一种光谱分析方法和装置与流程

1.本发明属于体外检测技术领域，具体地涉及一种光谱分析方法和装置。


背景技术：

2.在免疫检测领域中，常常需要对各类抗原或抗体进行定性或定量检测。现有技术中，以“竞争抑制和双抗夹心”为基础衍生出多种免疫反应分析方法，如：放射免疫法、酶联免疫法、化学发光法、时间分辨荧光法、荧光免疫法和表面增强拉曼(sers)免疫分析法等，可用于确定病原微生物，对人体的特异性蛋白定量检测，从而对疾病进行辅助诊断或监测等等，用途非常广泛。其中sers方法因其超高的灵敏度、多指标同时检测和光信号稳定的特点而备受研究者的瞩目。
3.sers免疫分析的基本原理是：将针对目标分析物的捕获抗体(ab1)固定于固相拉曼增强基底(一般为金、银薄膜或金、银纳米微粒或金、银与无机材料组成的复合纳米微粒)，针对目标分析物的信号抗体(ab2)也固定在另一类似材料的纳米微粒上，同时该纳米微粒表面还固定有拉曼报告分子(ranman report，rr)。当阳性样本与ab1和ab2形成“三元夹心复合物”时，纳米微粒的近表面(一般小于5nm)和彼此聚集靠近的纳米微粒间的狭缝形成了“热点结构”，使rr的信号得到极大增强，目标分析物越多，形成的“三元夹心复合物”越多，相应地，“热点结构”和rr越多，拉曼信号越强，从而对目标分析物进行定量定性分析。
4.由于纳米微粒表面的rr极易受到“热点结构”的影响，而每次免疫反应所形成的“热点结构”数量和状态很难做到一致，所以最终测到的拉曼信号波动较大，从而严重影响了sers的定量检测性能。为解决sers定量免疫检测的难题，人们做了很多努力和尝试，并取得了一定进展。其中核壳结构的纳米微粒较为有效，大致的做法是：合成金核银壳(au@ag)纳米微粒，并将rr分子固定于核壳之间，使其处于稳定的“热点结构”中(au-rr@ag)，通过控制ag壳的厚度，可使rr的拉曼信号免受纳米微粒以外环境的的影响，因此au-rr@ag在特定波数呈现很强的且稳定的特征拉曼信号；之后再将信号抗体(ab2)固定于au-rr@ag的表面，形成au-rr@ag-ab2；同时，将ab1固定于磁微粒(m)表面(m-ab1)，与样本(s)构建sers磁免疫均相反应体系。若为阳性样本则形成“m-ab1
·s·
ab2-ag@rr-au”复合物，施加磁场后，所有的m-ab1包括“m-ab1
·s·
ab2-ag@rr-au”都被富集，反复洗涤后，检测聚集的复合物上rr的拉曼信号。因形成的复合物被聚集，测量的重复性较差，无法满足定量检测的要求
5.然而，现有的放射免疫法、酶联免疫法、化学发光法、时间分辨荧光法等只能单指标检测，即：取一次样本与相应的试剂，反应后只能报告一个目标物的浓度结果，效率较低，无法实现和满足“取一次样本与相应的试剂，反应后报告多个目标物浓度的结果”的迫切需求。
6.因此，本领域需要对sers磁免疫分析技术进行持续改进，既要保持sers检测的高灵敏度又要确保优良的重复性，同时满足多指标定量联合检测的需求。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种sers磁免疫分析方法，提高sers磁免疫分析的重复性和稳定性，从而能够准确测定血清、血浆、全血或缓冲液样品中的待测物质，且同时满足多指标(待测物)定量联合检测的需求，提高检测效率。
8.本发明的另一个目的在于提供了一种检测待测物的光谱分析系统。
9.本发明第一方面，提供一种用于拉曼光谱分析的拉曼微球组合，所述的组合包括第一拉曼微球、第二拉曼微球、第三拉曼微球、第四拉曼微球和第五拉曼微球中的2种或2种以上；
10.所述的第一拉曼微球具有式i-1结构的微粒：
11.y1-x1-y3
ꢀꢀ
(i-1)；
12.所述的第二拉曼微球具有式i-2结构的微粒：
13.y1-x2-y3
ꢀꢀ
(i-2)；
14.所述的第三拉曼微球具有式i-3结构的微粒：
15.y1-x3-y3
ꢀꢀ
(i-3)；
16.所述的第四拉曼微球具有式i-4结构的微粒：
17.y1-x4-y3
ꢀꢀ
(i-4)；
18.所述的第五拉曼微球具有式i-5结构的微粒：
19.y1-x5-y3
ꢀꢀ
(i-5)；
20.各式中，
21.y1为贵金属微粒；
22.x1、x2、x3、x4、x5各自独立地为不同的拉曼信号分子；和
23.y3为包裹涂层；
24.所述的第一拉曼微球为拉曼光谱在2078
±
10cm-1
(较佳地2078
±
5cm-1
，更佳地2078
±
2cm-1
，更佳地2078
±
1cm-1
，更佳地2078cm-1
)处具有特征峰的峰值；
25.所述的第二拉曼微球为拉曼光谱在1629
±
10cm-1
(较佳地1629
±
5cm-1
，更佳地1629
±
2cm-1
，更佳地1629
±
1cm-1
，更佳地1629cm-1
)；
26.所述的第三拉曼微球为拉曼光谱在1072
±
10cm-1
(较佳地1072
±
5cm-1
，更佳地1072
±
2cm-1
，更佳地1072
±
1cm-1
，更佳地1072cm-1
)；
27.所述第四拉曼微球为拉曼光谱在729
±
10cm-1
(较佳地729
±
5cm-1
，更佳地729
±
2cm-1
，更佳地729
±
1cm-1
，更佳地729cm-1
)；
28.所述的第五拉曼微球为拉曼光谱在538
±
10cm-1
(较佳地538
±
5cm-1
，更佳地538
±
2cm-1
，更佳地538
±
1cm-1
，更佳地538cm-1
)。
29.在另一优选例中，所述的第一拉曼微球的拉曼光谱图如图2所示。
30.在另一优选例中，所述的第二拉曼微球的拉曼光谱图如图3所示。
31.在另一优选例中，所述的第三拉曼微球的拉曼光谱图如图4所示。
32.在另一优选例中，所述的第四拉曼微球的拉曼光谱图如图5所示。
33.在另一优选例中，所述的第五拉曼微球的拉曼光谱图如图6所示。
34.在另一优选例中，所述的贵金属微粒选自下组：au微粒、ag微粒，或其组合。
35.在另一优选例中，所述的贵金属微粒选自下组：胶体金、胶体银、或其组合。
36.在另一优选例中，
“‑”
为连接键。
37.在另一优选例中，所述的连接键包括物理和/或化学连接键。
38.在另一优选例中，所述的包裹涂层为ag涂层、au涂层、或其组合。
39.在另一优选例中，所述的拉曼信号分子与所述贵金属微粒连接。
40.在另一优选例中，所述的拉曼信号分子与所述贵金属微粒的表面连接。
41.在另一优选例中，所述的包裹涂层将连接有拉曼信号分子的贵金属微粒包裹。
42.在另一优选例中，所述的组合包括第一拉曼微球、第二拉曼微球、第三拉曼微球、第四拉曼微球和第五拉曼微球5中的2种。
43.在另一优选例中，所述的组合包括第一拉曼微球、第二拉曼微球、第三拉曼微球、第四拉曼微球和第五拉曼微球5中的3种。
44.在另一优选例中，所述的组合包括第一拉曼微球、第二拉曼微球、第三拉曼微球、第四拉曼微球和第五拉曼微球5中的4种。
45.在另一优选例中，所述的组合包括第一拉曼微球、第二拉曼微球、第三拉曼微球、第四拉曼微球和第五拉曼微球5中的5种。
46.在另一优选例中，在所述的组合中，各个拉曼微球是相互独立地或合并在一起的。
47.本发明第二方面，提供一种如本发明第一方面所述组合的用途，用于拉曼光谱分析方法。
48.在另一优选例中，所述的方法为定量和/或定性方法。
49.在另一优选例中，所述的方法为体外方法或辅助方法。
50.在另一优选例中，在所述拉曼光谱分析方法中，各个拉曼微球分别对应不同的待检测的待测物。
51.在另一优选例中，在所述拉曼光谱分析方法中，拉曼微球的种类与待检测的待测物的种类相同。
52.本发明第三方面，提供一种拉曼光谱分析方法，所述的方法包括步骤：
53.(a)提供一待测样品，所述待测样品含有n种待测物；
54.(b)在一容器内，将所述待测样品与n种捕获颗粒和n种检测颗粒进行混合，从而形成含n种“捕获颗粒-待测物-检测颗粒”的复合物的第一混合物；
55.其中，所述的捕获颗粒包括负载有捕获剂的磁性颗粒；所述的n种检测颗粒包括第一检测颗粒、第二检测颗粒、第三检测颗粒、第四检测颗粒和第五检测颗粒中的2种或2种以上；
56.所述的第一检测颗粒包括负载捕获剂的第一拉曼微球；
57.所述的第二检测颗粒包括负载捕获剂的第二拉曼微球；
58.所述的第三检测颗粒包括负载捕获剂的第三拉曼微球；
59.所述的第四检测颗粒包括负载捕获剂的第四拉曼微球；
60.所述的第五检测颗粒包括负载捕获剂的第五拉曼微球；
61.所述的第一拉曼微球、第二拉曼微球、第三拉曼微球、第四拉曼微球和第五拉曼微球如本发明第一方面所述；
62.所述的n种捕获颗粒中的捕获剂分别特异性地针对所述n种待测物，所述的n种检测颗粒中的捕获剂分别特异性地针对所述n种待测物，形成n种“捕获颗粒的捕获剂-待测
物-检测颗粒的捕获剂”的三元复合物；
63.(c)对所述n种“捕获颗粒-待测物-检测颗粒”的复合物进行清洗后，将n种“捕获颗粒-待测物-检测颗粒”的复合物分散成混悬液后，使混悬液处于持续运动状态下进行拉曼光谱信号的测定。
64.在另一优选例中，所述的n种捕获颗粒中的捕获剂各自不同。
65.在另一优选例中，所述的n种检测颗粒中的捕获剂各自不同。
66.在另一优选例中，n为2、3、4或5。
67.在另一优选例中，各个捕获颗粒不同。
68.在另一优选例中，各个检测颗粒不同。
69.在另一优选例中，所述的n种捕获颗粒中的捕获剂分别特异性地针对不同的待测物。
70.在另一优选例中，所述的n种检测颗粒中的捕获剂分别特异性地针对不同待测物。
71.在另一优选例中，所述的光谱信号的测定包括：
72.将激发光从所述容器的底部射入，并测量处于持续运动状态下的n种“捕获颗粒-待测物-检测颗粒”的复合物经照射后产生的光谱信号。
73.在另一优选例中，所述待检测的待测物选自下组：降钙素原、白细胞介素6、免疫球蛋白，或其组合。
74.在另一优选例中，所述免疫球蛋白选自下组：免疫球蛋白1(igg1)、免疫球蛋白2(igg2)、免疫球蛋白3(igg3)、免疫球蛋白4(igg4)，或其组合。
75.在另一优选例中，所述的光谱分析方法为表面增强拉曼光谱分析方法。
76.在另一优选例中，所述的光谱信号为拉曼光谱信号。
77.在另一优选例中，所述的混悬液中降钙素原的浓度为0-100ng/ml，较佳地0-10ng/ml。
78.在另一优选例中，所述的混悬液中白细胞介素6的浓度为0-10ng/ml，较佳地0-1ng/ml。
79.在另一优选例中，所述的混悬液中，igg1的浓度为0-50000ng/ml，较佳地0-48960ng/ml。
80.在另一优选例中，所述的混悬液中，igg2的浓度为0-40000ng/ml，较佳地0-35520ng/ml。
81.在另一优选例中，所述的混悬液中，igg3的浓度为0-3000ng/ml，较佳地0-2838ng/ml。
82.在另一优选例中，所述的混悬液中，igg4的浓度为0-3000ng/ml，较佳地0-2470ng/ml。
83.在另一优选例中，所述待测样品为血清、血浆、全血或缓冲液。
84.在另一优选例中，所述的步骤(c)中，所述清洗使用的清洗液为pbs缓冲液。
85.在另一优选例中，所述的运动包括流动。
86.在另一优选例中，所述的流动包括涡流。
87.在另一选例中，所述的运动包括涡流。
88.在另一优选例中，所述清洗包括以下步骤：
89.将所述n种“捕获颗粒-待测物-检测颗粒”的复合物聚集在容器的侧壁上，然后用清洗液对所述n种“捕获颗粒-待测物-检测颗粒”的复合物进行清洗。
90.在另一优选例中，在磁场作用下将所述n种“捕获颗粒-待测物-检测颗粒”的复合物聚集在容器的侧壁上。
91.在另一优选例中，所述的磁场是由磁性物质产生。
92.在另一优选例中，所述的磁性物质为磁铁。
93.在另一优选例中，所述的清洗液为pbs缓冲液。
94.在另一优选例中，所述的清洗的次数为1-6次。
95.在另一优选例中，所述的清洗为1、2、3、4、5或6次。
96.在另一优选例中，在清洗结束后后，将容器中清洗后的清洗液除去。
97.另一优选例中，所述的清洗结束后，移除磁性物质。
98.另一优选例中，所述的清洗结束后，移除磁性物质，使清洗后的“捕获颗粒-待测物-检测颗粒”的复合物位于容器的底部。
99.在另一优选例中，用缓冲液(如pbs缓冲液)将n种“捕获颗粒-待测物-检测颗粒”的复合物分散成混悬液。
100.在另一优选例中，所述的缓冲液包括pbs缓冲液。
101.在另一优选例中，所述的使混悬液处于持续运动状态包括以下步骤：
102.对混悬液进行振荡，从而混悬液处于持续运动状态。
103.在另一优选例中，所述的使混悬液处于持续运动状态包括以下步骤：
104.吸取容器中的适量混悬液后，将吸取的适量混悬液打回容器中，再吸取容器中的适量混悬液后，再将吸取的适量混悬液打回容器中，反复进行如上操作，使混悬液处于持续运动状态。
105.在另一优选例中，所述的适量混悬液为混悬液量(如体积量)的5-50％，较佳的5-50％，更佳地5-50％，更佳地5-40％，更佳地10-30％，更佳地15-25％。
106.在另一优选例中，吸取是用移液枪进行吸取。
107.在另一优选例中，所述的容器的材料选自下组：塑料、玻璃、陶瓷，或其组合。
108.在另一优选例中，所述的容器的底部材料选自下组：塑料、玻璃、陶瓷，或其组合。
109.在另一优选例中，所述的底部材料选自下组：聚合物、树脂，或其组合。
110.在另一优选例中，所述的聚合物包括均聚物或共聚物。
111.在另一优选例中，所述的底部材料选自下组：聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚碳酸酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚乙烯、聚丙烯、密胺，或其组合。
112.在另一优选例中，所述容器是透明的或半透明的。
113.在另一优选例中，所述容器的底部是透明的或半透明的。
114.在另一优选例中，所述容器的底部的厚度为0.2-1.0mm。
115.在另一优选例中，所述的激发光从所述容器的底部的下方射入。
116.在另一优选例中，所述的激发光从所述容器的底部中央的正下方射入。
117.在另一优选例中，所述的激发光相对于容器的底部平面的法线的入射角α为0－70度，较佳地0－60度，更佳地0－45度。(即入射角α为0
°
时，所述激发光是垂直入射于容器的底部)。
118.在另一优选例中，α为0度。
119.在另一优选例中，所述的激发光为激光。
120.在另一优选例中，所述的激发光的波长为300-600，较佳地600-900nm,更佳地900-1200nm。
121.在另一优选例中，所述的拉曼光谱信号包括拉曼光谱中第一拉曼微球、第二拉曼微球、第三拉曼微球、第四拉曼微球和第五拉曼微球的特征峰的峰值。
122.在另一优选例中，所述的拉曼光谱信号包括在2078
±
10cm-1
(较佳地2078
±
5cm-1
，更佳地2078
±
2cm-1
，更佳地2078
±
1cm-1
，更佳地2078cm-1
)处具有特征峰的峰值。
123.在另一优选例中，所述的拉曼光谱信号包括在1629
±
10cm-1
(较佳地1629
±
5cm-1
，更佳地1629
±
2cm-1
，更佳地1629
±
1cm-1
，更佳地1629cm-1
)。
124.在另一优选例中，所述的拉曼光谱信号包括在1072
±
10cm-1
(较佳地1072
±
5cm-1
，更佳地1072
±
2cm-1
，更佳地1072
±
1cm-1
，更佳地1072cm-1
)。
125.在另一优选例中，所述的拉曼光谱信号包括在729
±
10cm-1
(较佳地729
±
5cm-1
，更佳地729
±
2cm-1
，更佳地729
±
1cm-1
，更佳地729cm-1
)。
126.在另一优选例中，所述的拉曼光谱信号包括在538
±
10cm-1
(较佳地538
±
5cm-1
，更佳地538
±
2cm-1
，更佳地538
±
1cm-1
，更佳地538cm-1
)。
127.在另一优选例中，所述的捕获颗粒是具有式i结构的负载有捕获剂磁性颗粒：
128.z1-z2-z3
ꢀꢀ(i)129.式中，
130.z1为磁性颗粒；
131.z2为第一连接元件；和
132.z3为捕获剂。
133.在另一优选例中，所述的第一连接元件选自下组：含有巯基、羟基、醛基和/或羧基的连接分子、多肽连接元件、或其组合。
134.在另一优选例中，所述的多肽连接元件包括“亲和素-生物素”连接臂。
135.在另一优选例中，所述的亲和素为链霉亲合素。
136.在另一优选例中，所述的捕获剂为抗体。
137.在另一优选例中，所述的第一检测颗粒具有式ii-1结构的微粒：
138.y1-x1-y3-y4-y5
ꢀꢀ
(ii-1)
139.式中，
140.y1、x1和y3如本发明第一方面所述；
141.y4为第二连接元件；
142.y5为捕获剂。
143.在另一优选例中，所述的第二检测颗粒具有式ii-2结构的微粒：
144.y1-x2-y3-y4-y5
ꢀꢀ
(ii-2)
145.式中，
146.y1、x2和y3如本发明第一方面所述；
147.y4为第二连接元件；
148.y5为捕获剂。
149.在另一优选例中，所述的第三检测颗粒具有式ii-3结构的微粒：
150.y1-x3-y3-y4-y5
ꢀꢀ
(ii-3)
151.式中，
152.y1、x3和y3如本发明第一方面所述；
153.y4为第二连接元件；
154.y5为捕获剂。
155.在另一优选例中，所述的第四检测颗粒具有式ii-4结构的微粒：
156.y1-x4-y3-y4-y5
ꢀꢀ
(ii-4)。
157.式中，
158.y1、x4和y3如本发明第一方面所述；
159.y4为第二连接元件；
160.y5为捕获剂。
161.在另一优选例中，所述的第五检测颗粒具有式ii-5结构的微粒：
162.y1-x5-y3-y4-y5
ꢀꢀ
(ii-5)
163.式中，
164.y1、x5和y3如本发明第一方面所述；
165.y4为第二连接元件；
166.y5为捕获剂。
167.在另一优选例中，所述的第二连接元件选自下组：含有巯基、羟基、醛基和/或羧基的连接分子、多肽连接元件、或其组合。
168.在另一优选例中，所述的多肽连接元件包括“亲和素-生物素”连接臂。
169.在另一优选例中，所述的捕获剂为抗体。
170.在另一优选例中，所述的拉曼光谱信号为拉曼光谱中特征峰的峰值。
171.在另一优选例中，所述的容器底部材料为聚苯乙烯。
172.在另一优选例中，所述方法是离体方法。
173.在另一优选例中，所述方法是非诊断性的和非治疗性的。
174.本发明第四方面，提供一种光谱分析系统，所述系统包括：
175.(i)激发光发射源，所述的激发光发射源发射激发光，所述的激发光从一容器的底部的下方射入，所述的容器中含有持续运动的如本发明第三方面所述的n种“捕获颗粒-待测物-检测颗粒”的复合物；
176.(ii)光谱信号采集单元，所述的光谱信号采集单元用于采集所述“捕获颗粒-待测物-检测颗粒”的复合物经照射后产生的光谱信号；
177.(iii)输出单元。
178.在另一优选例中，所述的光谱分析系统还包括：
179.(iv)分散单元，所述的分散单元用于将所述容器中的所述n种“捕获颗粒-待测物-检测颗粒”的复合物进行持续运动。
180.在另一优选例中，所述的分散单元包括搅拌器、振荡器，或其组合。
181.在另一优选例中，所述的搅拌器包括搅拌头(如搅拌刀)。
182.在另一优选例中，所述的搅拌头(如搅拌刀)对容器进行搅拌，使得所述容器中含
有的“捕获颗粒-待测物-检测颗粒”的复合物进行持续运动。
183.在另一优选例中，所述的振荡器包括摇床。
184.在另一优选例中，所述的摇床对容器进行振荡，使得所述容器中含有的“捕获颗粒-待测物-检测颗粒”的复合物进行持续运动。
185.在另一优选例中，所述的光谱分析系统还包括一检测容器，所述检测容器用于盛装待测样品和/或所述的n种“捕获颗粒-待测物-检测颗粒”的复合物。
186.在另一优选例中，所述的待测样品和/或所述的n种“捕获颗粒-待测物-检测颗粒”的复合物为液态。
187.在另一优选例中，所述的光谱分析系统是用于本发明第二方面中所述方法的光谱分析方法。
188.在另一优选例中，所述的光谱分析系统为表面增强拉曼光谱分析系统。
189.在另一优选例中，所述的检测颗粒为拉曼检测颗粒。
190.在另一优选例中，所述的光谱信号为拉曼光谱信号。
191.应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
192.附图
193.图1显示了本发明一个优选例中的光谱分析系统。
194.图2为编号为006的au-rr@ag的拉曼光谱图。
195.图3为编号为013的au-rr@ag的拉曼光谱图。
196.图4为编号为014的au-rr@ag的拉曼光谱图。
197.图5为编号为026的au-rr@ag的拉曼光谱图。
198.图6为编号为041的au-rr@ag的拉曼光谱图。
具体实施方式
199.本发明人通过大量的试验比较研究，建立了一种sers磁免疫分析方法，在所述的方法中，意外的发现当待测物质的sa-m复合物在持续运动状态下，测定的拉曼信号强度波动最小，cv％小于5％，表明sa-m复合物在持续运动状态下sers测定的重复性和稳定性最强，从而能够准确测定待测物质的含量，满足定量免疫检测的要求。
200.在本发明的实验中，采用链霉亲合素(streptavdin，sa)标记的磁微粒(sa-m)作为固相载体。本发明的ab2是标记在au-rr@ag核壳型纳米材料上，即：“au-rr@ag-ab2”。当样本、生物素标记的捕获抗体biotin-ab1和“au-rr@ag-ab2”以适当的比例加入反应容器反应一定时间后，再向反应容器中加适量的sa-m，于反应容器外的侧壁上施加磁场，使所有sa-m聚集，其中包括免疫反应生成的sa-m复合物，多次洗涤聚集的sa-m及sa-m复合物后撤去磁场，向反应容器加入适量缓冲液，以适当的方式将sa-m及sa-m复合物分散后形成混悬液，在保持反应容器中的混悬液处于持续运动状态时，用拉曼光谱仪测量信号强度。
201.本发明的实验表明，测量时“sa-m复合物”的分散状态对测值的重复性和稳定性具有重要影响，检测静置的sa-m复合物混悬液和反复聚集的sa-m复合物的拉曼信号波动大，重复性和稳定性差，无法满足定量免疫检测的要求；而“sa-m复合物”混悬液处于持续运动
时检测，拉曼信号波动最小，重复性和稳定性最强，能够完全满足定量免疫检测的要求。
202.此外，本发明意外的发现拉曼信号分子的组合，所述的组合包括第一拉曼微球、第二拉曼微球、第三拉曼微球、第四拉曼微球和第五拉曼微球中的2种或2种以上。在拉曼检测中，拉曼信号分子的组合形成的n种“捕获颗粒-待测物-检测颗粒”能够同时实现对多种待测物质的同时准确测定，从而提高检测效率，具体地，本发明提供了一种sers均相磁免疫分析方法，将洗涤过的聚集的“m-ab1
·s·
ab2-ag@rr-au”复合物分散形成均匀的悬浮液，测量悬浮液的rr信号。反应体系中可同时有5种ag@rr-au，每种都有各自的特征拉曼峰，可同时实现多种待测物的联合检测，例如，取这5种ag@rr-au的任何2种可同时实现2种目标物的联合检测，取这5种ag@rr-au的任何3种可同时实现3种目标物的联合检测，取这5种ag@rr-au的任何4种可同时实现4种目标物的联合检测，取这5种ag@rr-au的5种可同时实现5种目标物的联合检测，既保持sers检测的高灵敏度又有较好的重复性，可满足临床多指标定量联合检测的要求。
203.术语
204.如本文所用，术语“包含”、“包括”、“含有”可互换使用，不仅包括封闭式定义，还包括半封闭、和开放式的定义。换言之，所述术语包括了“由
……
构成”、“基本上由
……
构成”。
205.如本文所用，“拉曼”、“表面增强拉曼”和“sers”可互换使用。
206.拉曼微球
207.本发明提供一种用于拉曼光谱分析的拉曼微球组合，所述的组合包括第一拉曼微球、第二拉曼微球、第三拉曼微球、第四拉曼微球和第五拉曼微球中的2种或2种以上。
208.代表性地，所述的第一拉曼微球具有式i-1结构的微粒：
209.y1-x1-y3
ꢀꢀ
(i-1)。
210.代表性地，所述的第二拉曼微球具有式i-2结构的微粒：
211.y1-x2-y3
ꢀꢀ
(i-2)。
212.代表性地，所述的第三拉曼微球具有式i-3结构的微粒：
213.y1-x3-y3
ꢀꢀ
(i-3)。
214.代表性地，所述的第四拉曼微球具有式i-4结构的微粒：
215.y1-x4-y3
ꢀꢀ
(i-4)。
216.代表性地，所述的第五拉曼微球具有式i-5结构的微粒：
217.y1-x5-y3
ꢀꢀ
(i-5)。
218.优选地，在本发明所述的各个拉曼微球中，y1为贵金属微粒；x1、x2、x3、x4、x5各自独立地为不同的拉曼信号分子；和y3为包裹涂层。
219.在本发明的一个优选例中，所述的第一拉曼微球为拉曼光谱在2078
±
10cm-1
(较佳地2078
±
5cm-1
，更佳地2078
±
2cm-1
，更佳地2078
±
1cm-1
，更佳地2078cm-1
)处具有特征峰的峰值。
220.在本发明的一个优选例中，所述的第二拉曼微球为拉曼光谱在1629
±
10cm-1
(较佳地1629
±
5cm-1
，更佳地1629
±
2cm-1
，更佳地1629
±
1cm-1
，更佳地1629cm-1
)。
221.在本发明的一个优选例中，所述的第三拉曼微球为拉曼光谱在1072
±
10cm-1
(较佳地1072
±
5cm-1
，更佳地1072
±
2cm-1
，更佳地1072
±
1cm-1
，更佳地1072cm-1
)。
222.在本发明的一个优选例中，所述第四拉曼微球为拉曼光谱在729
±
10cm-1
(较佳地
729
±
5cm-1
，更佳地729
±
2cm-1
，更佳地729
±
1cm-1
，更佳地729cm-1
)。
223.在本发明的一个优选例中，所述的第五拉曼微球为拉曼光谱在538
±
10cm-1
(较佳地538
±
5cm-1
，更佳地538
±
2cm-1
，更佳地538
±
1cm-1
，更佳地538cm-1
)。
224.代表性地，所述的第一拉曼微球的拉曼光谱图如图2所示。
225.代表性地，所述的第二拉曼微球的拉曼光谱图如图3所示。
226.代表性地，所述的第三拉曼微球的拉曼光谱图如图4所示。
227.代表性地，所述的第四拉曼微球的拉曼光谱图如图5所示。
228.代表性地，所述的第五拉曼微球的拉曼光谱图如图6所示。
229.在本发明的一个优选例中，所述的贵金属微粒选自下组：au微粒、ag微粒，或其组合。
230.在另一优选例中，所述的贵金属微粒选自下组：胶体金、胶体银、或其组合。
231.在另一优选例中，
“‑”
为连接键。
232.在另一优选例中，所述的连接键包括物理和/或化学连接键。
233.在本发明的一个优选例中，所述的包裹涂层为ag涂层、au涂层、或其组合。
234.在另一优选例中，所述的拉曼信号分子与所述贵金属微粒连接。
235.在另一优选例中，所述的拉曼信号分子与所述贵金属微粒的表面连接。
236.在另一优选例中，所述的包裹涂层将连接有拉曼信号分子的贵金属微粒包裹。
237.拉曼光谱分析方法
238.本发明还提供一种拉曼光谱分析方法，所述的方法包括步骤：
239.(a)提供一待测样品，所述待测样品含有n种待测物；
240.(b)在一容器内，将所述待测样品与n种捕获颗粒和n种检测颗粒进行混合，从而形成含n种“捕获颗粒-待测物-检测颗粒”的复合物的第一混合物；
241.其中，所述的捕获颗粒包括负载有捕获剂的磁性颗粒；所述的n种检测颗粒包括第一检测颗粒、第二检测颗粒、第三检测颗粒、第四检测颗粒和第五检测颗粒中的2种或2种以上；
242.所述的第一检测颗粒包括负载捕获剂的第一拉曼微球；
243.所述的第二检测颗粒包括负载捕获剂的第二拉曼微球；
244.所述的第三检测颗粒包括负载捕获剂的第三拉曼微球；
245.所述的第四检测颗粒包括负载捕获剂的第四拉曼微球；
246.所述的第五检测颗粒包括负载捕获剂的第五拉曼微球；
247.所述的第一拉曼微球、第二拉曼微球、第三拉曼微球、第四拉曼微球和第五拉曼微球本发明所述；
248.所述的n种捕获颗粒中的捕获剂分别特异性地针对所述n种待测物，所述的n种检测颗粒中的捕获剂分别特异性地针对所述n种待测物，形成n种“捕获颗粒的捕获剂-待测物-检测颗粒的捕获剂”的三元复合物；
249.(c)对所述n种“捕获颗粒-待测物-检测颗粒”的复合物进行清洗后，将n种“捕获颗粒-待测物-检测颗粒”的复合物分散成混悬液后，使混悬液处于持续运动状态下进行拉曼光谱信号的测定。
250.在本发明的一个优选例中，所述的n种捕获颗粒中的捕获剂各自不同。
251.在本发明的一个优选例中，所述的n种检测颗粒中的捕获剂各自不同。
252.在本发明的一个优选例中，n为2、3、4或5。
253.在本发明的一个优选例中，所述的光谱信号的测定包括：
254.将激发光从所述容器的底部射入，并测量处于持续运动状态下的n种“捕获颗粒-待测物-检测颗粒”的复合物经照射后产生的光谱信号。
255.在另一优选例中，所述待检测的待测物选自下组：降钙素原、白细胞介素6、免疫球蛋白，或其组合。
256.在另一优选例中，所述免疫球蛋白选自下组：免疫球蛋白1(igg1)、免疫球蛋白2(igg2)、免疫球蛋白3(igg3)、免疫球蛋白4(igg4)，或其组合。
257.在另一优选例中，所述的光谱分析方法为表面增强拉曼光谱分析方法。
258.在另一优选例中，所述的光谱信号为拉曼光谱信号。
259.在本发明的一个优选例中，所述待测样品为血清、血浆、全血或缓冲液。
260.在本发明的一个优选例中，所述的步骤(c)中，所述清洗使用的清洗液为pbs缓冲液。
261.在另一优选例中，所述的运动包括流动。
262.在另一优选例中，所述的流动包括涡流。
263.在另一选例中，所述的运动包括涡流。
264.在本发明的一个优选例中，所述的拉曼光谱信号包括拉曼光谱中第一拉曼微球、第二拉曼微球、第三拉曼微球、第四拉曼微球和第五拉曼微球的特征峰的峰值。
265.在本发明的一个优选例中，所述的捕获颗粒是具有式i结构的负载有捕获剂磁性颗粒：
266.z1-z2-z3
ꢀꢀ(i)267.式中，
268.z1为磁性颗粒；
269.z2为第一连接元件；和
270.z3为捕获剂。
271.在另一优选例中，所述的第一连接元件选自下组：含有巯基、羟基、醛基和/或羧基的连接分子、多肽连接元件、或其组合。
272.在另一优选例中，所述的多肽连接元件包括“亲和素-生物素”连接臂。
273.在另一优选例中，所述的亲和素为链霉亲合素。
274.在另一优选例中，所述的捕获剂为抗体。
275.在本发明的一个优选例中，所述的第一检测颗粒具有式ii-1结构的微粒：
276.y1-x1-y3-y4-y5
ꢀꢀ
(ii-1)
277.式中，
278.y1、x1和y3如本发明所述；
279.y4为第二连接元件；
280.y5为捕获剂。
281.在另一优选例中，所述的第二检测颗粒具有式ii-2结构的微粒：
282.y1-x2-y3-y4-y5
ꢀꢀ
(ii-2)
283.式中，
284.y1、x2和y3如本发明所述；
285.y4为第二连接元件；
286.y5为捕获剂。
287.在另一优选例中，所述的第三检测颗粒具有式ii-3结构的微粒：
288.y1-x3-y3-y4-y5
ꢀꢀ
(ii-3)
289.式中，
290.y1、x3和y3如本发明所述；
291.y4为第二连接元件；
292.y5为捕获剂。
293.在另一优选例中，所述的第四检测颗粒具有式ii-4结构的微粒：
294.y1-x4-y3-y4-y5
ꢀꢀ
(ii-4)
295.式中，
296.y1、x4和y3如本发明所述；
297.y4为第二连接元件；
298.y5为捕获剂。
299.在另一优选例中，所述的第五检测颗粒具有式ii-5结构的微粒：
300.y1-x5-y3-y4-y5
ꢀꢀ
(ii-5)
301.式中，
302.y1、x5和y3如本发明所述；
303.y4为第二连接元件；
304.y5为捕获剂。
305.在另一优选例中，所述的第二连接元件选自下组：含有巯基、羟基、醛基和/或羧基的连接分子、多肽连接元件、或其组合。
306.在另一优选例中，所述的多肽连接元件包括“亲和素-生物素”连接臂。
307.在另一优选例中，所述的捕获剂为抗体。
308.在另一优选例中，所述的拉曼光谱信号为拉曼光谱中特征峰的峰值。
309.在另一优选例中，所述的容器底部材料为聚苯乙烯。
310.在另一优选例中，所述方法是离体方法。
311.在另一优选例中，所述方法是非诊断性的和非治疗性的。
312.光谱分析系统
313.本发明提供一种光谱分析系统，所述系统包括：
314.(i)激发光发射源，所述的激发光发射源发射激发光，所述的激发光从一容器的底部的下方射入，所述的容器中含有持续运动的如本发明所述的n种“捕获颗粒-待测物-检测颗粒”的复合物；
315.(ii)光谱信号采集单元，所述的光谱信号采集单元用于采集所述“捕获颗粒-待测物-检测颗粒”的复合物经照射后产生的光谱信号；
316.(iii)输出单元。
317.在另一优选例中，所述的光谱分析系统还包括：
318.(iv)分散单元，所述的分散单元用于将所述容器中的所述n种“捕获颗粒-待测物-检测颗粒”的复合物进行持续运动。
319.光谱分析系统所述的光谱分析系统还包括一检测容器，所述检测容器用于盛装待测样品和/或所述的n种“捕获颗粒-待测物-检测颗粒”的复合物。
320.在另一优选例中，所述的待测样品和/或所述的n种“捕获颗粒-待测物-检测颗粒”的复合物为液态。
321.在另一优选例中，所述的光谱分析系统是用于本发明第二方面中所述方法的光谱分析方法。
322.在另一优选例中，所述的光谱分析系统为表面增强拉曼光谱分析系统。
323.在另一优选例中，所述的检测颗粒为拉曼检测颗粒。
324.在另一优选例中，所述的光谱信号为拉曼光谱信号。
325.本发明的主要优点包括：
326.1、本发明提供一种光谱分析方法，在所述的方法中，意外的发现当待测物质的磁微粒复合物在持续运动状态下，测定的拉曼信号强度波动最小，表明待测物质的磁微粒复合物在持续运动状态下测定的重复性和稳定性最强，从而能够准确测定待测物质的含量，满足定量免疫检测的要求。
327.2、本发明意外的发现拉曼信号分子的组合，所述的组合包括第一拉曼微球、第二拉曼微球、第三拉曼微球、第四拉曼微球和第五拉曼微球中的2种或2种以上。在拉曼检测中，拉曼信号分子的组合形成的n种“捕获颗粒-待测物-拉曼微球”能够同时实现对多种(如2、3、4或5种)待测物质的同时准确测定，从而提高检测效率，从而实现和满足“取一次样本与相应的试剂，拉曼检测反应后报告多个目标物浓度的结果”的迫切需求。
328.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(new york:cold spring harbor laboratory press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
329.实施例
330.试剂：
331.降钙素原(pct)、白细胞介素6(il-6)配对单克隆抗体(捕获抗体以ab1代替，检测抗体以ab2代替，市售)；
332.牛血清白蛋白(68kd，批号：y161201，genview公司)；
333.氯金酸(分析纯，批号：20180423，国药集团化学试剂有限公司)；
334.磷酸氢二钠(分析纯，批号：20141015，国药集团化学试剂有限公司)；
335.磷酸二氢钠(分析纯，批号：20140922，国药集团化学试剂有限公司)；
336.氯化钠(分析纯，批号：20180223，国药集团化学试剂有限公司)；
337.sh-peg-cooh(分析纯，批号：d06112，芃圣生物)；4-巯基苯甲酸(分析纯，批号：20160617，国药集团化学试剂有限公司)；
338.乙醇(分析纯，批号：20170918，国药集团化学试剂有限公司)，
339.硝酸银(分析纯，批号：20161001，上海试剂一厂)；
340.柠檬酸三钠(分析纯，批号：20161209，国药集团化学试剂有限公司)，
341.edc(分析纯，批号：20160817，国药集团化学试剂有限公司)。
342.以上实验用水均为二次离子水。
343.链霉亲合素(streptavdin，sa)标记的磁珠(sa-m),上海英芮诚生物科技有限公司1μm链霉亲和素磁珠(sa-m)。
344.设备：
345.l6s型紫外-可见分光光度计(上海仪电分析仪器有限公司)；
346.ct14rd型台式高速冷冻离心机(上海天美生化仪器设备工程有限公司)；
347.fa1004型电子天平(上海舜宇衡平科学仪器有限公司)；
348.雷磁gb-3a型恒温定时搅拌器(上海雷磁创益仪器仪表有限公司)；
349.seed3000拉曼光谱仪(上海如海公司)；
350.orbital shaker ts-1(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)。
351.透明的聚苯乙烯微孔。
352.实施例1：sa-m复合物不同分散状态下降钙素原(pct)和白细胞介素6(il-6)测量数据稳定性的比较试验
353.1.au-4mba@ag-ab2的制备
354.1.1胶体金的制备：100ml 0.01％的氯金酸水溶液煮沸后，快速加入1％的柠檬酸三钠溶液1.75ml，继续煮沸5min。其uv-vis值大约在518nm左右。
355.1.2au-4mba@ag的制备：取1ml胶体金溶液加入1mm的4-巯基苯甲酸(4-mba)溶液后反应一段时间后离心复溶于27μm的柠檬酸三钠溶液中加热煮沸，先后逐滴加入60μl 20mm硝酸银溶液和60μl 20mm柠檬酸三钠溶液后继续煮沸十分钟后室温冷却，4℃保存备用。
356.1.3au-4mba@ag-ab2的制备：将1ml合成好的au-4mba@ag溶液离心弃上清复溶于超纯水中，加入2μl 0.1mm sh-peg-cooh 4℃保存过夜,离心去除多余sh-peg-cooh后，加入5μg抗pct的检测抗体ab2偶联30min后加入适量1μm edc固定三次，每30min加一次，最后加入20μl 10％的bsa溶液封闭30min后再加入edc固定一次，最后离心弃上清定溶于100μl超纯水中4℃保存备用，得到au-4mba@ag-ab2液。
357.2biotin-ab1的制备
358.2.1biotin标记ab1：将100μl 1.5mg/ml的抗pct的捕获抗体(ab1)加入10μl biotin，4℃震荡反应2h，再加入10％的甘氨酸溶液100μl反应30min后放入透析袋中避光4℃透析三天，每8h换一次pbs透析液，得到biotin-ab1液。
359.3.检测的稳定性比较试验
360.3.1样本的配制：
361.利用小牛血清作为基质分别配制0.5、1ng/ml的降钙素原(pct)待测样本。
362.利用小牛血清作为基质配制0.1ng/ml的白细胞介素6(il-6)样本。
363.3.2不同分散状态下的拉曼检测方法
364.seed3000拉曼光谱仪的激发光从聚苯乙烯微孔底部中央的下方射入，且激发光垂直入射于聚苯乙烯微孔底部。
365.降钙素原(pct)的拉曼信号强度为拉曼光谱中1074cm-1
处特征峰的峰值的强度。
366.白细胞介素6(il-6)的拉曼信号强度为拉曼光谱中1074cm-1
处特征峰的峰值的强
度。
367.3.2.1混悬液处于持续流动状态下的拉曼检测
368.取50μlpct待测样本加入一只透明的聚苯乙烯微孔中，分别加入2μl au-4mba@ag-ab2和3μl biotin-ab1室温反应10min后，加入50μl sa-m，继续反应5min后，用磁铁的磁场作用将sa-m及sa-m复合物聚集在聚苯乙烯微孔的侧壁上，去除反应容器聚苯乙烯微孔中的液体，加入200μl pbs缓冲液洗涤，再去除pbs缓冲液，如是重复3次，最后移除磁铁，并向聚苯乙烯微孔中加50μl pbs缓冲液，使sa-m及sa-m复合物分散成混悬液，用移液枪吸取聚苯乙烯微孔中的10μl混悬液并即刻将吸取的混悬液打回聚苯乙烯微孔中，持续不断进行“吸取、打回”操作，使混悬液处于持续涡流流动状态，在混悬液处于持续涡流流动状态过程中，平行测量10次处于持续涡流流动状态的sa-m复合物的拉曼信号强度。
369.3.2.2混悬液处于静置状态下拉曼检测
370.取50μlpct待测样本加入一只透明的聚苯乙烯微孔中，分别加入2μl au-4mba@ag-ab2和3μl biotin-ab1室温反应10min后，加入50μl sa-m，继续反应5min后，用磁铁的磁场作用将sa-m及sa-m复合物聚集在聚苯乙烯微孔的侧壁上，去除反应容器聚苯乙烯微孔中的液体，加入200μl pbs缓冲液洗涤，再去除pbs缓冲液，如是重复3次，最后移除磁铁，并向聚苯乙烯微孔中加50μl pbs缓冲液，使sa-m及sa-m复合物分散成混悬液，平行测量10次处于静置状态的混悬液的拉曼信号强度。
371.3.2.3反复聚集状态下拉曼检测
372.取50μlpct待测样本加入一只透明的聚苯乙烯微孔中，分别加入2μl au-4mba@ag-ab2和3μl biotin-ab1室温反应10min后，加入50μl sa-m，继续反应5min后，用磁铁的磁场作用将sa-m及sa-m复合物聚集在聚苯乙烯微孔的侧壁上，去除反应容器聚苯乙烯微孔中的液体，加入200μl pbs缓冲液洗涤，再去除pbs缓冲液，如是重复3次，接着，移除磁铁，并向聚苯乙烯微孔中加50μl pbs缓冲液，使sa-m及sa-m复合物分散成混悬液，然后利用磁铁将sa-m及sa-m复合物聚集在聚苯乙烯微孔的底部检测区，测定第一次聚集的sa-m复合物的拉信号强度，第一次测定结束后，移除磁铁，用移液枪吹打聚苯乙烯微孔中的液体，使得sa-m及sa-m复合物在聚苯乙烯微孔中再次形成混悬液，然后再利用磁铁将sa-m及sa-m复合物聚集在聚苯乙烯微孔的底部检测区，测定第二次聚集的sa-m复合物的拉信号强度，如此重复10次，测量10次重复聚集的sa-m复合物的拉曼信号强度。
373.3.3不同条件下的拉曼检测结果
374.0.5、1ng/ml的降钙素原(pct)和0.1ng/ml的白细胞介素6(il-6)待测样本的sa-m复合物在不同分散状态下(持续流动状态下、静置状态下和反复聚集状态下)的拉曼信号强度检测结果如表1、表2和表3所示：
375.表1 0.5ng/ml pct待测样本的sa-m复合物在不同分散状态下的拉曼信号强度
[0376][0377][0378]
表2 1ng/ml pct待测样本的sa-m复合物在不同分散状态下的拉曼信号强度
[0379][0380]
表3 0.1ng/ml il-6待测样本的sa-m复合物在不同分散状态下的拉曼信号强度
[0381][0382][0383]
从表1、表2和表3可以看出，在静置状态下和反复聚集状态下，待测物质降钙素原(pct)和白细胞介素6(il-6)的sa-m复合物测定的拉曼信号强度波动大，不能满足定量免疫检测的要求，而待测物质降钙素原(pct)和白细胞介素6(il-6)的sa-m复合物的混悬液在持续流动状态下，测定的拉曼信号强度波动最小，cv％均小于5％，表明sa-m复合物在持续流动状态下sers测定的重复性和稳定性最强，从而能够准确测定待测物质的含量，满足定量免疫检测的要求。
[0384]
实施例2
[0385]
5种au-rr@ag用于多指标联检
[0386]
选用5种au-rr@ag进行c52、c53、c54、c55组合。其中c52为同时检测降钙素原(pct)和白介素6(il-6)，c53为同时检测免疫球蛋白1(igg1)、免疫球蛋白2(igg2)和免疫球蛋白3(igg3)，c54为同时检测免疫球蛋白1(igg1)、免疫球蛋白2(igg2)、免疫球蛋白3(igg3)和免疫球蛋白4(igg4)，c55为同时检测免疫球蛋白1(igg1)、免疫球蛋白2(igg2)、免疫球蛋白3(igg3)、免疫球蛋白4(igg4)和降钙素原(pct)
[0387]
1.au-rr@ag的制备
[0388]
au-rr@ag的制备方法同“实施例1的1.2au-4mba@ag的制备”，区别点，将实施例1的1.2au-4mba@ag中的mba替换成其它拉曼分子rr，制备得au-rr@ag。
[0389]
au-rr@ag的种类编号与对应的特征峰如表4所示：
[0390]
表4 au-rr@ag的种类编号与对应的特征峰
[0391]
au-rr@ag种类006013014026041特征峰位cm-1
207816291072729538
[0392]
其中，编号为006的au-rr@ag的拉曼光谱图如图2所示；编号为013的au-rr@ag的拉曼光谱图如图3所示；编号为014的au-rr@ag的拉曼光谱图如图4所示；编号为026的au-rr@ag的拉曼光谱图如图5所示；编号为041的au-rr@ag的拉曼光谱图如图6所示。
[0393]
2.拉曼测定
[0394]
2.1待测样品及其浓度
[0395]
2.1.1pct和il-6
[0396]
基质：小牛血清+样本稀释液
[0397]
梯度：
[0398]
pct：样本1-7依次为10ng/ml、5ng/ml、2.5ng/ml、1ng/ml、0.5ng/ml、0.25ng/ml、0ng/ml。
[0399]
il-6：样本1-7依次为1ng/ml、0.5ng/ml、0.25ng/ml、0.1ng/ml、0.05ng/ml、0.025ng/ml、0ng/ml。
[0400]
2.1.2igg1、igg2、igg3和igg4
[0401]
基质：人血清+样本稀释液
[0402]
梯度：
[0403]
igg1：样本1-7依次为48960ng/ml、24480ng/ml、12240ng/ml、6120ng/ml、3060ng/ml、1530ng/ml、0ng/ml
[0404]
igg2：样本1-7依次为35520ng/ml、17760ng/ml、8880ng/ml、4440ng/ml、2220ng/ml、1110ng/ml、0ng/ml
[0405]
igg3：样本1-7依次为2838.4ng/ml、1419.2ng/ml、709.6ng/ml、354.8ng/ml、177.4ng/ml、88.7ng/ml、0ng/ml
[0406]
igg4：样本1-7依次为2470.4ng/ml、1235.2ng/ml、617.6ng/ml、308.8ng/ml、154.4ng/ml、77.2ng/ml、0ng/ml
[0407]
测量参数：400mw，1000ms
[0408]
2.2测定方法
[0409]
操作步骤：采用与实施例1相似的在sa-m复合物混悬液持续流动状态下的方法同时测定igg1、igg2、igg3、igg4和pct中的2种、3种、4种或5种，将实施例1中的“1.2au-4mba@ag”替换成au-rr@ag，测值读数，以浓度为横坐标、拉曼信号为纵坐标作待测物浓度与信号的相关性曲线，具体如下：
[0410]
选用5种不同种类编号的cge：006、013、014、026、041进行组合，观察拉曼信号，组合方式为c52、c53、c54、c55(详见下表5)。当功率为400mw，积分时间为1000ms时，取100μl样本(pct：25ul小牛血清+75ul样本稀释液)和100μl样本(il-6：25ul小牛血清+75ul样本稀释液)，分别加入5ul稀释好的不同cge(0.5ulcge+4.5ul纯水)，再加入5ul稀释好的biotin(0.1ul biotin+4.9ul纯水)，混匀后震荡反应10min，加入sa磁珠50ul后继续震荡10min取出，分别加入200ul洗涤液，洗涤3次(不打散)，再分别加入50ul分散液，放入拉曼仪器b7bp中，测值读数。记录不同浓度样品对应的特征峰，做标准曲线。
[0411]
表5 5种au-rr@ag的组合方式
[0412]
c52c53c54c55006&013006&013&014006&013&014&026006&013&014&026&041
006&014006&013&026006&013&014&041 006&026006&013&041006&013&026&041 006&041006&014&026006&014&026&041 013&014006&014&041013&014&026&041 013&026006&026&041
ꢀꢀ
013&041013&014&026
ꢀꢀ
014&026013&014&041
ꢀꢀ
014&041013&026&041
ꢀꢀ
026&041014&026&041
ꢀꢀ
[0413]
3.实验结果
[0414]
用于2联检的c
52
组合试验结果如表6所示：
[0415]
表6样本及其拉曼信号强度
[0416][0417][0418]
对于pct：拉曼信号值(y)和样本的浓度(x)对应关系为y＝1568.1x+188.42相关系数r2＝0.9936；
[0419]
对于il-6：拉曼信号值(y)和样本的浓度(x)对应关系为y＝16713x+473.78相关系数r2＝0.9987。
[0420]
表7样本及其拉曼信号强度
[0421]
[0422]
对于pct：拉曼信号值(y)和样本的浓度(x)对应关系为y＝1214.8x+1136.4r2＝0.9733；对于il-6：拉曼信号值(y)和样本的浓度(x)对应关系为y＝14281x+1742.1r2＝0.956。
[0423]
表8样本及其拉曼信号强度
[0424][0425][0426]
对于pct：拉曼信号值(y)和样本的浓度(x)对应关系为y＝882.36x+360.45r2＝0.9959；对于il-6：拉曼信号值(y)和样本的浓度(x)对应关系为y＝13179x+143.34r2＝0.9835。
[0427]
表9样本及其拉曼信号强度
[0428][0429]
对于pct：拉曼信号值(y)和样本的浓度(x)对应关系为y＝1359.3x+121.39r2＝0.9814；对于il-6：拉曼信号值(y)和样本的浓度(x)对应关系为y＝19189x+1116.2r2＝0.9992。
[0430]
表10样本及其拉曼信号强度
[0431][0432]
对于pct：拉曼信号值(y)和样本的浓度(x)对应关系为y＝1753x+305.43r2＝0.9971；
[0433]
对于il-6：拉曼信号值(y)和样本的浓度(x)对应关系为y＝21625x+76.471r2＝0.9952。
[0434]
表11样本及其拉曼信号强度
[0435][0436][0437]
对于pct：拉曼信号值(y)和样本的浓度(x)对应关系为y＝873.62x+187.57r2＝0.999；
[0438]
对于il-6：拉曼信号值(y)和样本的浓度(x)对应关系为y＝19459x+432.17r2＝0.9914。
[0439]
表12样本及其拉曼信号强度
[0440][0441]
对于pct：拉曼信号值(y)和样本的浓度(x)对应关系为y＝1797x+189.24r2＝0.9995；
[0442]
对于il-6：拉曼信号值(y)和样本的浓度(x)对应关系为y＝17271x+900.7r2＝0.9992。
[0443]
表13样本及其拉曼信号强度
[0444][0445]
对于pct：拉曼信号值(y)和样本的浓度(x)对应关系为y＝1016.3x+73.732r2＝0.998；
[0446]
对于il-6：拉曼信号值(y)和样本的浓度(x)对应关系为y＝22759x+553.73r2＝0.9951。
[0447]
表14样本及其拉曼信号强度
[0448][0449]
对于pct：拉曼信号值(y)和样本的浓度(x)对应关系为y＝1946.7x+807.35r2＝0.9994；
[0450]
对于il-6：拉曼信号值(y)和样本的浓度(x)对应关系为y＝22846x+544.67r2＝0.9883。
[0451]
表15样本及其拉曼信号强度
[0452][0453]
对于pct：拉曼信号值(y)和样本的浓度(x)对应关系为y＝1362.5x+384.62r2＝0.9889；
[0454]
对于il-6：拉曼信号值(y)和样本的浓度(x)对应关系为y＝29470x+1436.1r2＝0.9987。
[0455]
用于3联检的c
53
组合试验：
[0456]
表16样本及其拉曼信号强度
[0457]
[0458][0459]
对于igg1：拉曼信号值(y)和样本的浓度(x)对应关系为y＝0.2615x+215.47r2＝0.9968；
[0460]
对于igg2：拉曼信号值(y)和样本的浓度(x)对应关系为y＝0.4324x+774.58r2＝0.9889；
[0461]
对于igg3：拉曼信号值(y)和样本的浓度(x)对应关系为y＝0.2615x+215.47r2＝0.9968；
[0462]
表17样本及其拉曼信号强度
[0463][0464]
对于igg1：拉曼信号值(y)和样本的浓度(x)对应关系为y＝0.2772x-18.098r2＝0.9979；
[0465]
对于igg2：拉曼信号值(y)和样本的浓度(x)对应关系为y＝0.4873x+450.46r2＝0.9958；
[0466]
对于igg3：拉曼信号值(y)和样本的浓度(x)对应关系为y＝3.0139x+179.75r2＝0.9983；
[0467]
表18样本及其拉曼信号强度
[0468][0469]
对于igg1：拉曼信号值(y)和样本的浓度(x)对应关系为y＝0.2656x+119.91r2＝0.9935；
[0470]
对于igg2：拉曼信号值(y)和样本的浓度(x)对应关系为y＝0.4499x+455.94r2＝0.9953；
[0471]
对于igg3：拉曼信号值(y)和样本的浓度(x)对应关系为y＝6.2982x+830.58r2＝0.9984；
[0472]
表19样本及其拉曼信号强度
[0473][0474]
对于igg1：拉曼信号值(y)和样本的浓度(x)对应关系为y＝0.2657x+120.22r2＝0.9934；
[0475]
对于igg2：拉曼信号值(y)和样本的浓度(x)对应关系为y＝0.594x-25.929r2＝0.9979；
[0476]
对于igg3：拉曼信号值(y)和样本的浓度(x)对应关系为y＝3.1382x+206.26r2＝0.999；
[0477]
表20样本及其拉曼信号强度
[0478][0479]
对于igg1：拉曼信号值(y)和样本的浓度(x)对应关系为y＝0.2877x-88.259r2＝0.9941；
[0480]
对于igg2：拉曼信号值(y)和样本的浓度(x)对应关系为y＝0.5525x+507.16r2＝0.9913；
[0481]
对于igg3：拉曼信号值(y)和样本的浓度(x)对应关系为y＝6.1313x+1517r2＝0.9883；
[0482]
表21样本及其拉曼信号强度
[0483][0484][0485]
对于igg1：拉曼信号值(y)和样本的浓度(x)对应关系为y＝0.2596x+297.37r2＝0.9954；
[0486]
对于igg2：拉曼信号值(y)和样本的浓度(x)对应关系为y＝0.2188x+270.47r2＝0.9902；
[0487]
对于igg3：拉曼信号值(y)和样本的浓度(x)对应关系为y＝6.9753x+861.61r2＝0.9997；
[0488]
表22样本及其拉曼信号强度
[0489][0490]
对于igg1：拉曼信号值(y)和样本的浓度(x)对应关系为y＝0.3389x+298.45r2＝0.9843；
[0491]
对于igg2：拉曼信号值(y)和样本的浓度(x)对应关系为y＝0.6062x-404.47r2＝0.9972；
[0492]
对于igg3：拉曼信号值(y)和样本的浓度(x)对应关系为y＝3.464x+54.714r2＝0.9956；
[0493]
表23样本及其拉曼信号强度
[0494][0495]
对于igg1：拉曼信号值(y)和样本的浓度(x)对应关系为y＝0.3388x+27.075r2＝0.999；
[0496]
对于igg2：拉曼信号值(y)和样本的浓度(x)对应关系为y＝0.5884x-175.5r2＝0.9982；
[0497]
对于igg3：拉曼信号值(y)和样本的浓度(x)对应关系为y＝7.218x+677.16r2＝0.9988；
[0498]
表24样本及其拉曼信号强度
[0499][0500]
对于igg1：拉曼信号值(y)和样本的浓度(x)对应关系为y＝0.3489x+317.95r2＝0.9925；
[0501]
对于igg2：拉曼信号值(y)和样本的浓度(x)对应关系为y＝0.2747x-116.23r2＝0.9968；
[0502]
对于igg3：拉曼信号值(y)和样本的浓度(x)对应关系为y＝7.4956x+697.33r2＝0.9988；
[0503]
表25样本及其拉曼信号强度
[0504][0505]
对于igg1：拉曼信号值(y)和样本的浓度(x)对应关系为y＝0.449x-163.28r2＝0.9984；
[0506]
对于igg2：拉曼信号值(y)和样本的浓度(x)对应关系为y＝0.2476x+176.34r2＝0.9858；
[0507]
对于igg3：拉曼信号值(y)和样本的浓度(x)对应关系为y＝7.5143x+966.97r2＝0.9987
[0508]
用于4联检的c
54
组合试验：
[0509]
表26样本及其拉曼信号强度
[0510][0511][0512]
对于igg1：拉曼信号值(y)和样本的浓度(x)对应关系为y＝0.2733x+12.901r2＝0.997；
[0513]
对于igg2：拉曼信号值(y)和样本的浓度(x)对应关系为y＝0.433x+368.13r2＝0.9941；
[0514]
对于igg3：拉曼信号值(y)和样本的浓度(x)对应关系为y＝6.8883x+648.22r2＝0.9926；
[0515]
对于igg4：拉曼信号值(y)和样本的浓度(x)对应关系为y＝307.06x+576.22r2＝0.9917。
[0516]
表27样本及其拉曼信号强度
[0517][0518]
对于igg1：拉曼信号值(y)和样本的浓度(x)对应关系为y＝0.2177x+191.39r2＝0.9971；
[0519]
对于igg2：拉曼信号值(y)和样本的浓度(x)对应关系为y＝0.4081x+631.39r2＝0.9796；
[0520]
对于igg3：拉曼信号值(y)和样本的浓度(x)对应关系为y＝6.7411x-117.49r2＝0.991；
[0521]
对于igg4：拉曼信号值(y)和样本的浓度(x)对应关系为y＝7.1573x+1451.3r2＝
0.9959。
[0522]
表28样本及其拉曼信号强度
[0523][0524][0525]
对于igg1：拉曼信号值(y)和样本的浓度(x)对应关系为y＝0.3659x+329.87r2＝0.9988；
[0526]
对于igg2：拉曼信号值(y)和样本的浓度(x)对应关系为y＝0.2148x+240.83r2＝0.9904；
[0527]
对于igg3：拉曼信号值(y)和样本的浓度(x)对应关系为y＝4.7453x+62.87r2＝0.9988；
[0528]
对于igg4：拉曼信号值(y)和样本的浓度(x)对应关系为y＝7.8383x+934.67r2＝0.9992。
[0529]
表29样本及其拉曼信号强度
[0530][0531]
对于igg1：拉曼信号值(y)和样本的浓度(x)对应关系为y＝0.2094x+420.35r2＝0.9879；
[0532]
对于igg2：拉曼信号值(y)和样本的浓度(x)对应关系为y＝0.5244x+429.3r2＝0.9852；
[0533]
对于igg3：拉曼信号值(y)和样本的浓度(x)对应关系为y＝292.61x+359.45r2＝
0.9848；
[0534]
对于igg4：拉曼信号值(y)和样本的浓度(x)对应关系为y＝8.4138x+1218.9r2＝0.9994。
[0535]
表30样本及其拉曼信号强度
[0536][0537]
对于igg1：拉曼信号值(y)和样本的浓度(x)对应关系为y＝0.2973x+719.25r2＝0.9878；
[0538]
对于igg2：拉曼信号值(y)和样本的浓度(x)对应关系为y＝0.5704x+58.029r2＝0.9985；
[0539]
对于igg3：拉曼信号值(y)和样本的浓度(x)对应关系为y＝3.2075x+95.257r2＝0.9995；
[0540]
对于igg4：拉曼信号值(y)和样本的浓度(x)对应关系为y＝8.5558x+1125.3r2＝0.9993
[0541]
用于5联检的c
55
组合试验：
[0542]
表31样本及其拉曼信号强度
[0543][0544]
对于igg1：拉曼信号值(y)和样本的浓度(x)对应关系为y＝0.2323x+485.93r2＝0.9815；
[0545]
对于igg2：拉曼信号值(y)和样本的浓度(x)对应关系为y＝0.4173x+762.73r2＝
0.9922；
[0546]
对于igg3：拉曼信号值(y)和样本的浓度(x)对应关系为y＝6.3607x+677.84r2＝0.9706；
[0547]
对于igg4：拉曼信号值(y)和样本的浓度(x)对应关系为y＝2.9663x+366.74r2＝0.9881；
[0548]
对于pct：拉曼信号值(y)和样本的浓度(x)对应关系为y＝3252.7x+53.801r2＝0.9631。
[0549]
以上数据显示，无论2联检还是3、4、5联检，样本浓度与特征峰的信号值都有较好的定量相关性，可用于多指标的联合检测。
[0550]
在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。