一种共价有机骨架材料及其制备方法和应用，适配体传感器及其制备方法

1.本发明涉及一种共价有机骨架材料及其制备方法和应用，适配体传感器及其制备方法，属于电化学传感技术领域。


背景技术：

2.新型冠状病毒被称为严重急性呼吸综合征2型冠状病毒(sars
‑
cov
‑
2)的全球迅速发展，对各国卫生系统、科学和社会造成前所未有的影响。covid
‑
19被认为是近20年来出现的第三高致病性人冠状病毒。目前sars
‑
cov
‑
2的主要检测方法有聚合酶链反应(pcr)，核酸杂交技术或免疫检测方法等。已经有多种免疫检测方法被开发用于covid
‑
19病毒的检测，如肽基发光免疫检测、酶联免疫吸附检测(elisa)、免疫层析检测和侧流免疫检测。虽然基于抗体的血清检测快速、方便，但该技术存在的不足限制了其适用性。例如，在症状发作后产生用于检测sars
‑
cov
‑
2的抗体需要不同潜伏时间，以及sars
‑
cov
‑
2抗体与针对其他冠状病毒产生的抗体具有潜在的交叉反应性。因此，以核酸为基础的实时逆转录pcr(rt
‑
qpcr)检测被全球广泛应用，并作为病毒rna检测的黄金标准。但是，rt
‑
qpcr检测需要昂贵的仪器和试剂、人员培训等，因此需要将标本运送到参考实验室。此外，这些方法需要训练有素的人员才能执行。
3.科研工作者合成了核衣壳磷蛋白(n
‑
gene)的反义寡核苷酸(dna)，用于通过形成g
‑
四链体结构检测sars
‑
cov
‑
2，该方法不需要核酸提取步骤。与传统探针相比，g
‑
四链体具有体积小，合成简单，易于修饰等优势。而且通过信号放大可以进一步提高生物传感器的灵敏度和检测极限。基于rna和病毒形成g
‑
四链体的检测原理，目前已经构筑不同类型(诸如电化学、荧光或比色法等)的生物传感器。其中，电化学适配体生物传感器因具有高灵敏度、低成本、易于操作、高稳定性等特点，为临床诊断提供了可靠的替代方案。随着电化学装置小型化和智能化发展，电化学适配体生物传感器在临床诊断和现场检测中发挥了重要作用。
4.目前，基于au纳米颗粒，tio2，氧化石墨烯(go)，以及结合碳黑的磁珠等材料的电化学g
‑
四链体dna生物传感器已经被用于检测感染的covid
‑
19患者，但是，这些电化学生物传感器的制造过程繁琐且灵敏度不令人满意。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种共价有机骨架材料，用作sars
‑
cov
‑
2的n
‑
gene适配体的检测平台，构建制造过程简单且灵敏度高的sars
‑
cov
‑
2适配体传感器。
6.本发明的第二个目的在于提供一种共价有机骨架材料的制备方法。
7.本发明的第三个目的在于提供一种上述共价有机骨架材料作为适配体传感器用电极材料的应用。
8.本发明的第四个目的在于提供一种适配体传感器。
9.本发明的第五个目的在于提供一种适配体传感器的制备方法。
10.为实现上述目的，本发明的共价有机骨架材料技术方案是：
11.一种共价有机骨架材料，由四氨基苯基卟啉、联吡啶二甲醛在催化剂的作用下通过席夫碱反应制得。
12.本发明的共价有机骨架材料(p
‑
cof)为二维层状堆砌的纳米球，具有大的比表面积，大的孔径，粗糙的表面，丰富的官能团，高度共轭的网络结构和良好的电化学活性。因此，大量适配体链不仅可以紧密地锚固在p
‑
cof表面，而且还可以通过氢键，π
‑
π堆积相互作用或正负离子之间的静电力渗透到p
‑
cof孔的内部。本发明的共价有机骨架材料(p
‑
cof)与sars
‑
cov
‑
2的抗体和n
‑
gene的靶向适配体链有较强的结合作用，可用于快速准确检测严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2(sars
‑
cov
‑
2)。
13.优选地，所述席夫碱反应的温度为80
‑
150℃，所述席夫碱反应的时间为48
‑
168h。
14.更优选地，所述席夫碱反应的温度120℃；所述席夫碱反应的时间为72h。
15.优选地，所述四氨基苯基卟啉与联吡啶二甲醛的摩尔比为0.9
‑
1.2:2。
16.更优选地，所述四氨基苯基卟啉与联吡啶二甲醛的摩尔比为23:41。
17.优选地，所述催化剂为乙酸。催化剂在反应体系中加入适量即可。优选地，所述四氨基苯基卟啉与乙酸的摩尔比为0.23:12。
18.优选地，所述四氨基苯基卟啉为5,10,15,20
‑
四胺(4
‑
氨基苯基)卟啉；所述联吡啶二甲醛为2,2'
‑
联吡啶
‑
5,5'
‑
二甲醛。本发明将5,10,15,20
‑
四胺(4
‑
氨基苯基)卟啉与2,2'
‑
联吡啶
‑
5,5'
‑
二甲醛通过溶剂热法合成共价有机骨架材料(p
‑
cof)。
19.优选地，所述席夫碱反应的溶剂由邻二氯苯和正丁醇组成；所述邻二氯苯和正丁醇组成的体积比为1:1。
20.本发明的共价有机骨架材料的制备方法的技术方案是：
21.一种共价有机骨架材料的制备方法，包括：将四氨基苯基卟啉、联吡啶二甲醛在催化剂的作用下进行席夫碱反应。
22.本发明将四氨基苯基卟啉和联吡啶二甲醛作为构建共价有机骨架材料的基本单元，制备的共价有机骨架材料(p
‑
cof)表现出出色的电化学活性，具有高比表面积和丰富的官能团(
‑
c＝n
‑
或nh2)，p
‑
cof上保留的带负电荷的
‑
c＝n
‑
和带正电荷的抗体或适体链可以产生静电引力。因此，各种生物分子探针(例如抗体，dna或适体链)可以通过π
‑
π堆积相互作用，共价键，氢键，静电相互作用或范德华力紧密覆盖在p
‑
cof网络表面。由于p
‑
cof的固有骨架和内部多孔结构，加上与探针的作用力，大量探针不仅可以锚定在p
‑
cof表面，还可以穿透p
‑
cof内部，几乎可以占据所有结合位点。
23.本发明的共价有机骨架材料在适配体传感器用电极材料中的应用的技术方案是：
24.一种上述共价有机骨架材料作为适配体传感器用电极材料的应用。
25.电化学配适体生物传感器因具有高灵敏度、低成本、易于操作、高稳定性等特点，为临床诊断提供了可靠的替代方案。共价有机骨架材料具有密度低、比表面积大和π
‑
π堆叠架构等结构特性，本发明将基于卟啉和联吡啶构建的共价有机骨架材料用于适配体传感器。
26.本发明的适配体传感器的技术方案是：
27.一种适配体传感器，包括电极基体和修饰在电极基体表面的上述共价有机骨架材
料，所述共价有机骨架材料上吸附有用于靶向检测sars
‑
cov
‑
2的核酸适配体。
28.本发明的p
‑
cof基适配体传感器用于n
‑
gene检测时具有较高的灵敏度、高选择性、良好的重现性和稳定性以及出色的可再生性，用于检测真实样品时，表现出良好的实用性。
29.本发明的制备适配体传感器的技术方案是：
30.一种适配体传感器的制备方法，包括：首先将上述共价有机骨架材料的悬浮液修饰到电极基体上，得到修饰电极；然后将修饰电极在核酸适配体溶液中孵育。
31.本发明的制备适配体传感器的技术方案简单高效，具有良好的重现性和稳定性。
32.所述核酸适配体为n
‑
gene适配体，优选为n61、n15、n48或n58适配体。进一步优选地，所述核酸适配体为n58核酸适配体。
33.优选地，所述共价有机骨架材料的悬浮液的浓度为0.1
‑
10mg
·
ml
‑1。
34.更优选地，所述共价有机骨架材料的悬浮液的浓度为1mg
·
ml
‑1。
35.优选地，所述共价有机骨架材料在电极基体上的涂覆量为0.071
‑
7.077μg/mm2。
36.更优选地，所述共价有机骨架材料在电极基体上的涂覆量为0.708μg/mm2。
37.优选地，所述电极为裸金电极。
38.优选地，所述核酸适配体溶液的浓度为10
‑
1000nmol/l。
39.更优选地，所述核酸适配体溶液的浓度为100nmol/l。
40.优选地，所述孵育的温度为4℃；所述孵育的时间为2h。
41.优选地，所述预处理电极是通过将电极分别进行抛光、洗涤干燥、电化学激活和洗涤干燥处理得到。
42.优选地，所述共价有机骨架材料的悬浮液修饰到预处理电极基体上的过程为：将共价有机骨架材料分散于去离子水中，得到均匀悬浮液，将悬浮液涂覆到预处理的裸电极表面上，随后在空气中干燥。
43.优选地，所述修饰电极在核酸适配体溶液中孵育的过程为：将修饰电极浸入核酸适配体溶液中，得到适配体传感器。
44.所述孵育是将固定有p
‑
cof的金电极与适配体溶液接触，使p
‑
cof吸附固定适配体并达到平衡状态。
附图说明
45.图1：p
‑
cof的合成过程示意图；
46.图2：基于p
‑
cof的适配体传感器制备和检测n
‑
gene的过程示意图；
47.图3：tapp、bpda和p
‑
cof的傅立叶变换红外光谱图；
48.图4：p
‑
cof的x射线衍射(xrd)图谱；
49.图5：(a)为p
‑
cof的高分辨率c1s xps光谱，(b)为p
‑
cof的高分辨率n1s xps光谱，(c)为吸附n58适配体后的p
‑
cof(即apt/p
‑
cof)的高分辨率c1s xps光谱，(d)为吸附n58适配体后的p
‑
cof(即apt/p
‑
cof)的高分辨率n1s xps光谱，(e)为吸附n58适配体后的p
‑
cof(即apt/p
‑
cof)的高分辨率p 2p xps光谱；
50.图6：(a)为p
‑
cof的低倍率sem图像，(b)为p
‑
cof的高倍率sem图像，(c)为p
‑
cof的低倍率tem图像，(d)为p
‑
cof的低倍率tem图像，(e)为p
‑
cof的高倍率tem图像；
51.图7：p
‑
cof的氮气吸附
‑
解吸等温线；
52.图8：基于n58适配体构建p
‑
cof基适配体传感器和n
‑
gene检测过程得到的eis nquist曲线；
53.图9：基于n58适配体构建p
‑
cof基适配体传感器和n
‑
gene检测过程得到的c
‑
v曲线；
54.图10：使用不同浓度的p
‑
cof悬浮液制备p
‑
cof基生物传感器的δrct值；
55.图11：使用不同浓度的p
‑
cof悬浮液制备的p
‑
cof基生物传感器检测n
‑
gene的δrct值；
56.图12：锚定不同浓度的n58适配体溶液制备p
‑
cof基适配体传感器的δrct值；
57.图13：锚定不同浓度的n58适配体溶液制备的p
‑
cof基适配体传感器检测n
‑
gene的δrct值；
58.图14：改变n
‑
gene与p
‑
cof基适配体传感器(apt/p
‑
cof/ae)的结合时间(0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7和1.8h)，检测n
‑
gene得到的eis nquist曲线；
59.图15：改变n
‑
gene与p
‑
cof基适配体传感器(apt/p
‑
cof/ae)的结合时间(0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7和1.8h)，检测n
‑
gene得到的δrct值；
60.图16：n
‑
gene/apt/p
‑
cof/ae传感器检测不同n
‑
gene浓度(0.0001、0.001、0.01、0.1、1、10、100和1000pg
·
ml
‑1)得到的eis响应曲线；
61.图17：δrct值(δrct＝rct
n
‑
gene/apt/p
‑
cof/ae
‑
rct
apt/p
‑
cof/ae
)随n
‑
gene浓度的变化曲线；
62.图18：δrct与n
‑
gene浓度的线性拟合曲线；
63.图19：p
‑
cof基适配体传感器对n
‑
gene(0.01pg
·
ml
‑1)，干扰物ca
2+
，flua，flub，pi，cpn，bsa，igg(1pg
·
ml
‑1)以及干扰物(各干扰物浓度为1pg
·
ml
‑1)和n
‑
gene(0.01pg
·
ml
‑1)的混合物的选择性测试结果；
64.图20：p
‑
cof基适配体传感器检测n
‑
gene(0.01pg
·
ml
‑1)的重现性；
65.图21：p
‑
cof基适配体传感器检测n
‑
gene(0.01pg
·
ml
‑1)的可再生性；
66.图22：p
‑
cof基适配体传感器检测n
‑
gene(0.01pg
·
ml
‑1)的稳定性。
具体实施方式
67.下面结合附图对本发明的实施方式作进一步说明。
68.本发明以下实施例所用的材料：n58核酸适配体由上海生工生物工程股份有限公司提供，序列为5
’‑
gct gga tgt cac cgg att gtc gga cat cgg att gtc tga gtc ata tga cac atc cag c
‑3’
。
69.本发明实施例中所用的磷酸盐缓冲溶液、电解质溶液、不同浓度的n58适配体溶液、不同浓度的n
‑
gene溶液和干扰物溶液、n
‑
gene与干扰物的混合物采用以下的制备方法得到：
70.磷酸缓冲溶液的制备：将8.00g nacl、0.20g kcl、1.44g na2hpo4、1.8g k2hpo4溶于800ml超纯水(≥18.2mω
·
cm)中，用盐酸调节溶液的ph值至7.4，最后用超纯水(≥18.2mω
·
cm)定容至1l，得到磷酸盐缓冲溶液(pbs，0.01mol/l，ph＝7.4)。
71.电解质溶液的制备：将1.6g k3fe(cn)6，2.1g k4fe(cn)6和7.5g kcl加入到上述制备的磷酸缓冲溶液(pbs，0.01mol/l，ph＝7.4)中得到电解质溶液，用于适配体传感器的电化学检测。
72.不同浓度n58适配体溶液的制备：在n58适配体原液中加入磷酸盐缓冲溶液(pbs，0.01mol/l，ph＝7.4)，配制成浓度分别为1、10、50、100和200nmol/l的n58适配体溶液。
73.不同浓度n
‑
gene溶液的制备：在n
‑
gene原液中加入磷酸盐缓冲溶液(pbs，0.01mol/l，ph＝7.4)，配制浓度分别为0.0001、0.001、0.01、0.1、1、10、100和1000pg
·
ml
‑1)的n
‑
gene溶液；
74.干扰物溶液、n
‑
gene与干扰物的混合物溶液的制备：分别在flua、flub、p1、cpn、bsa、igg的原液中加入磷酸盐缓冲溶液(pbs，0.01mol/l，ph＝7.4)，配制浓度均为1pg ml
‑1的flua、flub、p1、cpn、bsa、igg溶液；在磷酸盐缓冲溶液(pbs，0.01mol/l，ph＝7.4)中加入cacl2，配制浓度为1pg ml
‑1的ca
2+
溶液；在含有flua、flub、p1、cpn、bsa、igg、n
‑
gene的原液以及cacl2的原料中加入磷酸盐缓冲溶液(pbs，0.01mol/l，ph＝7.4)，配制n
‑
gene浓度为0.01pg
·
ml
‑1以及各干扰物(flua、flub、p1、cpn、bsa、igg和ca
2+
)浓度均为1pg
·
ml
‑1的混合物。
75.一、本发明的共价有机骨架材料的具体实施例如下：
76.实施例1
77.本实施例的共价有机骨架材料由5,10,15,20
‑
四胺(4
‑
氨基苯基)卟啉(tapp)和2,2'
‑
联吡啶
‑
5,5'
‑
二甲醛(bpda)在催化剂的作用下通过席夫碱反应制备得到；其中，所述席夫碱反应的温度为120℃，反应时间为72h，所述tapp和bpda的摩尔比为23:41，所述席夫碱反应的溶剂由邻二氯苯和正丁醇组成，所述邻二氯苯和正丁醇组成的体积比为1:1，所述催化剂为乙酸。
78.二、本发明的共价有机骨架材料的制备方法的具体实施例如下：
79.实施例2
80.本实施例的共价有机骨架材料的制备方法制备得到的为实施例1的共价有机骨架材料，具体步骤为：
81.将5,10,15,20
‑
四胺(4
‑
氨基苯基)卟啉(tapp)(15.6mg，0.023mmol)和2,2'
‑
联吡啶
‑
5,5'
‑
二甲醛(bpda)(8.7mg，0.041mmol)加入含有2.5ml邻二氯苯和2.5ml正丁醇的schlenk瓶(体积为15ml)中，此时溶液为深绿色，然后将schlenk瓶放置在超声清洁器中，并通过超声摇动30分钟，形成均匀溶液，加入0.2ml的浓度为6mol/l的乙酸溶液作为催化剂。在氮气保护下，通过三次冷冻
‑
抽气和解冻循环除去反应瓶中的空气，于120℃的温度下反应72h。反应结束后，通过离心收集紫色沉淀，并用1、4
‑
二氧六环和丙酮洗涤得到的沉淀，经离心回收纯化产物，将纯化后的产物在100℃的真空干燥箱中干燥18h，得到共价有机骨架材料，标记为p
‑
cof，p
‑
cof的制备过程示意图如图1所示。
82.三、由上述制备的共价有机骨架材料作为适配体传感器用电极材料的应用的具体实施例如下：
83.将实施例2制得的共价有机骨架材料作为电极材料修饰到电极基体上即可，电极基体为金。
84.四、本发明的适配体传感器的具体实施例如下：
85.实施例3
86.本实施例的适配体传感器包括金电极基体和修饰在金电极基体表面的由实施例2制备的共价有机骨架材料，所述共价有机骨架材料上吸附有用于靶向检测sars
‑
cov
‑
2的n58核酸适配体。
87.五、本发明的适配体传感器的制备方法的具体实施例如下：
88.实施例4
89.本实施例的适配体传感器的制备方法得到的是实施例3的适配体传感器，具体步骤为：
90.(1)工作电极采用金电极，购自中国武汉gaoss union仪器公司，直径为3毫米。在使用前进行如下处理：首先用氧化铝浆液对金电极进行抛光，再用去离子水洗净；然后使用食人鱼溶液对金电极清洗10分钟，再用去离子水清洗并在氮气环境中干燥；最后，将金电极在0.5mol/l的h2so4溶液中通过
‑
0.2v～1.6v电位循环后被电化学激活，再用去离子水冲洗并在氮气下干燥，得到裸金电极(ae)；其中食人鱼溶液由体积比为7:3的h2so4溶液和h2o2溶液组成，所述h2so4溶液的质量分数为98％，h2o2溶液的质量分数为30％。
91.(2)将实施例2制备的p
‑
cof均匀分散在去离子水中，形成p
‑
cof的浓度为1mg
·
ml
‑1的悬浮液(每1ml去离子水中含有1mg的p
‑
cof)。然后，将5μl p
‑
cof的悬浮液滴置于裸金电极(ae)表面上，并在空气中干燥4小时，得到表面固定有p
‑
cof的金电极，标记为p
‑
cof/ae。之后，将p
‑
cof/ae在100nmol/l的sars
‑
cov
‑
2的n
‑
gene适配体(n58适配体)溶液中于4℃中孵育2h(所述孵育是将固定有p
‑
cof的金电极与适配体溶液接触，使p
‑
cof吸附固定适配体并达到吸附平衡状态)，确保p
‑
cof/ae吸附n58适配体达到饱和状态，得到表面固定有n58适配体的金电极，即适配体传感器，标记为apt/p
‑
cof/ae。
92.相关实验例
93.本发明的基于p
‑
cof的适配体传感器制备和检测n
‑
gene的过程示意图如图2所示，其中，ae为裸金电极，p
‑
cof/ae为表面固定有p
‑
cof的金电极，apt/p
‑
cof/ae为由p
‑
cof吸附n58适配体后得到的电极，n
‑
gene/apt/p
‑
cof/ae为由n58适配体吸附n
‑
gene后得到的电极。
94.实验例1结构表征
95.1.红外光谱
96.通过ftir光谱探测p
‑
cof的化学结构，结果如图3所示。由图3可知，tapp的ft
‑
ir图谱中3300cm
‑1处的双峰为氨基中n
‑
h的伸缩振动吸收峰，1600cm
‑1处为tapp的c＝n的伸缩振动吸收峰，1210cm
‑1处为苯环结构中c
‑
h的弯曲振动吸收峰，800cm
‑1处为苯环的对位双取代吸收峰。bpda的ft
‑
ir图谱中2750cm
‑1处的双峰为醛基中c
‑
h伸缩振动峰，1690cm
‑1附近出现的吸收峰是醛基中c＝o的伸缩振动峰，1582cm
‑1处为吡啶环中c＝c的伸缩振动吸收峰，1200cm
‑1处为吡啶环中c
‑
h的弯曲振动吸收峰，816cm
‑1处为吡啶环中c
‑
n的伸缩振动吸收峰。相比于tapp和bpda而言，p
‑
cof的ft
‑
ir图谱中原属于tapp的氨基中n
‑
h的伸缩振动吸收峰以及bpda的醛基中c＝o的伸缩振动吸收峰和c
‑
h伸缩振动吸收峰等特征峰消失不见，而出现了位于1600cm
‑1处的亚胺官能团中
‑
c＝n
‑
的伸缩振动吸收峰，以上结果表明了tapp与bpda之间进行了希夫碱型缩合反应。
97.2.x射线衍射(xrd)
98.利用x射线衍射(xrd)对实施例1得到的共价有机骨架材料p
‑
cof进行表征，得到的
结果如图4所示。由图可知，xrd仅在2θ＝19.3
°
处出现特征峰，对应于无定形碳。
99.3.x射线光电子能谱(xps)
100.为了进一步验证合成的p
‑
cof的化学成分和结构，进一步分析了p
‑
cof的高分辨率c1s和n1sxps光谱，得到的结果如图5所示。其中，图5a为p
‑
cof的高分辨率c1s xps光谱；图5b为p
‑
cof的高分辨率n1s xps光谱。
101.由图5a和图5b可知，p
‑
cof的c1s xps光谱中有多个峰，结合能(bes)为283.5、284.1、285.5、286.5、288.3ev，分别对应于c
‑
c(sp2),c
‑
c(sp),c
‑
n,c
‑
o,c＝o和n
‑
c＝o。其中，c
‑
c(sp2)的存在表明了p
‑
cof的共轭结构，该结构可通过π
‑
π堆积的作用促进p
‑
cof对生物分子的吸附，而c
‑
n官能团还可以通过增强亲和力来提高p
‑
cof对适配体的吸附。p
‑
cof的n1s xps光谱分为四个峰，分别对应
–
n＝(397ev)，吡啶n(398.3ev)，吡咯n(399.1ev)和石墨型n(401.4ev)。其中，卟啉环上存在峰面积较大的吡啶n，有利于p
‑
cof对生物分子的吸附。
102.为了研究n
‑
gene适配体(n58适配体)是否可以吸附在p
‑
cof网络上，将实施例3中制备的p
‑
cof/ae在n58适配体浓度为100nmol/l的溶液中于4℃中孵育2h，得到吸附n58适配体后的p
‑
cof(即apt/p
‑
cof)，然后通过xps表征吸附n58适配体后的p
‑
cof(即apt/p
‑
cof)的表面的化学结构和组成的变化，结果如图5c
‑
5e所示。其中，图5c为吸附n58适配体后的p
‑
cof(即apt/p
‑
cof)的高分辨率c1s xps光谱；图5d为吸附n58适配体后的p
‑
cof(即apt/p
‑
cof)的高分辨率n1s xps光谱；图5e为吸附n58适配体后的p
‑
cof(即apt/p
‑
cof)的高分辨率p 2p xps光谱。
103.从图5c可以看出，吸附n58适配体后的p
‑
cof的c1s xps光谱中结合能(bes)在284.6、286.1和288.6ev的峰分别对应于c
‑
c，c
‑
o和n
‑
c＝o。此外，在结合能(bes)为292.9ev和295.6ev处出现两个峰，为pbs溶液中遗留的k
+
。从图5d可以看出，apt/p
‑
cof的n1s xps谱图中的峰与p
‑
cof材料的n1sxps谱图中的峰相同，因此，仅仅以n1s很难区分p
‑
cof表面是否发生n58适配体吸附。
104.p
‑
cof对n58适配体的吸附可通过分析xps中p元素的存在来验证，从图5e可以看出，吸附n58适配体后的apt/p
‑
cof样品的xps图谱中出现了清晰的的p 2p信号，分别为p 2p
3/2
(133.2ev)和p 2p
1/2
(134.3ev)两个峰，源自吸附在p
‑
cof网络上的n58适配体的寡核苷酸链。
105.上述结果进一步证实了n58适配体成功锚定在p
‑
cof网络上。
106.实验例2形貌表征
107.1.sem和tem图
108.p
‑
cof的表面形貌和纳米结构通过sem和tem表征，结果如图6所示。
109.图6中，图6a和图6b分别为p
‑
cof的低倍率和高倍率sem图像，图6c、图6d和图6e为p
‑
cof的低倍率和高倍率tem图像。由图6a可知，p
‑
cof为二维层状堆砌的纳米球。从图6b可以看出，p
‑
cof的纳米片具有粗糙的表面结构。由图6c可知，p
‑
cof具有平均直径为200
‑
300nm的球状结构。由图6d至图6e可知，p
‑
cof纳米球是由多层组装形成的，并且未观察到清晰的晶格间距，表示p
‑
cof为非晶态纳米结构，这与xrd表征结果一致。p
‑
cof的无定形纳米结构和粗糙表面有益于适配体的固定，从而利于n
‑
gene适配体传感器的构建。
110.2.吸附等温线
111.测试实施例2得到的共价有机骨架材料的吸附等温线，得到的结果如图7所示，从
图7可以得到，p
‑
cof的bet值为523cm3·
g
‑1，孔径为7.7683nm。
112.实验例3适配体传感器的传感性能
113.1.测试条件
114.利用电化学阻抗谱(eis)和循环伏安法(cv)研究了基于p
‑
cof的适配体传感器的构建和检测n
‑
gene的传感性能。
115.2.测试结果
116.通过eis和cv技术研究实施例4制备的基于n58适配体的p
‑
cof基适配体传感器的制备过程与检测n
‑
gene时的传感性能，结果如图8和图9所示。其中，图8为基于n58适配体的p
‑
cof基适配体传感器的构建和检测n
‑
gene过程得到的eis nquist曲线；图9为基于n58适配体的p
‑
cof基适配体传感器的构建和n
‑
gene检测过程得到的c
‑
v曲线。
117.从图8中可以看出，裸金电极ae显示出非常小的rct值，为62.2ω，显示出金电极基底优异的电化学活性。p
‑
cof修饰ae后，p
‑
cof/ae的rct相比于裸ae的r
ct
增大到360.2ω，证实了p
‑
cof阻碍了电极/电解质界面处的电子转移。与某些常规的纳米材料或多孔有机骨架相比，本发明所用的p
‑
cof的rct值小，因此具有相对优越的电化学活性。
118.通过π
‑
π堆积、静电吸附、氢键或范德华力结合n58适配体后，apt/p
‑
cof/ae的rct进一步提高到828ω，这归因于适配体链中的负电性磷酸基团与电解液中的[fe(cn)6]3‑
/4
‑
离子之间的相互排斥作用，阻碍了电子转移。此外，绝缘的适配体层也阻碍了电子转移。
[0119]
当使用p
‑
cof基配适配体传感器在检测时间为50分钟的条件下检测浓度为0.01pg
·
ml
‑1的n
‑
gene溶液时，n
‑
gene/apt/p
‑
cof/ae的rct进一步增加到1.48kω。rct的增加归因于以下因素：(1)n
‑
gene和n58适配体之间形成的厚g
‑
四链体层覆盖了电化学活性较好的p
‑
cof；(2)具有更多负电荷的g
‑
四链体与电解液中的[fe(cn)6]3‑
/4
‑
离子之间的排斥力更高。上述两个方面共同阻碍了电极/电解质界面处的电子转移。用基于n58适配体的p
‑
cof基适配体传感器检测n
‑
gene时的显着变化的电化学信号表明本发明的p
‑
cof基的适配体传感器可用于n
‑
gene的检测。
[0120]
从图9中可以看出，与ae相比，p
‑
cof/ae、apt/p
‑
cof/ae和n
‑
gene/apt/p
‑
cof/ae的电极峰值电流密度不断减小，峰值电位差不断增大，这些结果与eis测试得到的结果一致。
[0121]
实验例4适配体传感器制备和检测条件的优化
[0122]
为了获得最佳的传感性能，对一些实验条件进行了优化，例如p
‑
cof悬浮液的浓度，n58适配体的浓度，apt/p
‑
cof/ae与n
‑
gene溶液的结合时间。由于rct的变化(δrct＝rct,after
‑
rct,before)与传感器上适配体链结合的n
‑
gene正相关，通过计算检测n
‑
gene前后的rct的变化获得的δrct值，用于说明p
‑
cof基适配体传感器对n
‑
gene检测的影响。
[0123]
使用不同浓度的p
‑
cof悬浮液制备p
‑
cof基生物传感器以及制备的p
‑
cof基适配体传感器检测n
‑
gene的δrct值如图10和图11所示。从图10和图11中可以看出，p
‑
cof/ae的δrct值(rct
p
‑
cof/ae
‑
rct
ae
)、apt/p
‑
cof/ae的δrct值(rct
apt/p
‑
cof/ae
‑
rct
p
‑
cof/ae
)以及n
‑
gene/apt/p
‑
cof/ae的δrct值(rct
n
‑
gene/apt/p
‑
cof/ae
‑
rct
apt/p
‑
cof/ae
)随p
‑
cof悬浮液的浓度的增加而增加，当p
‑
cof悬浮液的浓度大于1mg
·
ml
‑1时，p
‑
cof/ae的δrct值、apt/p
‑
cof/ae的δrct值以及n
‑
gene/apt/p
‑
cof/ae的δrct值均趋于稳定。因此，最佳的p
‑
cof悬浮液的浓度为1mg
·
ml
‑1。
[0124]
此外，锚定不同浓度的n58适配体溶液制备p
‑
cof基适配体传感器以及制备的p
‑
cof基适配体传感器检测n
‑
gene的δrct值的结果如图12和图13所示。从图12和图13中可以看出，p
‑
cof/ae的δrct值(rct
p
‑
cof/ae
‑
rct
ae
)、apt/p
‑
cof/ae的δrct值(rct
apt/p
‑
cof/ae
‑
rct
p
‑
cof/ae
)以及n
‑
gene/apt/p
‑
cof/ae的δrct值(rct
n
‑
gene/apt/p
‑
cof/ae
‑
rct
apt/p
‑
cof/ae
)均随着n58适配体浓度在1
‑
100nmol/l的范围内增加而升高。当n58适配体浓度大于100nmol/l后，p
‑
cof/ae的δrct值(rct
p
‑
cof/ae
‑
rct
ae
)、apt/p
‑
cof/ae的δrct值(rct
apt/p
‑
cof/ae
‑
rct
p
‑
cof/ae
)以及n
‑
gene/apt/p
‑
cof/ae的δrct值(rct
n
‑
gene/apt/p
‑
cof/ae
‑
rct
apt/p
‑
cof/ae
)均达到平衡，表明适配体链与n
‑
gene之间的结合相互作用已饱和。因此，n58适配体的最佳浓度为100nmol/l。
[0125]
最后，改变n
‑
gene溶液与p
‑
cof基适配体传感器(apt/p
‑
cof/ae)的结合时间(测试时间)，从0h开始，每隔0.1h进行一次检测，检测n
‑
gene得到的eis nquist曲线和δrct值的结果如图14和15所示，从图14中可以看出，n
‑
gene/apt/p
‑
cof/ae的δrct值(rct
n
‑
gene/apt/p
‑
cof/ae
‑
rct
apt/p
‑
cof/ae
)随结合时间的延长而增加。当结合时间大于50分钟后，n
‑
gene/apt/p
‑
cof/ae的δrct值达到平衡，表明此时n58适配体和n
‑
gene之间不再形成g
‑
四链体。因此，p
‑
cof基适配体传感器与n
‑
gene的最佳结合时间为50分钟，使用p
‑
cof基适配体传感器检测n
‑
gene溶液时，检测时间选择为50分钟即可。
[0126]
综上，制备p
‑
cof基适配体传感器和检测n
‑
gene的最佳条件为：p
‑
cof悬浮液的浓度为1mg
·
ml
‑1，n58适配体的浓度为100nmol/l，n
‑
gene与p
‑
cof基适配体传感器的结合时间为50分钟。
[0127]
实验例5适配体传感器的灵敏性
[0128]
为了进一步探查p
‑
cof基适配体传感器在最佳检测条件下的灵敏性，通过目标浓度滴定法推导了传感器的检测极限。具体而言，使用p
‑
cof基适配体传感器检测不同浓度(0.0001、0.001、0.01、0.1、1、10、100和1000pg
·
ml
‑1)的n
‑
gene，结果如图16、图17和图18所示。
[0129]
由图16和图17可知，随着n
‑
gene浓度的增加，电化学响应(rct)变化(δrct＝rct
n
‑
gene/apt/p
‑
cof/ae
‑
rct
apt/p
‑
cof/ae
)显著增加，表明形成越来越多的g
‑
四链体。当n
‑
gene浓度大于100pg
·
ml
‑1时，δrct达到平衡，表明n
‑
gene与n58适配体之间的结合达到饱和。将检测n
‑
gene前后的电化学响应变化(δrct＝rct
n
‑
gene/apt/p
‑
cof/ae
‑
rct
apt/p
‑
cof/ae
)与n
‑
gene浓度的对数之间的关系作图，结果如图18所示，经拟合得到线性回归方程δrct(kω)＝1.079+0.241log(n
‑
gene浓度)(pg
·
ml
‑1)，其相关系数(r2)为0.9955。因此，根据langmuir吸附方程，在0.0001
‑
1000pg
·
ml
‑1的n
‑
gene浓度范围内，信噪比s/n为3的lod为0.59fg
·
ml
‑1。
[0130]
与其他报道的用于检测n
‑
gene的适配体传感器相比，本发明的p
‑
cof基适配体传感器的lod极低。如前所述，p
‑
cof为二维平面结构，表面有大量
‑
c＝n
‑
，
‑
nh
‑
官能团，并且具有多孔的特征，比表面积大，能够吸附大量适配体，因此对n
‑
gene具有更强的吸附力，并且对适配体和n
‑
gene的亲和力强，从而可以灵敏地检测靶标。因此，p
‑
cof基适配体传感器用于n
‑
gene检测时具有较高的灵敏度。
[0131]
实验例6适配体传感器的选择性
[0132]
选择性是sars
‑
cov
‑
2rna分析的一大挑战，且对于准确检测靶标和避免假阳性现象至关重要。通过与其他种类的病毒(flua，flub，cpn和pi)、人血清中的蛋白质(bsa和igg)、水中的离子(k
+
，ca
2+
或na
+
)等干扰物进行比较，研究了实施例4制备的p
‑
cof基适配体适配体传感器对n
‑
gene检测的选择性，在检测时间为50分钟的条件下检测干扰物(1pg
·
ml
‑1)，n
‑
gene(0.01pg
·
ml
‑1)，n
‑
gene(0.01pg
·
ml
‑1)与干扰物(1pg
·
ml
‑1)的混合物所得的δrct值如图19所示。从图19中可以看出，p
‑
cof基适配体传感器检测干扰物时具有较小的δrct值，而检测n
‑
gene或n
‑
gene与干扰物的混合物时，具有较大的δrct响应，说明p
‑
cof基适配体传感器在检测n
‑
gene时具有高选择性。这是由于n
‑
gene与n58适配体之间的特异性相互作用引起的。因此，p
‑
cof可用于高选择性检测n
‑
gene。
[0133]
实验例7适配体传感器的重现性
[0134]
p
‑
cof基适配体传感器的重现性通过5个制备条件相同(与实施例4的适配体传感器的制备方法相同)的p
‑
cof基适配体传感器在检测时间为50分钟的条件下检测n
‑
gene(0.01pg
·
ml
‑1)获得的电化学响应结果来表示，结果如图20所示。由图20可知，电化学响应δrct几乎保持恒定，说明p
‑
cof基适配体传感器用于n
‑
gene检测时具有良好的重现性(rsd＝2.18％，n＝5)。
[0135]
实验例8适配体传感器的可再生性
[0136]
p
‑
cof基适配体传感器的再生能力通过0.1mol/l盐酸处理获得，重复使用0.1mol/l盐酸处理p
‑
cof基适配体传感器，在检测时间为50分钟的条件下通过检测n
‑
gene(0.01pg
·
ml
‑1)获得的δrct值来表示p
‑
cof基适配体传感器的可再生性，结果如图21所示。从图21可以看出，用制备的p
‑
cof适配体传感器检测n
‑
gene的δrct值为1098ω，然后将n
‑
gene/apt/p
‑
cof/ae浸入0.1mol/l盐酸中5分钟，再用磷酸缓冲溶液(pbs，0.01mol/l，ph＝7.4)漂洗，得到再生处理的适配体传感器，进行再生后，δrct值(再生处理前的n
‑
gene/apt/p
‑
cof/ae的rct与再生处理后的apt/p
‑
cof/ae的rct的差值)降至451.9ω，非常接近再生处理前的apt/p
‑
cof/ae检测n
‑
gene时的δrct值(rct
n
‑
gene/apt/p
‑
cof/ae
‑
rct
apt/p
‑
cof/ae
)，表明n
‑
gene已从g
‑
四联体中解离，从而适配体传感器的δrct恢复。当再次使用解离后的适配体传感器检测n
‑
gene时，δrct值增加到1188ω，表明apt/p
‑
cof/ae与n
‑
gene发生了结合。将上述整个过程重复进行，直到使用0.1mol/l盐酸处理后，δrct值无法恢复至451.9ω，一共重复进行了8次，表明本发明的p
‑
cof基适配体传感器在检测n
‑
gene时具有良好的可再生性。
[0137]
实验例9适配体传感器的稳定性
[0138]
p
‑
cof基适配体传感器的稳定性通过连续15天每天一次检测固定n
‑
gene(0.01pg
·
ml
‑1)后的传感器的电化学响应来测试，具体操作过程如下：第一天测试时，在检测时间为50分钟的条件下使用传感器检测n
‑
gene，得到传感器固定n
‑
gene前后的rct值，计算得到δr
ct
值，然后将电极放置于磷酸盐缓冲溶液(pbs，0.01mol/l，ph＝7.4)中，在4℃的冰箱中冷藏；第二天测试时，将电极直接拿出，在室温下进行测量，记录rct值，通过计算得到δr
ct
值(固定有n
‑
gene的传感器放置一天后测量获得的rct值与第一天测试时传感器固定n
‑
gene前的rct值的差值)，重复操作，直到第15天，最后得到15天检测n
‑
gene的δrct值，结果如图22所示。由图22可知，测试获得的δrct值保持稳定，回收率范围为108.7％，说明p
‑
cof基适配体传感器对n
‑
gene的固定作用较强，用于n
‑
gene检测时具有良好的稳定性。
[0139]
实验例10适配体传感器的实用性
[0140]
为验证p
‑
cof基新型冠状病毒核酸检测传感器的实用性，采用实施例4制备的p
‑
cof基适配体传感器对人血清、唾液、海水、冻虾等真实样品中的新型冠状病毒的n
‑
gene进行检测。真实样品的处理过程如下：
[0141]
(1)人血清取自北京索莱生物科技有限公司。使用前，使用3kda透析袋过滤，去除可能的干扰化合物，然后在室温下放置0.5小时，2000r
·
min
‑1离心10分钟，将分离得到的上清血清保存在
‑
20℃的环境中。
[0142]
(2)唾液采集于健康人，用磷酸盐缓冲溶液(pbs，0.01mol/l，ph＝7.4)稀释100倍，再用0.22μm的滤头过滤，收集上清供进一步使用。
[0143]
(3)海水(厦门附近海域的海水)采用0.22μm混合纤维素酯膜过滤后备用。
[0144]
(4)冻虾购自大张超市，捣碎研磨后置于离心管中，1000r
·
min
‑1离心5min后取上清液，过滤并用磷酸盐缓冲溶液(pbs，0.01mol/l，ph＝7.4)稀释100倍供进一步使用。
[0145]
分别在处理过的真实样品(人血清、唾液、海水、冻虾)中加入n
‑
gene，得到含有不同浓度(0.001、0.01、0.1、1、10、100和1000pg
·
ml
‑1)的n
‑
gene的4种真实样品的溶液，以评估本发明的p
‑
cof基适配体传感器的实用性，这种用于实际应用的验证方法通常用于其他种类的生物传感器中。首先利用实施例4制备的p
‑
cof基适配体传感器在检测时间为50分钟的条件下检测含有不同浓度(0.001、0.01、0.1、1、10、100和1000pg
·
ml
‑1)的n
‑
gene的4种真实样品的溶液，得到检测n
‑
gene的δr
ct
值，然后根据eis响应与n
‑
gene浓度的对数之间的校正曲线，计算检测获得的sars
‑
cov
‑
19的n
‑
gene浓度，并与实际值相比较。将实际值(真实样品中实际加入的n
‑
gene的浓度)，检测的n
‑
gene的浓度(检测量)，计算的回收率及rsd列于表1中。
[0146]
如表1所示，对于含n
‑
gene的人血清样品，p
‑
cof基配体传感器的回收率为97.1％
‑
108.9％，rsd小于4.55％；对于唾液样品，p
‑
cof基适配体传感器的回收率为96.6％
‑
110.4％，rsd小于3.682％；对于海水和冻虾样品，p
‑
cof基适配体传感器的回收率在95.1
‑
116.7％之间，rsd值小于4.442％。结果表明本发明的p
‑
cof基适配体传感器可以灵敏地检测存在于多种样品中的sars
‑
cov
‑
2的n
‑
gene，显示出巨大的应用潜力。
[0147]
表1适配体传感器的实用性测试结果
[0148]
[0149]