一种新型免疫荧光信号放大技术标记方法与流程

1.本发明涉及生物医药应用技术领域，具体涉及一种新型免疫荧光信号放大技术标记方法。


背景技术：

2.免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。免疫组化技术近年来得到迅速发展。
3.传统免疫组织化学一般采用生物素
‑
亲和素法，多聚增强的dab两步或者一步法等。生物素
‑
亲和素法(又称抗生物素)系统(biotinavidin system,bas)标记抗体的技术是20世纪70年代后期发展起来的一种新的免疫检测方法，由于亲和素与生物素间的亲和力极强，结合迅速，且极其稳定，生物素标记抗体和酶的标记率高，又不影响蛋白的活性，使bas标记技术比常规酶联免疫、放射免疫及荧光免疫技术有着更高的灵敏度，为微量抗原、抗体的检测开辟了新的途径。一步法是将酶等标记物直接标记在特异性的第一抗体上，然后用该被标记的第一抗体与组织细胞中的抗原结合即可以用显色剂显色。二部法是将酶标记物标记在第二抗体或第三抗体(复合物)上，其方法是先将特异性第一抗体与组织细胞中的抗原结合，再将酶标记的第二抗体与第一抗体结合，然后用显色剂显色。
4.传统免疫组织化学所用标记方法一般有点击化学，酪胺信号放大技术等。点击化学就是利用碳
‑
杂原子成键反应快速实现分子多样性，一般由叠氮化物(azide)和炔烃(alkyne)作用形共价键，具有高效稳定，高特异性等优点。反应不受ph影响，能在常温条件下的水中进行,甚至能在活细胞中进行，已被广泛用于药物筛选、药物开发、聚合及其它生物体外和体内分析。酪胺信号放大技术(tsa)基于信号分子沉淀原理，在h2o2存在时，通过探针固定的辣根过氧化物酶将标记的底物酪胺转化为具有短暂活性的中间状态，然后被激活的底物分子迅速与相接蛋白分子的富含电子区域(酪氨酸残基)进行稳定的共价结合；由于相接蛋白(抗原、hrp等)都含有大量的酪氨酸结合位点，所以会富集大量信号，使信号被有效放大。
5.以上方法都只是单一的某一种放大方法，放大效果存在一定局限性，传统免疫组化方法会要求第一抗体是不同来源或者第一抗体的表达检测效果很差或者呈现阴性结果，单独的tsa信号放大技术遇到弱表达蛋白质需要反复三轮以上的放大，费时耗力，同时易形成非特异性背景染色或者高背景、待检组织本身自发荧光干扰检测结果等缺点；尤其对于弱表达蛋白质靶点检测放大效果不理想，亟待解决。


技术实现要素：

6.为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种新型免疫荧光信号放大技术
标记方法，结合了tsa信号放大技术和点击化学放大技术两者的优点，在一种检测方法中只需要两步信号放大即可实现对单个或者多个待检靶蛋白进行检测，信号强度和灵敏度同比信号放大轮数远远高于优于传统的免疫组化方法或者单一免疫组化的新型的信号放大技术，可以极大程度减少非特着色和显著降低了背景，对于荧光染色观测时的曝光值甚至可以降低到几十微秒的时间，同时对组织本底的自发荧光可以通过显著降低曝光值屏蔽掉自发荧光，基本上可以避免掉绝大部分的自发荧光对检测结果的干扰，特别是对于弱表达蛋白质靶点检测具有优秀性能。为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
7.一种新型免疫荧光信号放大技术标记方法，其特征在于包括如下步骤：
8.s1.石蜡切片脱蜡，脱蜡后置于水中准备修复；
9.s2.抗原修复：根据不同组织不同抗体选择适合的修复方式进行抗原修复；
10.s3.阻断内源性过氧化物酶：配置好适量3％h2o2，将修复冷却好的切片置于放入3％h2o2浸泡10
‑
30min，去除内源性过氧化物酶，然后取出切片，将切片置于缓冲液内浸泡冲洗三次，每次3
‑
7min；
11.s4.封闭：用组化笔在组织周围画好圈，避免画到组织或避免画得太近引起边缘效应，画好圈的切片应置于加过吐温的缓冲液中浸泡，后配置与第二抗体来源一致的血清进行封闭，不洗；
12.s5.加第一种第一抗体：取出组织载玻片，甩掉切片上血清，置于湿盒中，将第一抗体滴加到组织上并完全覆盖，根据抗体稀释比例用缓冲液稀释抗体，阴性对照组织加抗体稀释液代替第一抗体，37℃孵育1
‑
2h，或4℃孵育8
‑
12h；
13.s6.复温：步骤s5采用4℃孵育8
‑
12h时需用此步，将湿盒从冰箱取出，分散依次摊开进行复温，计时10
‑
30min后用缓冲液冲洗，后将切片置于铁架上，用自来水冲洗切片2
‑
3次后，将切片置于加过吐温20的缓冲液中浸泡冲洗3次，每次3
‑
7min；
14.s7.加hrp标记的第二抗体：擦干组织周围缓冲液，滴加第二抗体后室温孵育25
‑
35min，后用缓冲液洗3次，每次3
‑
7min；
15.s8.信号放大：滴加tsa
‑
alkyne试剂，完全覆盖待检组织，进行第一轮信号放大，反应时间需要5
‑
15min，缓冲液浸泡冲洗3次,每次3
‑
7min。滴加第一azide
‑
示踪标记物和tsa
‑
alkyne试剂，完全覆盖待检组织，进行信号放大，反应时间需要5
‑
15min；
16.s9.洗片子：缓冲液洗3次，每次3
‑
7min；
17.s10.重复2
‑
9步骤，做第二种第一抗体，具体地，重复s8步骤时，滴加第二azide
‑
示踪标记物，该示踪标记物(荧光素)可根据需要选择不同显色颜色的荧光素；
18.s11.复染dapi：滴加dapi染液染色10min，缓冲液充分冲洗冲洗3次,每次3
‑
7min；
19.s12.封片采图：滴加防荧光淬灭剂封片，在荧光显微镜或者数字切片扫描仪下观察并摄像。
20.s13.以此类推：可以重复2
‑
9步骤做第三种、第四种、第五种乃至第六种、第七种抗体，理论上可以做八种以上的抗体。
21.进一步地，所述石蜡切片脱蜡步骤为：将组织载玻片依次放入透明剂10min、透明剂10min、透明剂10min、无水乙醇5min、95％乙醇5min、75％乙醇5min,后用自来水冲洗干净。
22.进一步地，所述步骤s2还包括修复液，所述抗原修复方式包括高温高压修复或酶
修复，所述修复液为抗原修复液或酶修复液。
23.进一步地，所述抗原修复液为ph5.0
‑
7.0柠檬酸或者ph8.0
‑
9.0 edta。
24.进一步地，所述步骤s2中抗原修复使用高温高压修复，其步骤为：在高压锅中加入抗原修复液柠檬酸，将脱蜡水化后的组织切片放入高压锅的缓冲液中，高压锅喷气后计时，然后停火；冷水冲淋高压锅，气压下降后打开锅盖，待修复液自然冷却至室温后，将切片从修复液中取出，用缓冲液冲洗3次，每次3
‑
7min。
25.进一步地，所述步骤s2中抗原修复使用高温高压修复，其步骤为：在高压锅中加入抗原修复液ph8.0 edta，将脱蜡水化后的组织切片放入高压锅的缓冲液中，高压锅喷气后计时，然后停火；冷水冲淋高压锅，气压下降后打开锅盖，待修复液自然冷却至室温后，将切片从修复液中取出，用缓冲液冲洗3次，每次3
‑
7min。
26.进一步地，所述步骤s2中，使用柠檬酸修复液时，高压锅喷气后计时时间为1
‑
3min；使用ph8.0 edta修复液时，高压锅喷气后计时时间为1
‑
2min。
27.进一步地，所述步骤s2中抗原修复使用酶修复，具体步骤为：将切片用组化笔在组织周围画好圈后，再将配置好的酶修复液滴加到组织上并完全覆盖组织，将切片依次摆放在湿盒内，湿盒中装有适量水和甘油，置于温箱37℃10
‑
30min。
28.进一步地，所述缓冲液为ph5.0
‑
7.0 pbs缓冲液或者加入了少量吐温20的ph5.0
‑
7.0 pbst缓冲液，所述酶修复液为胃蛋白酶液或者胰蛋白酶液，所述荧光标记试剂包括azide
‑
fitc或者cy3或者cy5。
29.进一步地，在石蜡切片脱蜡步骤之前，还包括步骤s0：烤片。
30.与现有技术相比，本发明具有的有益效果是：
31.结合了点击化学和tsa信号放大法，发挥了两种方法的优势，先使用tsa
‑
alkyne标记第二抗体，进行一步tsa放大，后加入azide
‑
fitc/cy3/cy5等荧光标记及tsa
‑
alkyne试剂，tsa
‑
alkyne试剂的乙炔基团和azide
‑
fitc/cy3/cy5等荧光标记中的叠氮基团能发生点击化学反应，使两种试剂发生结合，从而利用点击化学再次放大，产生大量的可标记结合部位，表达信号被成倍放大，还根据实验需要可以进行多轮循环放大。用tsa
‑
alkyne试剂和azide
‑
fitc/cy3/cy5等荧光标记试剂(不限于这三种)的结合代替了生物素
‑
亲和素放大方法，不会给切片组织带来更多的背景，从而影响标记检测效果，尤其对于弱表达蛋白质靶点具有优秀的检测效果。总之，tsa法与点击化学放大信号的结合，检测信号可成倍放大，使信号更灵敏，曝光时间更短，可有效避免非特异性背景染色问题，实现更高效的免疫组织化学检测分析。
附图说明
32.图1
‑
9为普通荧光标记法fitc，cy3，cy5单标染色结果图；
33.图1为人胃癌组织cd31，常规方法免疫荧光染色,稀释浓度为第一抗体：缓冲液＝1：1000，荧光素fitc，50ms曝光，看不见清晰的荧光信号；
34.图2为人肾癌组织cd31常规方法免疫荧光染色,稀释浓度为第一抗体：缓冲液＝1：1000，荧光素fitc，50ms曝光，看不见清晰的荧光信号；
35.图3为人肝癌组织cd31常规方法免疫荧光染色,稀释浓度为第一抗体：缓冲液＝1：1000，荧光素fitc，50ms曝光，看不见清晰的荧光信号；
36.图4为人肾癌组织ki67常规方法免疫荧光染色，稀释浓度为第一抗体：缓冲液＝1：200，荧光素cy3，50ms曝光，看不见清晰的荧光信号；
37.图5为人肝癌组织ki67常规方法免疫荧光染色，稀释浓度为第一抗体：缓冲液＝1：200，荧光素cy3，50ms曝光，看不见清晰的荧光信号；
38.图6为人胃癌组织ki67常规方法免疫荧光染色，稀释浓度为第一抗体：缓冲液＝1：200，荧光素cy3，50ms曝光，看不见清晰的荧光信号；
39.图7为人肝癌组织vimentin常规方法免疫荧光染色，稀释浓度为第一抗体：缓冲液＝1：200，荧光素cy5，20ms曝光，看不见清晰的荧光信号；
40.图8为人胃癌组织vimentin,常规方法免疫荧光染色，稀释浓度为第一抗体：缓冲液＝1：200，荧光素cy5，20ms曝光，看不见清晰的荧光信号；
41.图9为人胃癌组织ki67常规方法免疫荧光染色，稀释浓度为第一抗体：缓冲液＝1：200，荧光素cy5，20ms曝光，看不见清晰的荧光信号；
42.图10
‑
18为本发明新型信号放大荧光标记法cy3，cy5，fitc单标染色结果图；
43.图10为人肝癌组织ki67新型放大方法免疫荧光染色,稀释浓度为第一抗体：缓冲液＝1：2000，荧光素cy3，50ms曝光，看见清晰的荧光信号，背景干净；
44.图11为人肝癌组织ki67新型放大方法免疫荧光染色,稀释浓度为第一抗体：缓冲液＝1：2000，荧光素cy3，100ms曝光，看见清晰的荧光信号，背景干净；
45.图12为人胃癌组织ki67新型放大方法免疫荧光染色,稀释浓度为第一抗体：缓冲液＝1：2000，荧光素cy3，50ms曝光，看见清晰的荧光信号，背景干净；
46.图13为人胃癌组织ki67新型放大方法免疫荧光染色,稀释浓度为第一抗体：缓冲液＝1：2000，荧光素cy3，100ms曝光，看见清晰的荧光信号，背景干净；
47.图14为人肾癌组织ki67新型放大方法免疫荧光染色,稀释浓度为第一抗体：缓冲液＝1：2000，荧光素cy3，50ms曝光，看见清晰的荧光信号，背景干净；
48.图15为人肾癌组织ki67新型放大方法免疫荧光染色,稀释浓度为第一抗体：缓冲液＝1：2000，荧光素cy3，100ms曝光，看见清晰的荧光信号，背景干净；
49.图16为人肝癌组织vimentin新型放大方法免疫荧光染色,稀释浓度为第一抗体：缓冲液＝1：4000，荧光素cy5，40ms曝光，看见清晰的荧光信号，背景干净；
50.图17为人胃癌组织vimentin新型放大方法免疫荧光染色,稀释浓度为第一抗体：缓冲液＝1：4000，荧光素cy5，40ms曝光，看见清晰的荧光信号，背景干净；
51.图18为人肾癌组织vimentin新型放大方法免疫荧光染色,稀释浓度为第一抗体：缓冲液＝1：4000，荧光素cy5，40ms曝光，看见清晰的荧光信号，背景干净；
52.图19为人肝癌组织cd31新型放大方法免疫荧光染色,稀释浓度为第一抗体：缓冲液＝1：8000，荧光素fitc，20ms曝光，看见清晰的荧光信号，背景干净；
53.图20为人肝癌组织cd31新型放大方法免疫荧光染色,稀释浓度为第一抗体：缓冲液＝1：8000，荧光素fitc，50ms曝光，看见清晰的荧光信号，背景干净；
54.图21为人肾癌组织cd31新型放大方法免疫荧光染色,稀释浓度为第一抗体：缓冲液＝1：8000，荧光素fitc，20ms曝光，看见清晰的荧光信号，背景干净；
55.图22为人肾癌组织cd31新型放大方法免疫荧光染色,稀释浓度为第一抗体：缓冲液＝1：8000，荧光素fitc，50ms曝光，看见清晰的荧光信号，背景干净；
56.图23为人胃癌组织cd31新型放大方法免疫荧光染色,稀释浓度为第一抗体：缓冲液＝1：8000，荧光素fitc，20ms曝光，看见清晰的荧光信号，背景干净；
57.图24为人胃癌组织cd31新型放大方法免疫荧光染色,稀释浓度为第一抗体：缓冲液＝1：8000，荧光素fitc，50ms曝光，看见清晰的荧光信号，背景干净；
58.图25为小鼠肺组织横切，使用新型放大方法进行三种同来源第一抗体同时荧光染色，cd4 fitc(绿色)浓度1：8000，曝光时间10ms；cd8 cy3(红色)浓度1：5000，曝光时间15ms；foxp3 cy5(灰白色)，浓度1：1000，曝光时间8ms,采图倍数36.4倍(荧光病理切片扫描仪3dhistech)；其中浓度定义为第一抗体：缓冲液；
59.图中25
‑
1为绿色荧光，25
‑
2为红色荧光，25
‑
3为灰白色荧光；
60.图26为小鼠肿瘤组织横切，使用新型放大方法进行三种同来源第一抗体同时荧光染色，cd4 fitc(绿色)浓度1：8000，曝光时间10ms；cd8 cy3(红色)浓度1：5000，曝光时间15ms；foxp3 cy5(灰白色)，浓度1：1000，曝光时间8ms,采图倍数36.4倍(荧光病理切片扫描仪3dhistech)；其中浓度定义为第一抗体：缓冲液；
61.图中26
‑
1为绿色荧光，26
‑
2为红色荧光，26
‑
3为灰白色荧光。
具体实施方式
62.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，多属于本发明保护的范围。
63.实施例1
64.一种新型免疫荧光信号放大技术标记方法，包括如下步骤：
65.s0.烤片：将组织载玻片置于烤片机中，设定温度58℃，时间2小时。
66.s1.脱蜡：将组织载玻片依次放入透明剂10min，透明剂10min，透明剂10min，无水乙醇i 5min，95％乙醇5min，75％乙醇5min，然后用自来水冲洗干净，置于水中准备修复。
67.s2.抗原修复：在高压锅中加入抗原修复液ph5.0的柠檬酸，另一实施例中为ph6.0的柠檬酸，再另一实施例中为ph7.0的柠檬酸；将脱蜡水化后的组织切片放入高压锅的缓冲液ph5.0 pbs中，另一实施例中为ph6.0 pbs，再另一实施例中为ph7.0 pbs；高压锅喷气后计时2min，停火；冷水冲淋高压锅，气压下降后打开锅盖，待修复液自然冷却至室温后，将切片从修复液ph5.0的柠檬酸中取出，用缓冲液ph5.0 pbs浸泡冲洗3次，每次5min，另一实施例中为3min，再另一实施例中为7min，。
68.s3.阻断内源性过氧化物酶：配置好适量3％的h2o2，将修复冷却好的切片置于3％h2o2浸泡30min，去除内源性过氧化物酶，然后取出切片，将切片置于缓冲液ph5.0 pbs内浸泡冲洗3次，每次3min。
69.s4.封闭：用组化笔在组织周围画好圈，避免画到组织或避免画得太近引起边缘效应。画好圈的切片置于加过吐温20的ph5.0 pbst中浸泡，然后配置与第二抗体来源一致的血清进行封闭，以减少背景染色，此步骤不冲洗。
70.s5.加第一种第一抗体：取出组织载玻片，甩掉切片上血清，置于湿盒中，将第一抗体滴加到组织上并完全覆盖，根据抗体稀释比例用缓冲液ph5.0 pbs稀释抗体，阴性对照组
织加抗体稀释液代替第一抗体，37℃孵育1h。
71.s6.滴加带有hrp标记的第二抗体，擦干组织周围pbs，滴加第二抗体后室温孵育30min，然后用ph5.0 pbs冲洗3次，每次3min。
72.s7.信号放大：滴加tsa
‑
alkyne试剂，完全覆盖待检组织(第一轮信号放大，反应时间需要5min)，ph5.0 pbs浸泡冲洗3次，每次3min；滴加azide
‑
fitc/cy3/cy5荧光标记试剂中的一种和tsa
‑
alkyne试剂，进行第二轮信号放大，反应时间需要5min。
73.s8.洗片子：ph5.0 pbs冲洗3次，每次3min。
74.s9.复染dapi：滴加dapi染液染色10min，ph5.0 pbs缓冲液充分冲洗冲洗3次,每次3min。
75.s10.封片采图：滴加防荧光淬灭剂封片，在荧光显微镜或者数字切片扫描仪下观察并摄像。
76.实施例2
77.一种新型免疫荧光信号放大技术标记方法，包括如下步骤：
78.s0.烤片：将组织载玻片置于烤片机中，设定温度60℃，时间1.5小时。
79.s1.脱蜡：将组织载玻片依次放入透明剂10min，透明剂10min，透明剂10min，无水乙醇i 5min，95％乙醇5min，75％乙醇5min，然后用自来水冲洗干净，置于水中准备修复。
80.s2.抗原修复：在高压锅中加入抗原修复液ph8.0 edta，另一实施例为ph9.0 edta；将脱蜡水化后的组织切片放入高压锅的缓冲液ph5.0 pbs中，高压锅喷气后计时2min，停火；冷水冲淋高压锅，气压下降后打开锅盖，待修复液自然冷却至室温后，将切片从修复液ph8.0 edta中取出，用缓冲液ph5.0 pbs浸泡冲洗3次，每次5min。
81.s3.阻断内源性过氧化物酶：配置好适量3％的h2o2，将修复冷却好的切片置于3％h2o2浸泡30min，去除内源性过氧化物酶，然后取出切片，将切片置于缓冲液ph5.0 pbs内浸泡冲洗3次，每次5min。
82.s4.封闭：用组化笔在组织周围画好圈，避免画到组织或避免画得太近引起边缘效应。画好圈的切片置于加过吐温20的ph5.0 pbst中浸泡，然后配置与第二抗体来源一致的血清进行封闭，以减少背景染色，此步骤不冲洗。
83.s5.加抗体：取出组织载玻片，甩掉切片上血清，置于湿盒中，将第一抗体滴加到组织上并完全覆盖，根据抗体稀释比例用缓冲液ph5.0 pbs稀释抗体，阴性对照组织加抗体稀释液代替第一抗体，4℃孵育12h。
84.s6.复温：将湿盒从冰箱取出，分散依次摊开进行复温，计时15min后用ph5.0 pbs冲洗，后将切片置于铁架上，用自来水冲洗切片3次后，将切片置于加过的吐温20的ph5.0 pbst中浸泡冲洗3次，每次5min。
85.s7.滴加带有hrp标记的第二抗体，擦干组织周围pbs，滴加第二抗体后室温孵育25min，然后用ph5.0 pbs冲洗3次，每次5min。
86.s8.信号放大：滴加tsa
‑
alkyne试剂，完全覆盖待检组织(第一轮信号放大，反应时间需要10min)，ph5.0 pbs浸泡冲洗3次，每次5min；滴加azide
‑
fitc荧光标记试剂(也可以称第一azide
‑
示踪标记物)和tsa
‑
alkyne试剂(进行第二轮信号放大，反应时间需要10min)。
87.s9.洗片子：ph5.0 pbs冲洗3次，每次3min。
88.s10.重复2
‑
9步骤，做第二种抗体；具体地，重复s8步骤时，第二种抗体检测的信号放大：滴加tsa
‑
alkyne试剂，完全覆盖待检组织(第一轮信号放大，反应时间需要10min)，用ph5.0 pbs浸泡冲洗3次，每次5min；滴加azide
‑
cy3荧光标记试剂(也可以称第二azide
‑
示踪标记物)和tsa
‑
alkyne试剂(进行第二轮信号放大，反应时间需要10min)，用ph5.0 pbst浸泡冲洗3次，每次5min。
89.s11.重复2
‑
9步骤，做第三种抗体；具体地，重复s8步骤时，第三种抗体检测的信号放大：滴加tsa
‑
alkyne试剂，完全覆盖待检组织(第一轮信号放大，反应时间需要10min)，用ph5.0 pbs浸泡冲洗3次，每次5min；滴加azide
‑
cy5荧光标记试剂(也可以称第三azide
‑
示踪标记物)和tsa
‑
alkyne试剂(进行第二轮信号放大，反应时间需要10min)，用ph5.0 pbst浸泡冲洗3次，每次5min。
90.s12.复染dapi：滴加dapi染液染色10min，ph5.0 pbs缓冲液充分冲洗冲洗3次,每次3
‑
7min。
91.s13.封片采图：滴加防荧光淬灭剂封片，在荧光显微镜或者数字切片扫描仪下观察并摄像。
92.本发明实施例可选用的组织切片有：人肝癌组织，人肾癌，人胃癌组织，小鼠的肺组织、肿瘤组织，包括但不限于此；可选用第一抗体有cd31、ki67、vimentin、cd4、cd8、foxp3。
93.普通荧光标记(现有技术)的第一抗体稀释浓度和本发明的alk
‑
tsa放大技术荧光标记的第一抗体稀释浓度对比示例，如表1所示：
94.表1
[0095][0096]
缓冲液为ph5.0
‑
7.0的pbs或pbst。
[0097]
普通荧光标记常规第一抗体效价一般在1：50
‑
500范围内，本方法经过放大后，第一抗体稀释了几倍甚至10倍以上，可以节省昂贵的科研抗体，极大降低了抗体的使用成本，并且本发明方法中虽然抗体经过稀释，但仍然可以达到相应的检测效果，乃至超过普通荧光标记的效果，甚至更好的效果，亮度要高一些。
[0098]
本发明还提供点击化学试剂配比示例，如表2所示：
[0099]
表2
[0100][0101][0102]
从上到下依次按照顺序加入试剂，现配现用，并加入孵育液，混匀室温放置20min。