.先将铂丝、金丝、银丝或碳纤维与铜丝相连，然后铜丝朝上整体插入毛细玻璃管内并将毛细玻璃管的上端封闭，之后将毛细玻璃管与铂丝、金丝、银丝或碳纤维融合并将毛细玻璃管的下端磨平，最后清洗干净并室温晾干，得到裸电极；
25.步骤2、在裸电极表面沉积金纳米颗粒
26.通过恒电流法在裸电极表面沉积金纳米颗粒，得到au
‑
裸电极；
27.步骤3、合成cea aptamer并在末端修饰巯基
28.经巯基修饰的cea aptamer的序列为：hs
‑
c6
‑
aaaaaaataccagcttattcaatt；
29.步骤4、将经巯基修饰的cea aptamer结合至au
‑
裸电极表面
30.取经巯基修饰的cea aptamer，加入适量pbs溶液，95℃变性5min，迅速冷却，待cea aptamer冷却至室温时，取20μl与au
‑
裸电极室温孵育，得到cea aptamer
‑
au
‑
裸电极；
31.步骤5、绘制标准曲线
32.将前面制作得到的cea aptamer
‑
au
‑
裸电极与不同浓度的cea室温孵育，测定孵育前后的方波伏安曲线，计算峰电流变化结果，以cea的浓度为横坐标，以峰电流变化为纵坐标，绘制标准曲线；
33.步骤6、用cea aptamer
‑
au
‑
裸电极检测临床样本
34.取微小体积临床血清样本，与cea aptamer
‑
au
‑
裸电极室温孵育，通过方波伏安法检测cea aptamer
‑
au
‑
裸电极捕获cea前后峰电流值的变化，根据前面绘制得到的标准曲线确定样本中cea的含量。
35.前述的基于微电极的肿瘤标志物快速高灵敏检测方法，其特征在于，在步骤1中，
前述铂丝、金丝、银丝和碳纤维的直径为21.3μm。
36.前述的基于微电极的肿瘤标志物快速高灵敏检测方法，其特征在于，在步骤1中，前述铂丝、金丝、银丝和碳纤维通过石墨填充型导电胶与铜丝相连。
37.前述的基于微电极的肿瘤标志物快速高灵敏检测方法，其特征在于，在步骤1中，前述毛细玻璃管的上端通过环氧树脂胶封闭。
38.前述的基于微电极的肿瘤标志物快速高灵敏检测方法，其特征在于，在步骤2中，沉积溶液为氯金酸溶液，浓度为1μm，电流大小为5na，沉积时间为200s。
39.前述的基于微电极的肿瘤标志物快速高灵敏检测方法，其特征在于，在步骤4中，前述cea aptamer的孵育浓度为10
‑7m。
40.前述的基于微电极的肿瘤标志物快速高灵敏检测方法，其特征在于，在步骤4中，前述cea aptamer的孵育时间为1h。
41.前述的基于微电极的肿瘤标志物快速高灵敏检测方法，其特征在于，在步骤6中，前述临床血清样本的取用量为20μl。
42.前述的基于微电极的肿瘤标志物快速高灵敏检测方法，其特征在于，在步骤6中，前述临床血清样本与cea aptamer
‑
au
‑
裸电极的孵育时间为1h。
43.本发明的有益之处在于：
44.(1)本发明采用微电极作为电流型传感器，尺寸小、灵敏度高，可实现微小体积血清样品中肿瘤标志物的快速、高灵敏检测；
45.(2)本发明以aptamer作为特异性识别分子，具有合成简单、稳定性好、亲和力强、选择性高等优点；
46.(3)本发明基于方波伏安法进行电化学检测，与传统免疫学方法相比，具有成本低、操作简便、检测快速等优点。
附图说明
47.图1是本发明制作得到的铂微电极(裸电极)的结构示意图；
48.图2是本发明制作得到的铂微电极(裸电极)的表征循环伏安图；
49.图3是本发明制作得到的铂微电极(裸电极)、au
‑
铂微电极和cea aptamer
‑
au
‑
铂微电极的表征循环伏安图，其中，b为铂微电极(裸电极)，a为au
‑
铂微电极，c为cea aptamer
‑
au
‑
铂微电极；
50.图4是本发明制作得到的铂微电极(裸电极)和au
‑
铂微电极的表面微观形貌结构电镜图，其中，a为铂微电极(裸电极)的表面微观形貌结构电镜图，b为a的局部放大图，c为au
‑
铂微电极的表面微观形貌结构局部放大电镜图；
51.图5是au
‑
铂微电极与cea aptamer孵育浓度的优化结果图，其中，a为不同浓度cea aptamer与au
‑
铂微电极孵育后的方波伏安图，b为方波伏安法峰电流变化计算结果图；
52.图6是au
‑
铂微电极与cea aptamer孵育时间的优化结果图，其中，a为cea aptamer与au
‑
铂微电极孵育不同时间的方波伏安图，b为方波伏安法峰电流变化计算结果图；
53.图7是cea aptamer
‑
au
‑
铂微电极对cea的检测线性范围的测定结果图，其中，a为cea aptamer
‑
au
‑
铂微电极对不同浓度cea孵育后的方波伏安图，b为方波伏安法峰电流变化计算结果图；
54.图8是cea aptamer
‑
au
‑
铂微电极对血清中存在的几种蛋白质的选择性的测定结果图；
55.图9是本发明绘制得到的标准曲线。
56.图中附图标记的含义：1
‑
铜丝，2
‑
环氧树脂胶，3
‑
毛细玻璃管，4
‑
石墨填充型导电胶，5
‑
铂丝。
具体实施方式
57.以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
58.一、基于微电极检测肿瘤标志物cea
59.步骤1、制作铂微电极
60.参照图1，先将铂丝5的一端与铜丝1的一端通过石墨填充型导电胶4相连，然后铂丝5朝下、铜丝1朝上整体插入毛细玻璃管3内，并使铂丝5的末端与毛细玻璃管3的下端齐平、使铜丝1的末端超出毛细玻璃管3的上端，之后将毛细玻璃管3的上端(电极铜丝端)通过环氧树脂胶2封闭，室温晾干，通过火焰熔融法将毛细玻璃管3与铂丝5融合，最后用砂纸将毛细玻璃管3的下端(电极铂丝端)磨平，即制作得到电极。将制作完成的电极先用1m hno3清洗15min，然后依次用去离子水、无水乙醇各超声清洗5min，室温晾干，备用。
61.铂丝5的直径的大小不仅决定了电极是否能被称为微电极(只有直径小于100μm的电极才能被称为微电极)，还决定了电极的性能，在本具体实施例中，我们使用的铂丝5的直径为21.3μm。
62.通过循环伏安法对前面制作完成并且清洗干净的电极进行表征，检测溶液为4mm k4[fe(cn)6]溶液，背景电解质为1m kcl，扫描速率为50mv s
‑1，检测结果见图2。
[0063]
由图2可知，我们制作得到的电极呈现出微电极典型的阶梯样伏安图，表示电极性能良好，可用于下一步研究。也就是说，我们制作得到了性能良好的铂微电极(裸电极)。
[0064]
用来制作裸电极的材料需导电性能良好，反应活性呈惰性状态，直径小于100μm，所以除了可以用铂丝来制作裸电极外，还可以用金丝、银丝、碳纤维来制作裸电极，分别得到金微电极、银微电极、碳纤维微电极。
[0065]
步骤2、在铂微电极表面沉积金纳米颗粒
[0066]
通过恒电流法在铂微电极(裸电极)表面沉积金纳米颗粒，沉积溶液为氯金酸溶液，浓度为1μm，电流大小为5na，沉积时间为200s，得到au
‑
铂微电极。
[0067]
通过扫描电镜观察铂微电极(裸电极)和au
‑
铂微电极表面形貌结构的变化，观察结果见图4，其中，a为铂微电极(裸电极)表面微观形貌结构的电镜图，b为a的局部放大图，c为au
‑
铂微电极表面微观形貌结构的局部放大电镜图。
[0068]
由图4可知，铂微电极在沉积金纳米颗粒之前(即裸电极)表面光滑且与周围玻璃融合完好，在沉积金纳米颗粒之后(即au
‑
铂微电极)可见金纳米颗粒层均匀且致密。
[0069]
步骤3、合成cea aptamer并在末端修饰巯基
[0070]
cea(carcinoembryonic antigen，癌胚抗原)是存在于血清中的一种广谱肿瘤标志物，可以用来诊断结肠癌、直肠癌、乳腺癌、肺癌及其他恶性肿瘤。在此步，我们设计并合成了能够特异性捕获cea的cea aptamer。为了能够将合成的cea aptamer结合到au
‑
铂微电极表面，我们还对cea aptamer做了末端巯基修饰。
[0071]
最终我们合成的并经巯基修饰的cea aptamer的序列为：
[0072]
hs
‑
c6
‑
aaaaaaa taccagcttattcaatt。
[0073]
步骤4、将经巯基修饰的cea aptamer结合至au
‑
铂微电极表面
[0074]
利用巯基与金的直接结合，将经巯基修饰的cea aptamer结合至经金纳米颗粒修饰的铂微电极(au
‑
铂微电极)表面，结合过程大致如下：
[0075]
取经巯基修饰的cea aptamer，加入适量pbs溶液，95℃变性5min，然后迅速放置于冰上，待cea aptamer冷却至室温时，取20μl与经金纳米颗粒修饰的铂微电极(au
‑
铂微电极)室温孵育一段时间。
[0076]
在结合经巯基修饰的cea aptamer和au
‑
铂微电极之前，我们先对cea aptamer的孵育浓度以及孵育时间进行了优化，具体如下：
[0077]
1、cea aptamer的孵育浓度的优化
[0078]
取经巯基修饰的cea aptamer，加入适量pbs溶液至cea aptamer的终浓度分别为10
‑6m、10
‑7m、10
‑8m、10
‑9m，95℃变性5min，然后迅速放置于冰上，待cea aptamer冷却至室温时，取20μl与au
‑
铂微电极室温孵育1h。
[0079]
au
‑
铂微电极与cea aptamer的孵育浓度的优化结果见图5。
[0080]
由图5可知，cea aptamer的最优孵育浓度为10
‑7m。
[0081]
2、cea aptamer的孵育时间的优化
[0082]
取经巯基修饰的cea aptamer，加入适量pbs溶液至cea aptamer的终浓度为10
‑7m，95℃变性5min，然后迅速放置于冰上，待cea aptamer冷却至室温时，取20μl与au
‑
铂微电极室温孵育0.5h、1.0h、2.0h。
[0083]
au
‑
铂微电极与cea aptamer的孵育时间的优化结果见图6。
[0084]
由图6可知，cea aptamer的最优孵育时间为1h。
[0085]
将au
‑
铂微电极与cea aptamer在最优条件下孵育，具体如下：
[0086]
取经巯基修饰的cea aptamer，加入适量pbs溶液至cea aptamer的终浓度为10
‑7m，95℃变性5min，然后迅速放置于冰上，待cea aptamer冷却至室温时，取20μl与经金纳米颗粒修饰的铂微电极(au
‑
铂微电极)室温孵育1h，即得到cea aptamer
‑
au
‑
铂微电极。
[0087]
通过循环伏安法对铂微电极(裸电极)、au
‑
铂微电极和cea aptamer
‑
au
‑
铂微电极的电化学性能进行表征，检测溶液为5mm fe(cn)
64
‑
/fe(cn)
63
‑
(1：1)溶液，背景溶液为0.1m kcl，扫描速率为50mv s
‑1，检测结果见图3。
[0088]
由图3可知，铂微电极在沉积金纳米颗粒后(a)氧化还原电流明显升高，双电层电容明显升高，电极性能得到明显改善，但是结合cea aptamer之后(c)氧化还原电流明显下降，电极活性面积也明显下降，这证明：cea aptamer有效结合到了铂微电极表面，即我们成功制得了cea aptamer
‑
au
‑
铂微电极。
[0089]
步骤5、绘制标准曲线
[0090]
1、测定检测线性范围及检出限
[0091]
表面结合cea aptamer的铂微电极(cea aptamer
‑
au
‑
铂微电极)可特异性捕获靶分子cea(carcinoembryonic antigen，癌胚抗原)至电极表面，通过方波伏安法检测cea aptamer
‑
au
‑
铂微电极与靶分子cea结合前后的峰电流变化，可实现cea aptamer
‑
au
‑
铂微电极对cea的检测线性范围的测定及检出限的测定。
[0092]
测定cea aptamer
‑
au
‑
铂微电极对cea的检测线性范围及检出限的过程具体如下：
[0093]
将前面制得的cea aptamer
‑
au
‑
铂微电极与浓度分别为10
‑7g/ml、10
‑8g/ml、10
‑9g/ml、10
‑
10
g/ml、10
‑
11
g/ml、10
‑
12
g/ml的cea在室温孵育1h，然后利用方波伏安法测定峰电流变化，测定结果见图7。
[0094]
由图7可知，该cea aptamer
‑
au
‑
铂微电极在cea浓度范围为10
‑7‑
10
‑
11
g/ml内呈线性响应(s＝5.5na/dec，r2＝0.999)，检出限为7.7
×
10
‑
12
g/ml。
[0095]
由此可见，本发明制作得到的cea aptamer
‑
au
‑
铂微电极可用于临床样本中cea的检测。
[0096]
2、绘制标准曲线
[0097]
根据前面测定的cea的检测线性范围及检出限，绘制标准曲线。
[0098]
标准曲线的绘制过程具体如下：将前面制作得到的cea aptamer
‑
au
‑
铂微电极与浓度分别为10
‑9g/ml、10
‑8g/ml、10
‑7g/ml的cea在室温孵育1h，测定孵育前后的方波伏安曲线，然后计算峰电流变化结果，以cea的浓度为横坐标，以峰电流变化为纵坐标，绘制标准曲线。
[0099]
绘制得到的标准曲线见图9。
[0100]
步骤6、用cea aptamer
‑
au
‑
铂微电极检测临床样本
[0101]
取微小体积(20μl)临床血清样本，与cea aptamer
‑
au
‑
铂微电极室温孵育1h，通过方波伏安法检测cea aptamer
‑
au
‑
铂微电极捕获cea前后峰电流值的变化，根据前面绘制得到的标准曲线确定样本中cea的含量，设3组平行，取平均值。
[0102]
与此同时，用临床电化学发光法对同一临床血清样本的cea的含量进行检测。
[0103]
检测结果如下：
[0104] 本发明基于微电极的检测结果临床电化学发光法的检测结果样本17.43
±
1.37g/ml6.66g/ml样本22.26
±
1.58g/ml1.10g/ml样本35.86
±
1.43g/ml6.55g/ml样本40.96
±
0.34g/ml1.11g/ml样本530.2
±
1.98g/ml38.4g/ml
[0105]
通过对比检测结果可知：本发明提供的检测方法的检测结果与临床电化学发光法的检测结果基本一致。
[0106]
也就是说，本发明提供的检测方法可靠，可以应用到临床检测中。
[0107]
二、检测cea aptamer
‑
au
‑
铂微电极的选择性
[0108]
检测过程：将前面制作得到的cea aptamer
‑
au
‑
铂微电极分别与浓度为10
‑7g/ml的cea、10
‑7g/ml的bsa、10
‑7g/ml的afp、10
‑7g/ml胰酶在室温孵育1h，然后利用方波伏安法测定峰电流变化，检测结果见图8。
[0109]
由图8可知，cea aptamer
‑
au
‑
铂微电极对cea具有较高的特异性，对afp、bsa和胰酶的特异性较差。
[0110]
也就是说，cea aptamer
‑
au
‑
铂微电极对cea很灵敏，血液中存在的afp、bsa和胰酶不会干扰该cea aptamer
‑
au
‑
铂微电极对cea的测定。
[0111]
综上，本发明提供的基于微电极的肿瘤标志物检测方法可以快速并且高灵敏的检
测出血清样本中cea的含量。
[0112]
需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。