一种基于荧光成像系统高通量自动化计数大豆胞囊的方法

1.本发明涉及农业生物技术领域，特别涉及一种基于荧光成像系统高通量自动化计数大豆胞囊的方法。


背景技术：

2.大豆胞囊线虫病是大豆种植期常见的线虫病害，温度、湿度、土壤条件一旦适宜即可以引发这种病害的发生。这种病害可以导致大豆大面积减产，而且在中国东北和黄淮大豆主要产区都有发生，常年对大豆生产造成严重经济损失。而培育抗病品种是抵御大豆胞囊线虫病最经济、有效的方法，而筛选抗病资源是培育抗病品种的先决条件，但是，无论是抗性基因发掘、抗性品种筛选还是抗性机制研究都是以胞囊计数为基础。
3.大豆胞囊计数方法涉及到统计大豆根系上的胞囊数目，人们以雌性指数为指标，其成熟雌虫呈柠檬形，大小约为0.8mm
×
0.5mm，呈白色或黄白色，所鉴定的品种多为感病品种，室内鉴定每株根系上的胞囊数目在30
‑
800个不等，传统的大豆胞囊计数方法是待植株接种大豆胞囊线虫30天左右，胞囊处于显囊盛期时，完全取出大豆根部，进行人工计数，费时费力，尤其是连续计数过程中极易造成视觉疲劳，导致误差大，且该方法重复性差，不适用连续批量操作，因此，现亟需研究出新的大豆胞囊计数方法，以加速大豆胞囊线虫抗病品种培育进程。


技术实现要素：

4.为了解决上述问题，本发明提出一种基于荧光成像系统高通量自动化计数大豆胞囊的方法。
5.本发明的具体技术方案如下：
6.一种基于荧光成像系统高通量自动化计数大豆胞囊的方法，包括如下步骤：
7.①
选取感染大豆胞囊线虫病且胞囊处于显囊盛期的大豆植株；
8.②
利用冲洗装置对大豆植株的根系进行冲洗，冲洗后将大豆植株根系上的胞囊分离下来，并收集胞囊；
9.③
将收集的胞囊转移至培养皿中；
10.④
将盛有胞囊的培养皿置于荧光显微镜下照相；
11.⑤
通过计数软件分析步骤
④
中拍摄的照片，计数软件根据大豆胞囊线虫胞囊的形状、自发荧光强度对其进行计数。
12.所述的荧光显微镜的物镜为0.3
×
的物镜，数值孔径≥0.045；工作距离≥141mm。
13.所述的荧光显微镜的微成像分析系统配置有peltier制冷系统。
14.所述的荧光显微镜的光源采用100w汞灯光源。
15.步骤
②
中的冲洗装置包括移动架、筛网组和分级沉淀水箱；
16.所述的移动架为长方体框架，设有上层操作台和下层操作台，移动架底部的四角位置均固定有万向轮甲，在上层操作台的拐角位置设有竖向贯通的圆形冲洗孔，上层操作
台为中间低、四周高的斜坡形，且冲洗孔位于上层操作台的最低处，上层操作台的四周边沿设有向上凸出的挡水条甲，上层操作台的侧面固定有环形的悬挂铁圈，在冲洗孔的下方固定有与其同轴心的导流管，该导流管包括上端圆锥形的汇集管、下端圆筒形的连接管，连接管同轴固定在汇集管的小头端，汇集管的大头端固定在上层操作台的下表面，且导流管的最大内径不小于冲洗孔的直径，在连接管的外壁上同轴套装有圆筒形的延伸管，该延伸管的内径与连接管的外径相等，在延伸管的上端固定有若干根沿圆周方向均布的拉伸弹簧，每根拉伸弹簧的自由端均固定在汇集管的外壁上且使拉伸弹簧张紧，在延伸管下端的外壁上套装有圆筒状的橡胶软管，在下层操作台上设有竖向贯通的圆形沥水孔，下层操作台为中间低、四周高的斜坡形，且沥水孔位于下层操作台的最低处，下层操作台的四周边沿设有向上凸出的挡水条乙，该沥水孔与所述的冲洗孔同轴心，且沥水孔的直径不小于橡胶软管的外径，在沥水孔的下方固定有牛角形的引流管，该引流管的上端固定在下层操作台的下表面且与沥水孔对应；
17.所述的筛网组包括一级圆筛、二级圆筛和收集圆筛，所述的一级圆筛包括圆筒状的边框甲，覆盖在边框甲底部的一级筛网，在边框甲的下边沿设有一周环形的定位凸沿甲，所述的二级圆筛包括圆筒状的边框乙，边框乙的内径与定位凸沿甲的外径相等，一级圆筛放置在边框乙的上方且定位凸沿甲伸入边框乙的内部，在边框乙的底部覆盖有二级筛网，在边框乙的下边沿设有一周环形的定位凸沿乙，定位凸台乙的外径与冲洗孔的直径相等，二级圆筛放置在冲洗孔的上方且定位凸沿乙伸入冲洗孔内，所述的收集圆筛包括圆筒状的边框丙，覆盖在边框丙底部的三级筛网，在边框丙的下边沿设有一周环形的定位凸沿丙，定位凸台丙的外径与沥水孔的直径相等，收集圆筛放置在沥水孔的上方且定位凸沿丙伸入沥水孔内，橡胶软管伸入收集圆筛内；
18.所述分级沉淀水箱设置在移动架内部且位于下层操作台下方，包括箱体和过滤网，分级沉淀水箱底部的四角位置均固定有万向轮乙，该过滤网包括过滤网甲和过滤网乙，过滤网甲和过滤网乙平行固定在水箱内部、且将水箱内部分隔成前端、中间、后端三个沉淀区域，所述引流管伸入前端沉淀区域内，过滤网甲设置在前端、中间两个沉淀区域之间，过滤网乙设置在中间、后端两个沉淀区域之间，且过滤网甲的目数小于过滤网乙的目数，在箱体外部设有两个分别与前端、中间两个沉淀区域连通的排污管，每个排污管上均设有排污阀，在箱体外部设有与后端沉淀区域连通的排水管。
19.所述挡水条甲的高度不低于2cm，挡水条乙的高度不低于2cm，所述的一级圆筛的边框甲的内径为22cm，一级筛网的目数为20目。
20.所述的二级圆筛的边框乙的内径为22cm，二级筛网的目数为40目，所述的收集圆筛的边框丙的内径为7.5cm，收集筛网的目数为80目。分级沉淀水箱箱体的两端均铰接有把手。
21.步骤
②
中利用冲洗装置对步骤
①
中大豆植株的根系冲洗，通过冲洗将大豆植株根系上的胞囊分离下来并收集，该过程如下：
22.将步骤
①
中大豆植株的根系放置于一级圆筛的筛网上，用高压水枪对植株的根系进行冲洗，迫使根系上的胞囊与根系分离，冲洗掉的胞囊经过一级筛网和二级筛网的过滤，将冲洗掉的其他杂质过滤掉，胞囊穿过一级筛网和二级筛网最终通过导流管随水流进入收集圆筛内，经过收集筛网的过滤将比胞囊更小的其他杂质随水流冲洗掉，最终的污水进入
分级沉淀水箱内，进行沉淀过滤后直接排入下水道即可，将收集圆筛取出，胞囊被收集在收集筛网内。
23.本发明的有益技术效果：
24.本发明提供一种基于荧光成像系统高通量自动化计数大豆胞囊的方法，该方法具有以下优点：
25.①
本发明的荧光显微镜采用0.3
×
物镜，使得单次成像视野直径可达60mm，在胞囊较容易分散开的前提下，又能将培养皿全部放在视野下面，实现一次完成对单株大豆根系上着生胞囊(一般是0
‑
800个)的计数，对于着生胞囊数目较多(大于300个胞囊)的根系，更能凸显快捷优势；
26.②
本发明在计数时配套使用现有计数软件识别系统，根据胞囊形状和胞囊自发荧光强度，可以过滤掉冲洗胞囊过程中携带的根系和沙子等杂质，大大减少统计误差；通过对215个样品进行统计试验，结果表明该方法与人工计数差异不显著，可用于大豆胞囊线虫计数；
27.本方法4s可完成一次拍摄，可保证每人每天处理200个样本(人工计数，约60个样本/人/天，普通相机处理计数，约140个样本/人/天)，大大提高了计数效率；
28.③
本发明的荧光显微镜的显微成像分析系统配置有peltier制冷系统，可以在荧光图片采集过程中最大限度降低背景噪声，保证荧光信号的准确读取，提高后期计数分析的准确性；
29.④
本发明的荧光显微镜(是连续变焦显微镜，显微镜型号szx16，选配dp74型号的摄像头)的显微成像分析系统的静态图像传输速度高，4s可完成5760
×
3600(3
×
3)图像的一次拍摄，0.3s可完成1920
×
1200(1
×
1)图像的一次拍摄，可保证一天完成200株植株上大豆胞囊数目的统计，效率更高；
30.⑤
本发明的显微镜光源采用汞灯代替激光优势明显。首先，汞灯光源对湿度的要求远远低于激光对湿度的要求，耐用性上汞灯更好；其次，胞囊线虫本身自发荧光，且荧光比较强，从保护样本上考虑激光功率高，对样本信号淬灭相对较严重，而汞灯有利于保护样本，可防止荧光信号淬灭，保证收集信号的准确性；第三，激光灯价格昂贵，汞灯价格相对低廉，更容易在大豆胞囊线虫抗性鉴定领域推广应用；
31.本发明是借鉴前人研究成果，对统计系统加以改进，所配制的显微镜是利用汞灯光源结合胞囊线虫本身自发荧光对分散在含水的培养皿中的胞囊拍照，由于在一定光波范围内汞灯能有效避免根系、沙子等杂质对识别胞囊时的干扰，并且在水溶液中的胞囊较容易分散开，大大提高了利用计数软件对拍摄的大豆胞囊计数准确性。
32.⑥
本发明采用的冲洗装置，设置单独的移动架和操作台面，活动自由，便于长时间操作；下层操作台沥水孔的设置，大大缩小了胞囊聚集面积，使用方便，节约收集时间；移动架的内部设有分级沉淀水箱和过滤网，冲洗过程中的废水直接进入水箱内进行沉淀过滤，以免根系携带的泥沙和植株上的组织堵塞下水道；移动架和箱体底部均设有万向轮，移动方便省力。
33.本发明的荧光显微镜以及冲洗装置成本价相对较低，有利于大范围推广，可广泛应用于实践研究，在大豆胞囊线虫研究领域具有推广应用前景。
34.⑦
本发明统计针对的是感染大豆胞囊线虫且胞囊处于显囊盛期的胞囊，胞囊数目
是进行大豆胞囊线虫抗性鉴定的依据。
附图说明
35.图1为本发明采用荧光显微镜观察的工作原理图；
36.图2用普通照相机拍摄的图片与本发明在显微镜下拍摄的照片对比图；
37.图3为本发明采用的冲洗装置立体结构示意图；
38.图4为图3中a的放大示意图；
39.图5为分级沉淀水箱的立体结构示意图；
40.图6为筛网组的立体结构示意图；
41.图中：11.移动架、12.下层操作台、121.挡水条乙、122.沥水孔、13.上层操作台、131.挡水条甲、132.悬挂铁圈、133.冲洗孔、14.导流管、141.汇集管、142.连接管、15.延伸管、16.拉伸弹簧、17.橡胶软管、18.引流管、19.万向轮甲、21.箱体、211.把手、22.前端沉淀区域、23.中间沉淀区域、24.后端沉淀区域、25.过滤网甲、26.过滤网乙、27.万向轮乙、28.排污管、281.排污阀、29.排水管、31.一级圆筛、311.边框甲、312.一级筛网、313.定位凸沿甲、32.二级圆筛、321.边框乙、322.二级筛网、323.定位凸沿乙、33.收集圆筛、331.边框丙、332.收集筛网、333.定位凸沿丙。
具体实施方式
42.实施例一，参见图1
‑
图3，一种基于荧光成像系统高通量自动化计数大豆胞囊的方法，包括如下步骤：
43.①
选取感染大豆胞囊线虫病且胞囊处于显囊盛期(接种虫卵后约30天)的大豆植株；
44.②
利用冲洗装置对大豆植株的根系在高压水枪下冲洗，利用水压迫使大豆植株根系上的胞囊与根系分离，并收集胞囊；
45.③
将收集的大豆胞囊转移至培养皿中；
46.④
将盛有胞囊的培养皿放置于荧光显微镜下照相；
47.⑤
通过计数软件分析步骤
④
中拍摄的照片，计数软件根据胞囊形状、自发荧光强度对其进行计数。
48.所述荧光显微镜的物镜为0.3
×
物镜，数值孔径≥0.045；工作距离≥141mm。操作时：使单次成像视野直径达60mm，胞囊能够较容易分散开的前提下，调节显微镜的微调旋钮，在胞囊形状清晰时拍照，一次完成对单株大豆根系上着生胞囊数目的(一般是0
‑
800个)统计，对于着生胞囊数目较多(≥300个胞囊)的根系，更能凸显该系统快捷的优势。
49.所述的荧光显微镜的微成像分析系统配置有peltier制冷系统，可以在荧光图片采集过程中最大限度降低背景噪声，保证荧光信号的准确读取，提高后期计数分析的准确性。
50.所述的荧光显微镜的光源采用100w汞灯光源。
51.首先，汞灯光源对湿度的要求远远低于激光灯，耐用性上汞灯更好；其次，胞囊本身自发荧光，且荧光比较强，从保护样本考虑，激光功率高，对样本信号淬灭相对较严重，而汞灯有利于保护样本，可防止若荧光信号淬灭，保证收集信号的准确性。
52.使用时，汞灯通过gfp荧光激发滤色镜，使460nm
‑
480nm波段的光通过滤色片，而阻止其他波段的光波，该波段(460nm
‑
480nm)的光，能特异性激发胞囊发出荧光，根系杂质等无法发出荧光，从而把胞囊与其他物质分开。
53.所述的胞囊为处于显囊盛期的胞囊，统计这个时期的胞囊是进行大豆胞囊线虫抗性鉴定的依据。
54.观察显微镜时采用卤素灯，卤素灯是明场光源，色温恒定，光谱较宽，光线柔和，穿透力强，适合看植物标本，变倍体是除了物镜和目镜之外的放大元件，显微镜的放大倍数是由物镜、目镜、变倍体决定的，变倍体在合理范围内参数越大则整个显微镜的放大倍数越大，这台显微镜的变倍体参数是0.7
‑
11.5，是目前奥林巴斯体式显微镜中最大的变倍体。
55.荧光显微镜照相的操作过程：
56.将培养皿外壁擦干，置于显微镜镜头正下方，通过镜头观察使培养皿位于视野中央，用镊子拨动含胞囊的溶液以分散胞囊，避免其成团堆积，调整好软件参数，拍照并保存。
57.该荧光显微镜，可以把直径为60mm的培养皿完全放在视野之内，达到一次拍照即可把培养皿内的胞囊全部拍摄下来。较之前用照相机拍摄的图片相比，该显微镜拍摄图片中胞囊形状更清晰，软件容易识别，计数准确度相对较高。
58.用普通照相机拍摄的图片(图2a)与本发明用到的荧光显微镜下拍摄的照片(图2b)对比：图2a有较多的胞囊粘连现象，计数软件无法识别粘连的胞囊；另外，根系的亮度跟胞囊相似，也影响计数软件对胞囊的识别；图2b可以将直径为60mm的培养皿置于视野之下，在水中漂浮的胞囊分散度较好，胞囊荧光强度明显高于根系的荧光，即根系、沙子的荧光都最大程度被弱化了，在这种条件下：计数软件根据胞囊形状和胞囊自发荧光强度，可有效过滤掉冲洗胞囊过程中携带的根系和沙子等杂质，对计数软件识别胞囊的影响较小。
59.利用本发明基于荧光成像系统高通量自动化计数大豆胞囊的方法对胞囊计数，计数误差小。为了验证本发明的效果，发明人从2019年10月在河南省农业科学院大豆胞囊线虫鉴定温室开展的抗性鉴定材料中，采集了接种大豆胞囊线虫2号生理小种28天的鉴定材料，此时，胞囊处于显囊盛期，共215个样本(样本数n＝215)，分别通过人工计数、荧光成像系统高通量自动化计数对胞囊进行计数，并作统计分析。统计结果见表1、表2。
60.表1人工计数与本发明荧光显微镜计数统计结果比较表(a：人工计数，b：荧光显微镜计数)
[0061][0062][0063]
表2人工计数与本发明的荧光显微镜计数差异显著性分析(n＝215)
[0064][0065]
从表2可看出，利用本荧光成像系统高通量自动化计数与人工计数统计结果进行差异显著性分析，p＝0.6936(p≥0.05)，表明差异不显著，本发明方法可用于胞囊计数。
[0066]
实施例二，参见图3
‑
图6，实施例一中基于荧光成像系统高通量自动化计数大豆胞囊的方法，步骤
②
采用的冲洗装置，具体结构如下：
[0067]
包括移动架、筛网组和分级沉淀水箱；移动架为长方体框架，设有上层操作台和下层操作台，移动架底部的四角位置均固定有万向轮甲，在上层操作台的拐角位置设有竖向贯通的圆形冲洗孔，上层操作台为中间低、四周高的斜坡形，且冲洗孔位于上层操作台的最低处，上层操作台的四周边沿设有向上凸出的挡水条甲，挡水条甲的高度不低于2cm，上层操作台的侧面固定有环形的悬挂铁圈，在冲洗孔的下方固定有与其同轴心的导流管，该导流管包括上端圆锥形的汇集管、下端圆筒形的连接管，连接管同轴固定在汇集管的小头端上，汇集管的大头端固定在上层操作台的下表面，且导流管的最大内径不小于冲洗孔的直径，在连接管的外壁上同轴套装有圆筒形的延伸管，该延伸管的内径与连接管的外径相等，在延伸管的上端固定有若干根沿圆周方向均布的拉伸弹簧，每根拉伸弹簧的自由端均固定在汇集管的外壁上且使拉伸弹簧张紧，在延伸管下端的外壁上套装有圆筒状的橡胶软管，在下层操作台上设有竖向贯通的圆形沥水孔，下层操作台为中间低、四周高的斜坡形，且沥水孔位于下层操作台的最低处，下层操作台的四周边沿设有向上凸出的挡水条乙，挡水条乙的高度不低于2cm，该沥水孔与所述的冲洗孔同轴心，且沥水孔的直径不小于橡胶软管的外径，在沥水孔的下方固定有牛角形的引流管，该引流管的上端固定在下层操作台的下表面且与沥水孔对应；
[0068]
所述的筛网组包括一级圆筛、二级圆筛和收集圆筛，所述的一级圆筛包括圆筒状的边框甲，覆盖在边框甲底部的一级筛网，在边框甲的下边沿设有一周环形的定位凸沿甲，所述的一级圆筛的边框甲的内径为22cm，一级筛网的目数为20目，二级圆筛包括圆筒状的边框乙，边框乙的内径与定位凸沿甲的外径相等，一级圆筛放置在边框乙的上方且定位凸沿甲伸入边框乙的内部，在边框乙的底部覆盖有二级筛网，在边框乙的下边沿设有一周环形的定位凸沿乙，定位凸台乙的外径与冲洗孔的直径相等，二级圆筛放置在冲洗孔的上方且定位凸沿乙伸入冲洗孔内，所述二级圆筛的边框乙的内径为22cm，二级筛网的目数为40目，所述收集圆筛包括圆筒状的边框丙，覆盖在边框丙底部的三级筛网，在边框丙的下边沿设有一周环形的定位凸沿丙，定位凸台丙的外径与沥水孔的直径相等，收集圆筛放置在沥水孔的上方且定位凸沿丙伸入沥水孔内，所述的收集圆筛的边框丙的内径为7.5cm，收集筛网的目数为80目，橡胶软管伸入收集圆筛内；
[0069]
所述的分级沉淀水箱设置在移动架的内部且位于下层操作台的下方，其包括箱体
和过滤网，分级沉淀水箱底部的四角位置均固定有万向轮乙，分级沉淀水箱的箱体的两端均铰接有把手，该过滤网包括过滤网甲和过滤网乙，过滤网甲和过滤网乙平行固定在水箱的内部、且将水箱的内部分隔成前端、中间、后端三个沉淀区域，所述的引流管伸入前端沉淀区域内，过滤网甲设置在前端、中间两个沉淀区域之间，过滤网乙设置在中间、后端两个沉淀区域之间，且过滤网甲的目数小于过滤网乙的目数，在箱体外部设有两个分别与前端、中间两个沉淀区域连通的排污管，每个排污管上均设有排污阀，在箱体外部设有与后端沉淀区域连通的排水管。
[0070]
步骤
②
中利用冲洗装置对步骤
①
中大豆植株的根系进行冲洗，通过冲洗将大豆植株根系上的胞囊分离下来并收集，该过程如下：
[0071]
将步骤
①
中大豆植株的根系放置于一级圆筛的筛网上，用高压水枪对植株的根系冲洗，迫使根系上的胞囊与根系分离，冲洗掉的胞囊经过一级筛网和二级筛网的过滤，将冲洗掉的其他杂质过滤掉，胞囊穿过一级筛网和二级筛网最终通过导流管随水流进入收集圆筛内，经过收集筛网的过滤将比胞囊更小的其他杂质随水流冲洗掉，最终的污水进入分级沉淀水箱内，进行沉淀过滤后直接排入下水道即可，将收集圆筛取出，胞囊被收集在收集筛网内。
[0072]
冲洗装置设置单独的移动架和操作台面，工作人员冲洗胞囊时，可以以舒适的姿势站着或坐着操作，腿不受束缚、活动自由，便于长时间操作；操作台的边沿均设有挡水条，操作过程中，一定程度上防止将水喷溅到地面；下层操作台的沥水孔上放置直径为7.5cm的80目收集圆筛，替换了以往直径为22cm的收集圆筛，大大缩小了胞囊聚集的面积，再将收集的胞囊往50ml离心管里收集时，更加方便，大大节约收集时间；上层操作台和下层操作台均围绕冲洗孔和沥水孔设计呈中间低四周高，溅出来的水容易回流到圆孔处，不易造成台面积水现象；上层操作台的一侧面固定有悬挂铁圈，方便在临时不用高压喷枪时，随手挂在上面；移动架内部设有分级沉淀水箱，其内部设有过滤网，冲洗过程中的废水直接进入水箱内进行沉淀过滤，以免根系携带的泥沙和植株上的组织堵塞下水道；移动架和箱体底部上均设有万向轮，移动方便省力。