二甲基甘氨酸作为胎儿先天性心脏病血清标志物的应用

1.本发明涉及医学生物检测技术领域，具体涉及二甲基甘氨酸作为胎儿先天性心脏病血清标志物的应用。


背景技术：

2.先天性心脏病(chd)是最常见的先天性畸形，其是由遗传因素、环境因素或两者共同作用导致患者心脏血管发育异常所引起的疾病。据统计，每1000名活产儿中有8
‑
10人(0.8％
‑
1％)患有chd，而其在早产儿中发病率更高达8.3％，这些新生儿(50％
‑
60％)需终生服药并伴随着反复的手术治疗，给家庭及社会带来了沉重负担。
3.目前，胎儿的超声检查在chd的产前诊断中起着至关重要的作用，操作者不仅能够清晰的观察到胎儿的心脏形态结构，而且对孕妇及胎儿安全无创，但是由于操作者的经验、胎儿胎位、仪器探头频率等各种因素的影响，临床上常出现漏诊。磁共振成像检查(mri)可克服超声诊断视野小、软组织对比度较差的缺点，影像质量可不受羊水，骨骼和母体肥胖等因素影响。但是mri图像获取与实时成像存在时间差不能实时检查，也易受胎动的影响。
4.chd患者的畸形有时并不局限于心脏，很多伴随心脏以外的畸形，也有的伴随有遗传物质的改变，包括染色体畸变、单基因遗传缺陷、多基因遗传缺陷等，因此遗传学检查也尤为重要。染色体核型分析是诊断染色体数目异常和显微结构异常的经典遗传学检查技术，但该技术检测周期长、分辨率低、对操作人员的技术要求较高。染色体组拷贝数变异检测(cnv
‑
seq)技术，具有快速、准确、运行成本低等优点。但该技术不能检出单亲二体和三倍体。染色体微阵列分析(cma)具有高通量和高敏感性等优势，但其只能对已知位点进行检测分析，而且价格相对昂贵。
5.因此，早期产前诊断对于改善母亲和胎儿双方结局是至关重要的，其有助于提供最佳的围产期和围术期管理，减少产后发病率和死亡率。所以，为提高胎儿先天性心脏病的早期临床诊断的灵敏度和特异性，开发新的诊断产品势在必行。


技术实现要素：

6.本技术发现一种胎儿先天性心脏病早期诊断的生物标志物
‑
血清n,n
‑
二甲基甘氨酸，并基于该生物标志物开发胎儿先天性心脏病早期诊断的诊断产品，该诊断产品可解决胎儿先天性心脏病早期易误诊的问题。
7.基于发现n,n
‑
二甲基甘氨酸可作为胎儿先天性心脏病的早期诊断的血清标志物：
8.本技术提供一种二甲基甘氨酸作为胎儿先天性心脏病的诊断标志物在制备胎儿先天性心脏病诊断产品中的应用。
9.可选的，所述诊断产品为诊断试剂盒；所述诊断试剂盒中包含特异检测生物样品中二甲基甘氨酸的检测试剂。
10.进一步地，所述生物样品为受试者的血清。
11.本技术还提供一种用于体外检测血清中二甲基甘氨酸的试剂在制备胎儿先天性
心脏病诊断产品中的应用。
12.可选的，所述诊断产品为诊断试剂盒。
13.可选的，用于体外检测血清中二甲基甘氨酸的试剂包括分离色谱柱，标准品溶液和内标溶液和稀释液。
14.可选的，所述试剂基于色谱和质谱分离原理对血清中二甲基甘氨酸的含量水平进行检测。
15.本技术还提供一种二甲基甘氨酸作为胎儿先天性心脏病的药物靶点在制备治疗胎儿先天性心脏病的药物中的应用。
16.本技术还提供一种基于人血清中二甲基甘氨酸检测的胎儿先天性心脏病诊断试剂盒，所述二甲基甘氨酸诊断试剂盒包含特异性检测受试者血清中二甲基甘氨酸的检测试剂。
17.可选的，所述检测试剂包括：
18.(1)二甲基甘氨酸标准品；
19.(2)稀释液；
20.(3)内标溶液；
21.(4)洗脱液；
22.可选的，所述稀释液为乙腈溶液；所述内标溶液为甲酸铵稀释的同位素标记胆碱(choline
‑
d9)溶液；所述洗脱液的流动相a为含甲酸的甲酸铵溶液、流动相b为乙腈。
23.进一步地，所述乙腈溶液为质量分数80％的乙腈溶液和100％的乙腈溶液，；所述的甲酸铵稀释的同位素标记胆碱溶液中同位素标记胆碱的浓度为400～600ng/ml，甲酸铵的浓度为5～20mmol/l；所述流动相a含甲酸的甲酸铵溶液中，甲酸的质量百分含量为0.005％～0.02％，甲酸铵的浓度为5～20mmol/l，流动相b为乙腈。
24.最优选的，所述稀释液为质量分数80％的乙腈溶液和100％的乙腈溶液；所述内标溶液为甲酸铵稀释的同位素标记胆碱溶液，同位素标记胆碱的浓度为500ng/ml，甲酸铵的浓度为10mmol/l；所述洗脱液的流动相a为含0.01％甲酸的甲酸铵溶液、流动相b为乙腈。
25.所述检测试剂用于检测受试者血清中二甲基甘氨酸的量、浓度或存在；可选的，所述诊断试剂盒还包括用于盛装生物样品的容器。
26.本技术还提供一种血清中二甲基甘氨酸检测系统，包括：
27.标准曲线绘制模块，基于利用二甲基甘氨酸为标准品、同位素标记胆碱为内标，以二甲基甘氨酸和同位素标记胆碱的峰面积的比值为纵轴、二甲基甘氨酸的浓度为横轴绘制定量标准曲线；
28.分离模块，用于提取并洗脱来自受试者血清样本中的二甲基甘氨酸，并记录其峰面积；
29.计算模块，基于所述标准曲线绘制模块绘制出的标准曲线和分离模块记录的峰面积，计算所述受试者血清样本中二甲基甘氨酸的浓度。
30.可选的，所述分离装置包括hilic或c18色谱柱和超高效液相色谱仪串联质谱仪。
31.与现有技术相比，本技术具有如下效果：
32.本技术首次通过代谢组学筛选、鉴别并最终确证出血清中二甲基甘氨酸可作为胎儿先天性心脏病早期诊断的生物标志物，用于胎儿先天性心脏病的诊断，具有高灵敏度和
高特异性，同时具有检测成本低、重复性好的特点，并通过发现和验证的方式验证了血清中二甲基甘氨酸用于胎儿先天性心脏病的诊断的稳定性和可靠性，具有重要的临床开发应用价值。
附图说明
33.图1为经超声诊断且随访确证胎儿为chd的孕妇与健康胎儿孕妇的血清样本中二甲基甘氨酸的含量变化(均值
±
标准误表示)(图中chdp表示经超声诊断且随访确证胎儿为chd的孕妇，zcp表示健康胎儿孕妇)。
34.图2为二甲基甘氨酸用于经超声诊断且随访确证胎儿为chd的孕妇与健康胎儿孕妇的roc曲线图。
具体实施方式
35.下面将结合本技术实施例中的附图，对本技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本技术保护的范围。
36.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本技术的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本技术。
37.代谢组学是一门继基因组学，蛋白质组学和转录组学后的新兴学科，是一种以研究小分子代谢物为目的科学领域。由于小分子代谢物在体液中的存在相对稳定，因此通过代谢组学对一些内源性小分子代谢物进行分析已被广泛应用于疾病的早期诊断。本技术通过超高效液相色谱质谱联用的代谢组学方法检测血清中的代谢物，经过生物信息学分析，筛选出适用于胎儿先天性心脏病的早期诊断生物标志物。该方法检测快，重复性好，灵敏度高，成本低。本技术采用从发现到验证的策略筛选潜在的诊断标志物，成功的筛选出基于人血清二甲基甘氨酸的胎儿先天性心脏病早期诊断标志物，该诊断标志物的诊断灵敏度和特异性良好，且该诊断标志物的试剂盒还未见报道。
38.本技术发现二甲基甘氨酸可作为胎儿先天性心脏病早期诊断生物标志物的过程如下：
39.(1)利用超高效液相色谱仪串联质谱仪的代谢组学技术，对55例经超声诊断且随访胎儿为chd的孕妇(chdp组)与49例健康胎儿孕妇(zcp组)的血清进行了代谢组学指纹分析，发现chdp组患者血清中的胆碱代谢通路发生改变，并发现chdp组患者和zcp组患者血清中有4种代谢物具有显著性差异。
40.(2)使用数据统计软件spss，对上述4种代谢物进行roc分析(receiver operating characteristic curve)，筛选出对胎儿先天性心脏病诊断性能最佳的代谢物，并对其灵敏度和特异性进行评价。如图2所示显示实验组中二甲基甘氨酸用于鉴别诊断zcp组患者和chdp组患者的roc曲线，最终确定二甲基甘氨酸对于诊断胎儿先天性心脏病有着最佳的诊断性能，其auroc为0.883，当截断值为42.3ug/ml时，其灵敏度和特异性分别为76.00％和93.00％，即当患者血清中二甲基甘氨酸含量低于42.3ug/ml时，可诊断为胎儿先天性心脏
病。
41.基于该发现：
42.本技术提供：一种血清二甲基甘氨酸作为胎儿先天性心脏病的诊断标志物在制备胎儿先天性心脏病诊断产品中的应用；一种用于体外检测血清中二甲基甘氨酸的试剂在制备胎儿先天性心脏病诊断产品中的应用；一种二甲基甘氨酸作为胎儿先天性心脏病的药物靶点在制备治疗胎儿先天性心脏病的药物中的应用；一种胎儿先天性心脏病诊断试剂盒；以及一种血清中二甲基甘氨酸的检测系统。
43.诊断产品可以为试剂、试纸、试剂盒等，优选地，所述诊断产品为诊断试剂盒，诊断试剂盒中包含特异检测生物样品中二甲基甘氨酸浓度水平的检测试剂。诊断产品的检测样品为受试者的血清。
44.作为胎儿先天性心脏病诊断试剂盒的一种实施方式，所述胎儿先天性心脏病诊断试剂盒包括：
45.(1)二甲基甘氨酸标准品；
46.(2)稀释液；
47.(3)内标溶液；
48.(4)洗脱液。
49.二甲基甘氨酸标准品用于血清中二甲基甘氨酸的定性分析和标准曲线的绘制。二甲基甘氨酸标准品在质谱mrm模式下的母离子及其主要碎片离子质量数分别为104.10和58.07。
50.稀释液用于预处理来自受试者的血清样本的提取液和标准品，可选择纯乙腈溶液和80％的乙腈溶液。
51.内标溶液可选择甲酸铵稀释的同位素标记胆碱(choline
‑
d9)溶液，甲酸铵的浓度为10mmol，同位素标记胆碱的终浓度为500ng/ml，质谱srm或mrm模式下进行定量分析，质谱mrm模式下的母离子及其主要碎片离子质量数分别为113.16和69.13。
52.洗脱液用于洗脱色谱柱，流动相a可选择含0.01％甲酸的甲酸铵溶液，流动相b可选择乙腈。色谱柱可选用c18或hilic色谱柱。
53.本技术的试剂盒可应用于超高效液相色谱仪串联质谱仪，还可以同时检测胆碱、肉碱、乙酰胆碱、二甲基甘氨酸等其他胆碱类相关代谢物，可以更为全面的分析胎儿先天性心脏病孕妇的胆碱代谢异常。采用血清样本测试本发明的应用效果。采用患有胎儿chd的孕妇和健康胎儿的孕妇的血清样本，使用血清中二甲基甘氨酸为诊断标准，可以很好的将两组患者区分。
54.具体来说，采用本技术的试剂盒检测受试者的血清样本中二甲基甘氨酸的一种方法包括以下步骤：
55.(1)利用二甲基甘氨酸作为标准品，内标为同位素标记的胆碱(choline
‑
d9)，再加入乙腈溶液，直接进样检测，绘制相对应的定量标准曲线；
56.(2)来自受试者的血清样本预处理：室温解冻血清样本，取50μl血清加入30μl同位素标记的胆碱(choline
‑
d9)(内标溶液)、30μl 80％的乙腈和340μl乙腈，剧烈涡旋混合，超声后于12000g离心10.0min，取200.0μl上清液于自动进样瓶用于血清中二甲基甘氨酸的检测。记录所述血清样本中二甲基甘氨酸的洗脱峰面积和内标峰峰面积的比值。
57.(3)根据步骤(1)的定量标准曲线和步骤(2)中峰面积的比值，计算所述受试者的血清样本中二甲基甘氨酸的含量。
58.该诊断试剂盒检测孕妇(胎儿chd的孕妇和健康胎儿孕妇)血清中二甲基甘氨酸的含量，并以42.3ug/ml截断值，当患者血清中二甲基甘氨酸的含量低于42.3ug/ml时，诊断患有胎儿先天性心脏病。
59.作为血清中二甲基甘氨酸的检测系统的一种实施方式，包括：
60.标准曲线绘制模块，基于利用二甲基甘氨酸为标准品、同位素标记胆碱(choline
‑
d9)为内标，以二甲基甘氨酸和同位素标记胆碱的峰面积的比值为纵轴、二甲基甘氨酸的浓度为横轴绘制定量标准曲线；
61.分离模块，用于提取并洗脱来自受试者血清样本中的二甲基甘氨酸，并记录其峰面积；
62.计算模块，基于所述标准曲线绘制模块绘制出的标准曲线和分离模块记录的峰面积，计算所述受试者血清样本中二甲基甘氨酸的浓度。
63.可选的，所述检测系统还包括显示模块，用于显示来自计算模块的二甲基甘氨酸的浓度。
64.诊断系统所包括的装置：采用美国waters公司的uplc色谱仪联合xevo g2
‑
xs qtof质谱仪在多重反应监测模式(mrm)下对代谢物进行检测，色谱柱为美国merck公司的sequant zic
‑
hilic亲水色谱柱(3.5μm,2.1
×
150mm)，电喷雾离子源采用正离子。
65.以下以具体实施例进行说明，以下实施例中采用百分比限定的浓度如无特殊说明均指质量百分比浓度。
66.实施例1：
67.1.血清样本收集
68.采集前，取得纳入本研究的所有受试者所签署的知情同意书。
69.本研究的104例血清样本来自于嘉兴市妇幼保健院和江西省妇幼保健院，其中包括55例经超声诊断且随访确证胎儿为chd的孕妇(chdp组)与49例健康胎儿孕妇(zcp组)。
70.纳入标准：
①
单胎妊娠；
②
b超检查资料完整，经随访胎儿出生或引产确证为chd；
③
孕妇或其家属签署知情同意书；
④
孕妇年龄20～40岁、妊娠中期妊娠(20
‑
24周)。
71.排除标准：
①
不能按照规定时间体检或不配合随访；
②
胎儿合并其他部位畸形；
③
孕妇有心、脑、肝、肾等器官严重疾病；
④
孕妇有阴道大出血、急性胎儿宫内窘迫、胎儿死亡，双胎及多胎妊娠等；
⑤
妊娠期糖尿病、妊娠期高血压疾病等妊娠合并症或并发症孕妇。
72.为消除饮食干扰，所有孕妇于早上空腹采集血样并于4℃冰箱静置2小时，以4000r，15min对血样进行离心，收集血清分装保存于
‑
80℃冰箱，用时室温解冻。本项研究已经获得嘉兴市妇幼保健院伦理委员会的批准(no.2020
‑
5)，并取得患者知情同意。
73.2.分析方法
74.2.1标准曲线的绘制
75.称取一定量的二甲基甘氨酸用蒸馏水溶解至一定浓度作为母液，4℃保存备用。将母液用蒸馏水依次进行2倍稀释并涡旋混匀作为不同梯度的二甲基甘氨酸标准品溶液。将50μl不同浓度的二甲基甘氨酸标准品溶液和30μl同位素标记的胆碱(choline
‑
d9为内标)、30μl 80％的乙腈、340μl乙腈依次加入ep管中，剧烈涡旋混合，超声后于12000g离心
10.0min，取200.0μl上清液于自动进样瓶用于标准曲线的绘制。
76.2.2血清样本预处理
77.室温解冻血清样本，将50μl血清和30μl同位素标记的胆碱溶液(choline
‑
d9为内标)、30μl 80％的乙腈、340μl乙腈依次加入ep管中，剧烈涡旋混合沉淀蛋白，超声后于12000g离心10.0min，取200.0μl上清液于自动进样瓶用于血清中二甲基甘氨酸的检测。
78.2.3超高效液相色谱仪串联质谱仪分析
79.(1)液相条件：色谱仪为waters超高效液相色谱；美国merck公司的sequant zic
‑
hilic亲水色谱柱(3.5μm,2.1
×
150mm)；流动相组成为：含0.01％甲酸的10.0mmol/l甲酸铵水溶液(a)
‑
乙腈(b)；流速为0.3ml/min，进样体积为4.0μl；分离时间为8.0min；采用以下梯度洗脱：0～2.0min，10％a；2.0
‑
4.0min，10％～70％a；4.0min～5.0min，70％a；5.0min～5.5min，70％～10％a；5.5min～8min，10％a；色谱柱温度设置为45℃，自动进样器温度设置为8℃。
80.(2)质谱条件：质谱仪为xevo qtof(waters，us)，在多重反应监测模式(mrm)下对代谢物进行检测，电喷雾离子源采用正离子检测；电喷雾毛细管电压设定为3.0kv，氮气用作溶剂蒸发的干燥气体，流速为50l/h；离子源温度为100℃。
81.2.4血清检测结果
82.以标准品浓度为横坐标，标准品峰面积和内标峰面积的比值为纵坐标，绘制出标准曲线；将血清样本中二甲基甘氨酸的检测结果代入标准曲线，最终得到各样本中二甲基甘氨酸的含量。其血清检测结果如图1所示。结果发现，相对于zcp组患者，chdp组患者血清中二甲基甘氨酸的含量大幅度下降。当截断值为42.3ug/ml时，其灵敏度和特异性分别为76.00％和93.00％，其区分两组患者的准确度为79.6％，假阳性率为7.00％。即当患者血清中二甲基甘氨酸含量低于42.3ug/ml时，可诊断为胎儿先天性心脏病。
83.以上所述实施例仅表达了本技术的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本技术构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本技术的保护范围。因此，本技术专利的保护范围应以所附权利要求为准。